Структурно-функциональный анализ последствий длительной судорожной активности и эффективности нейропротекторов у крыс методом магнитно-резонансной томографии

Актуальность работы. В мире насчитывается 50 млн. больных эпилепсией (в России 800 тыс.), и лишь 60−70% пациентов с эпилепсией удается добиться контроля над припадками с помощью монотерапии 1 ряда (Петрухин и др., 2010). Кроме того, многие противоэпилептические препараты (ПЭП) обладают широким спектром побочных эффектов. При эпилепсии существует риск развития эпилептического статуса (ЭС) — состояния, при котором каждый последующий приступ возникает раньше, чем больной выходит из предыдущего, у него остаются выраженные нарушения сознания, гемодинамики, дыхания, гомеостаза на протяжении более 30 минут (Карлов, 2003). ЭС не только угрожает жизни человека, нарушая работу многих жизненно важных систем организма, но, при большой длительности судорог, приводит к запуску процессов, приводящих к апоптозу и некрозу нейронов в различных структурах головного мозга. Повреждение и гибель нейронов в головном мозге может привести к серьезным отставленным последствиям, таким как нарушение памяти и обучения, когнитивных функций, а также развитие хронической эпилепсии. Морфо-функциональные изменения, развивающиеся в мозге в результате ЭС, могут стать причиной развития эпилепсии височной доли.

Клинические исследования не всегда могут дать возможность изучения механизмов, лежащих в основе отставленных последствий ЭС, так как между событием, являющимся инициирующим фактором развития изменений в мозге, ведущим к патологическим последствиям, могут пройти годы. Также из-за многообразия типов эпилепсии при исследованиях на людях бывает затруднительно определить этиологию заболевания и правильно провести диагностику. Существующие экспериментальные модели ЭС у крыс позволяют исследовать эти механизмы. Однако и в экспериментальных моделях изменения в мозге происходят в течение достаточно длительного времени после ЭС, а возможно, и в течение всей последующей жизни животного. Развитие прижизненных методов визуализации, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ), помогают проследить динамику изменений, происходящих в структурах мозга после ЭС. Достаточно много работ посвящено изменениям, выявляемым при МРТ-исследовании мозга после ЭС, однако по-прежнему актуально изучение возможности применения различных параметров МРТ как ранних маркеров, предсказывающих отставленные изменения в мозге, развивающиеся через достаточно длительное время после ЭС.

Немногочисленны также работы, в которых анализируется корреляция между теми изменениями, которые выявляются с помощью МРТ, и поведенческими нарушениями.

Применение нейропротекторов, предотвращающих патологические процессы, вызываемые повреждением мозга при ЭС, могло бы улучшить прогноз у пациентов, страдающих эпилепсией. Классические и новые ПЭП могут купировать повышенную судорожную активность мозга, но, как правило, не обладают защитными свойствами в отношении нейродегенерации и не предотвращают эпилептогенез. Таким образом, проблема эффективного предотвращения повреждения головного мозга в результате длительных судорог остается нерешенной и целесообразным является поиск кандидатов в нейропротекторы.

Цель работы:

Исследовать возможность применения количественных и качественных параметров МРТ-исследований в качестве маркеров, предсказывающих отставленные изменения в мозге крыс после ЭС и ассоциированных с ними поведенческих нарушений, а также провести оценку эффективности нейропротекторных эффектов гликозидов женьшеня.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику повреждения мозга крыс после литий-пилокарпинового ЭС, выявляемых с помощью МРТ на 2, 7 и 30 дни после ЭС.

2. Исследовать индивидуальную изменчивость выявляемых при МРТ-исследованиях патологических изменений в различных структурах мозга крысы в ранний и поздний периоды после ЭС.

3. Исследовать зависимость между ранними изменениями, выявляемыми в мозге крыс на 2 день после ЭС и поздними изменениями, выявляемыми на 30 день после ЭС.

4. Исследовать поведение крыс, перенесших ЭС в тесте «открытое поле» и их способность к поведенческой адаптации в «открытом поле». Провести анализ зависимости между параметрами повреждения мозга в разные периоды после ЭС, выявленных с помощью МРТ-исследования, и поведенческими нарушениями в открытом поле.

5. Исследовать влияние степени повреждения мозга крыс после ЭС на развитие признаков депрессивного поведения.

6. Исследовать влияние экстракта культуры клеток корня женьшеня на степень повреждения мозга крыс, выявляемую в различные периоды после ЭС.

Научная новизна работы. Впервые был проведен анализ индивидуальных различий крыс линии Вистар по степени и распределению повреждений в различных структурах мозга после литий-пилокарпинового ЭС. Было обнаружено две группы крыс, достоверно различающиеся по интенсивности Тг-сигнала в гиппокампе, пириформной коре и миндалине. Было показано, что ранние обратимые изменения в гиппокампе крыс, выявляемые на МРТ через 2 суток после ЭС, коррелируют с поздними изменениями, выявляемыми через 30 дней после ЭС. Впервые было показано, что время релаксации Тг в миндалине и ретросплениальной коре на 30 день после ЭС коррелирует с активностью в открытом поле, а время релаксации Тг в префронтальной коре отрицательно коррелирует с уменьшением локомоторной активности при адаптации в открытом поле. Таким образом, было обнаружено, что время релаксации Т2 может быть маркером процессов, происходящих во время хронической фазы после ЭС и связанных с поведенческими нарушениями. С применением метода МРТ впервые было показано, что введение экстракта культуры корня женьшеня после длительных судорог снижает степень повреждения мозга крыс по сравнению с крысами, получавшими физ-раствор и вальпроат. Хроническое введение экстракта корня женьшеня в течение 4 недель после длительных судорог предотвращает вызванное ими уменьшение объема гиппокампа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ранние изменения в мозге крыс, выявляемые после ЭС методом МРТ коррелируют с отставленными повреждениями мозга, вызванными длительными судорогами.

2. ЭС приводит к поведенческим нарушениям, выявляемым у крыс в тесте «открытое поле». Степень ранних изменений в мозге крыс, выявляемых при МРТ-исследовании, не коррелирует с этими нарушениями.

3. Поздние изменения в мозге крыс, выявляемых при МРТ-исследовании в миндалине, ретросплениальной и поясной коре коррелирует с поведенческой активностью в открытом поле в хронический период после ЭС. 6.

4.

Введение

экстракта культуры клеток корня женьшеня ДАН-25 после ЭС уменьшает степень ранних изменений в мозге, выявляемых при МРТ-исследовании на 2 день после ЭС, но не предотвращает уменьшение объема гиппокампа.

5. Хроническое предварительное введение экстракта культуры клеток корня женьшеня ДАН-25 перед инициацией ЭС уменьшает тяжесть судорог во время ЭС. Хроническое введение экстракта в течение 4 недель после ЭС препятствует уменьшению объема гиппокампа через 30 дней после ЭС.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе проведен анализ ранних и отставленных изменений в ряде структур мозга крысы после ЭС, выявляемых при МРТ-исследовании. Научный интерес представляют данные, свидетельствующие о том, что изменения, выявляемые при МРТ-исследовании мозга, связаны со степенью поведенческих нарушений, развивающихся после ЭС. Показан нейропротекторный эффект экстракта культуры клеток корня женьшеня при ЭС.

Полученные данные могут быть использованы при оценке эффективности применения результатов МРТ для прогнозирования развития отставленных последствий ЭС, а также при исследовании эффективности нейропротекторов.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на международной конференции «Идиопатическая генерализованная эпилепсия» (Анталья, Турция, 2007), 7-й ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ-РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2007), II съезде физиологов СНГ (Кишинэу, Молдова, 2008), 10-м международном симпозиуме по женьшеню (Сеул, Корея, 2010), 8-м Всемирном конгрессе Международной Организации Изучения Мозга (IBRO) (Флоренция, Италия, 2011), конференции Словенской Ассоциации Нейронаук 2011 (Любляна, Словения, 2011), 8-м Форуме Европейской Федерации Нейронаук (Барселона, Испания, 2012), 10-м Европейском конгрессе по эпилептологии (Лондон, Великобритания, 2012).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Эпилептический статус и его патофизиологические механизмы и последствия.

Эпилепсия является одним из самых распространенных неврологических заболеваний. Ее распространенность составляет не менее 5−8 случаев на 1000 у взрослых и 10 случаев на 1000 у детей (Мухин, et al., 2004). Согласно данным Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в 2010 году с диагнозом «эпилепсия, эпилептический статус» было зарегистрировано 238,2 больных на 100 тыс. населения. Среди пациентов в возрасте от 0 до 14 лет этот показатель составлял 426,3 на 100 тыс. Рост заболеваемости наблюдается также у пожилых людей (Карлов, 2009). Особенную опасность представляет возможность развития у пациентов эпилептического статуса (ЭС), при котором каждый последующий приступ возникает раньше, чем больной выходит из предыдущего, у него остаются выраженные нарушения сознания, гемодинамики, дыхания, гомеостаза на протяжении более 30 минут. Основным критерием определения тяжести ЭС является частота припадков, исключающая полное восстановление сознания и способное привести к развитию комы (Карлов, 2003; Mello, et al., 2006).

Выделяют несколько типов ЭС: тонико-клонический ЭС, абсансный ЭС, парциальный ЭС. Развитие судорожного ЭС характерно для парциальных и вторично генерализованных эпилепсий. Бессудорожные формы ЭС чаще развиваются при идиопатической генерализованной эпилепсии. Типичный абсансный ЭС развивается у пациентов с идиопатической генерализованной эпилепсией, атипичный абсансный ЭС — у пациентов с энцефалопатиями, сопровождающимися вторично генерализованными припадками. Еще одна форма неконвульсивных ЭС — сложный парциальный абсансный ЭС, характерный для эпилепсии с парциальными припадками (Shorvon, Walker, 2005). Эти формы ЭС менее опасны, чем судорожный ЭС, однако могут представлять значительные трудности для диагностики (Карлов, 2003). У одного пациента может быть несколько различных типов приступов. Например, приступ, начавшись как простой парциальный, может трансформироваться в сложный парциальный, а затем во вторично генерализованный.

Судорожный синдром при ЭС может иметь различную этиологию. ЭС может быть как проявлением собственно эпилепсии, так и проявлением других патологий мозга. В связи с этим выделяют две формы возникновения ЭС (Карлов, 2003):

1) Собственно эпилептический статус.

2) Симптоматический эпилептический статус: а) при органических заболеваниях мозга б) при острых и хронических интоксикациях.

Причинами развития эпилептического статуса могут стать острые патологии мозга: травмы, опухоли головного мозга, инфекции нервной системы, цереброваскулярные заболевания, токсические и метаболические нарушения, гипертермия у детей. Также причиной может стать нарушение приема антиэпилептических препаратов. В 15 — 30% случаев причину определить не удается, диагностируется идиопатический эпилептический статус (Watson, 1991).

Встречаемость ЭС в различных областях в Европе и США составляет от 9,9 до 41 случая на 100 тыс. населения (Logroscino, et al., 2005). Прогноз пациента зависит от разнообразных факторов, таких как возраст, длительность ЭС, промежуток от инициации ЭС до начала терапии, адекватность лечения. Наиболее часто ЭС развивается у детей и у пациентов старше 60 лет. Чем длительнее судороги (более 1 часа), тем больше вероятность развития резистентности к противоэпилептическим препаратам, выше смертность и хуже прогноз для выживших пациентов (Logroscino, et al., 1997). Очень важным фактором является этиология ЭС. Наиболее часто летальный исход наступает после острого симптоматического статуса, при этом острое инфекционное поражение мозга или наличие цереброваскулярной патологии значительно ухудшает прогноз (Logroscino, et al., 2005; Neligan, Shorvon, 2010).

Судорожный эпилептический статус характеризуется тяжелой клинической картиной и создает непосредственную угрозу жизни больного. ЭС может развиваться внезапно, либо с постепенным учащением судорог. Главным патологическим фактором при ЭС является судорожный синдром, инициирующий развитие целого ряда расстройств. По характеру судорожного синдрома выделяют генерализованный, парциальный, односторонний ЭС (Карлов, 2003). Генерализованный ЭС встречается наиболее часто. В случае вторично генерализованного ЭС можно установить фокальное начало припадков. В других случаях генерализованный ЭС начинается внезапно, латерализовать припадки не удается. Выделяются тоническая и клоническая фазы припадка, соотношение которых может варьировать. Помимо тонико-клонической формы ЭС встречаются тоническая и клоническая формы ЭС.

Наиболее опасным является тонико-клонический ЭС, который является вторым по распространенности после инсульта экстренным неврологическим состоянием. Тонико-клонический ЭС характеризуется высоким риском смертельного исхода и большой вероятностью развития неврологических нарушений у выживших пациентов (Shorvon, 2012).

Патофизиологические механизмы ЭС.

ЭС не является просто серией тяжелых судорог, а качественно новым самоподдерживающимся состоянием. Для понимания механизмов инициации и поддержания ЭС важны как данные клинических электрофизиологических и патоморфологических исследований, так и экспериментальные данные.

Наиболее часто ЭС возникает у больных с прогредиентным течением эпилепсии, которое проявляется учащением припадков, их полиморфизмом, т. е. с повышенной активностью эпилептогенных очагов. Электроэнцефалографические исследования показали преимущественное расположение эпилептогенного очага в височной и височно-лобной областях. Таким образом, можно считать важным условием возникновения ЭС наличие высокоактивного эпилептогенного очага, локализованного в височной или височно-лобной области. В развитии эпилептического статуса из серийных припадков могут играть роль расстройства дыхания по типу асфиксия (припадок) — гипервентиляция (постпароксизмальная стадия), состояние стойкой гипоксии при ЭС может рассматриваться как проконвульсантный фактор, играющий роль в поддержании ЭС (Карлов, 2003).

Данные электроэнцефалографических, морфологических исследований и исследований интенсивности метаболизма в различных структурах мозга позволяют предположить, что развитие ЭС происходит при повышении возбудимости лимбической системы. Было показано, что инициация эпилептической активности может происходить в гиппокампе, экстрагиппокампальных структурах (пириформной коре, миндалине) и, наиболее часто, диффузно, что позволило предположить об участии в установлении самоподдерживающегося ЭС обширной эпилептогенной сети нейронов. Метаболическая активация при судорожной активности наблюдается как в лимбических структурах — CAI, САЗ, зубчатой извилине, септуме, амигдале, пириформной и энторинальной коре, так и в структурах, обеспечивающих моторные проявления — nucleus accumbens, хвостатом ядре, скорлупе, ретикулярной части черной субстанции. Гибель нейронов наблюдается в этих же структурах. Предполагается, что структуры лимбической системы ответственны за инициацию ЭС, причем этот процесс при разных типах ЭС происходит сходным образом. Циркуляция возбуждения в лимбической системе приводит к активации различных нейронных путей и вовлечению нелимбических структур в эпилепическую активность. Дополнительные области активации различаются в зависимости от типа ЭС (Mazarati, et al., 2006; Wasterlain, Chen, 2008).

Инициация ЭС может происходить в силу разнообразных причин, когда происходит нарушение противоэпилептических механизмов, препятствующих неконтролируемой циркуляции возбуждения. В случае самоподдерживающегося ЭС даже при устранении причин, послуживших триггером для развития этого состояния, судороги продолжаются. Точные механизмы этого явления до сих пор неизвестны, однако существует несколько возможных объяснений. Предполагается, что адаптация ГАМК-ергической системы в условиях длительной судорожной активности может быть одним из таких механизмов. Уменьшение эффективности работы ГАМК-ергической системы приводит к ослаблению торможения и дальнейшему поддержанию эпилептической активности. Показано, что при длительной судорожной активности происходит уменьшение амплитуды ТПСП, вызванных активацией ГАМКд-рецепторов. Это может объясняться интернализацией ГАМКА-рецепторов, десенситизацией, изменениями выброса и захвата медиатора (Mazarati, et al., 2006). Действительно, при переходе от одиночных судорог к ЭС количество ГАМКд-рецепторов в гиппокампальных синапсах значительно уменьшается (Naylor, Wasterlain, 2005). Существует предположение, что уменьшение числа ГАМКд-рецепторов путем их эндоцитоза является основным механизмом подавления торможения. Интернализованные рецепторы в везикулах, покрытых клатрином, транспортируются в аппарат Гольджи, откуда они могут вернуться в мембрану, либо в лизосомы, где происходит их деградация. Уменьшение числа ГАМК-рецепторов может объяснять развитие при ЭС резистентности к бензодиазепинам (Mazarati, et al., 2006; Wasterlain, Chen, 2008; Wasterlain, et al., 2009).

Одновременно со снижением эффективности тормозных систем происходит активация возбуждающей системы за счет потенциации ответов NMDA-рецепторов. Наряду с интернализацией ГАМК-рецепторов происходит мобилизация и встраивание NMDA-рецепторов в синаптические мембраны, т. е. их плотность на.

11 синаптической мембране увеличивается. Другой механизм потенциации связан с активацией пресинаптической Са2+" зависимой кальмодулин киназы II (СаМКП). При деполяризации активация NMDA-рецепторов приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+, в присутствии которого происходит аутофосфорилирование СаМКН, в результате которого повышается активность киназы. Фосфорилирование белков продолжается, когда нет возбуждения и повышенного содержания Са2+. Фосфорилирование синапсина I и отсоединение фосфосинапсина I от синаптических пузырьков приводит к повышению выброса медиатора. Потенциация глутаматэргической системы может играть важную роль в поддержании эпилептической активности во время ЭС (Mazarati, et al., 2006).

Нужно отметить также, что длительная эпилептическая активность сопровождается изменениями ионного градиента. Происходит возрастание внеклеточного [К+], внутриклеточного [СГ]. Накопление внеклеточного К+ приводит к деполяризации мембран нейронов.

Предполагается, что подавление пресинаптического торможения, обусловленного ГАМКв-рецепторами, как и подавление ГАМКА-опосредованного торможения, играет роль в развитии долговременных последствий ЭСустановлении спонтанных судорог. Однако есть данные, что сокращение числа ГАМКв-рецепторов обнаруживается в течение короткого времени после ЭС. Система пресинаптического торможения, опосредуемая ГАМКв-рецепторами, участвует в «гетеросинаптическом» торможении, регулирующем передачу сигнала по окончаниям гиппокампальных моховидных волокон, составляющим основной вход из зубчатой извилины в гиппокамп. При этом активация одних групп волокон тормозит выброс медиатора из окончаний других групп волокон. Показано, что при ЭС наблюдается возрастание содержания ГАМК в моховидных волокнах, однако одновременно происходит сокращение количества ГАМКв-рецепторов. В результате ослабляется гетеросинаптическое торможение. Таким образом, сокращение числа ГАМКв-рецепторов также может играть роль в поддержании ЭС (Chandler, et al., 2003).

Механизмы повреждения мозга в результате судорожной активности.

Повреждение мозга в результате длительных судорог было описано достаточно давно. В клинике при терапии генерализованных судорог пытались применять иммобилизацию пациентов с помощью миорелаксантов совместно с искусственной вентиляцией легких, однако эти мероприятия были неэффективны в случаях развития поражений мозга у таких пациентов (Epstein, O’Connor, 1966). Однако долгое время оставалось невыясненным, действительно ли гибель нервных клеток происходит в результате собственно эпилептической активности, так как ЭС сопровождается серьезными системными осложнениями — гиперили гипотензией, гипогликемией, гипоксемией, ацидозом и др. (Карлов, 2003). Гистологические исследования мозга пациентов, погибших в результате ЭС, выявили гибель нейронов в мозге, глиоз в неокортексе, гиппокампальных полях CAI и САЗ, зубчатой борозде, миндалине, таламусе, а также гибель клеток Пуркинье в мозжечке, повреждение стриатума, гипоталамуса (DeGiorgio, et al., 1992; Mori, et al., 1992; Fujikawa, et al., 2000). Meldrum с соавт. (Meldrum, et al., 1973) показали, что в результате ЭС, вызванного бикукулином, у парализованных бабуинов с искусственно вентилируемыми легкими развиваются повреждения нейронов в неокортексе и гиппокампе, обусловленные собственно эпилептическими разрядами. При изучении мозга пациентов, умерших после ЭС, не сопровождающегося системными осложнениями, не имевших диагноза эпилепсии и патологий мозга, были обнаружены повреждения в гиппокампе (поля CAI, СА2, САЗ), зубчатой борозде, миндалине, пириформной и энторинальной коре (Fujikawa, et al., 2000). Таким образом, было показано, что гибель нейронов может происходить в результате длительной эпилептической активности вне зависимости от системных метаболических факторов.

Большое количество данных, полученных при исследовании экспериментальных моделей эпилептической активности у животных, подтверждает, что длительная судорожная активность вызывает гибель нейронов в различных структурах мозга (Ben-Ari, 1985; Turski, et al., 1989; Sankar, et al., 1998; Covolan, Mello, 2000; Fujikawa, et al., 2000). Даже кратковременные эпизоды индуцированного пилокарпином ЭС (5 мин) способны вызывать гибель нейронов в гиппокампе, эндопириформной и пириформной коре, некоторых ядрах амигдалярного комплекса (Mello, et al., 2006). Увеличение длительности ЭС приводит к более выраженным повреждениям, гибели клеток и в других структурах мозга (Lemos, Cavalheiro, 1995). В результате судорог продолжительностью 1 — 2 часа поврежденные нейроны выявляются в ядре ложа конечной полоски (п. bed stria terminalis), хвостатом ядре, некоторых ядрах таламуса и гипоталамуса и в IV и VI слоях неокортекса. Однако степень повреждений не имеет линейной зависимости от длительности ЭС, чувствительность к повреждающему воздействию судорожной активности неодинакова в различных структурах (Covolan, Mello, 2006).

Показано, что гибель клеток может происходить в результате и некроза, и апоптоза (Sankar, et al., 1998; Fujikawa, et al., 2000; Gorter, et al., 2003; Lopez-Meraz, et al., 2010), при этом, по-видимому, механизм клеточной гибели может зависеть как от экспериментальной модели, так и от возраста исследуемых животных. Предполагается, что путь клеточной смерти определяется, по крайней мере, двумя главными факторами: тяжестью ЭС и специфическими особенностями клеток, подвергающихся цитотоксическому воздействию. В ЦНС возможен смешанный путь нейродегенерации, когда запуск программируемой клеточной смерти с активацией каспаз приводит в конечном итоге к некротической гибели нейронов (Bonfoco, et al., 1995; Fujikawa, et al., 2000).

Повреждение структур мозга при ЭС связано с цитотоксическим эффектом длительной активации глутаматных AMP Аи NMDA-рецепторов, когда в клетку поступает большое количество ионов Са2+ (Choi, 1987; Scharfman, Schwartzkroin, 1989; Deshpande, et al., 2008). Следовательно, гибель нейронов при тяжелых судорогах происходит в результате Са2+ перегрузки. Высокое содержание Са2+ в цитоплазме приводит к генерации активных форм кислорода через активацию NO-синтазы, разобщению окислительного фосфорилирования в митохондриях, активации большого количества ферментов — липаз, протеаз, эндонуклеаз (Lipton, Rosenberg, 1994; Holmes, Ben-Ari, 2001). Выход цитохрома С из митохондрий приводит к активации каспаз. Эти процессы в конечном итоге приводят к клеточной смерти.

Повышение внутриклеточного уровня Са2+ может вызывать развитие рефрактерности ЭС, когда он практически не поддается купированию стандартными противоэпилептическими препаратами (Rice, DeLorenzo, 1999). В исследованиях на разных моделях, в том числе, на литий-пилокарпиновой модели ЭС, было показано, что неконкурентные блокаторы NMDA-рецепторов, такие как кетамин, фенциклидин и МК-801, способны предотвращать гибель нейронов, возникающей при эпилептической активности, т. е. NMDA-рецепторы играют ключевую роль в повреждении мозга в результате длительных судорог (Clifford, et al., 1990; Fujikawa, 1995; Rice, DeLorenzo, 1998).

Отставленные последствия ЭС. Нейродегенерация и эпилептогенез.

В настоящее время накоплено большое количество клинических и экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что длительная судорожная активность при ЭС может быть триггером, провоцирующим целый каскад патологических процессов, ведущих к развитию хронической эпилепсии, нарушениям памяти, депрессивным расстройствам.

Непрерывные судороги при ЭС действуют на мозг как мощный повреждающий фактор. После некоторого, вариабельного по длительности, латентного периода, наступает хроническая фаза, характеризующаяся появлением повторяющихся спонтанных судорог. В латентный период, когда еще не проявляются отставленные последствия ЭС, происходит ряд клеточных изменений: нейродегенерация, нейрогенез, глиоз, реорганизация синаптических связей, спрутинг аксонов, ангиогенез, изменения ионных каналов в мембране нейронов. Эти изменения приводят к развитию хронических функциональных нарушений мозга (рис. 1) (Рккапеп, Ьикаэшк, 2009).

Латентная фаза эпилептогенез.

Нарушение ГЭ6 Ангиогенез.

Реорганизация связей.

Межклеточный метрике.

Хроническая фаза.

Воспаление.

Нейрогенез.

V/.

Каналопатии.

Спрутинг аксонов.

Нейродегенерация.

Поведенческие И эмоциональные расстройства.

Эпилепсия.

Нарушения памяти.

Задержка развития.

Моторные нарушения.

Резистентность к АЭП.

Рис. 1. Клеточные изменения, происходящие в мозге после ЭС и приводящие к развитию различных функциональных нарушений, таких как эпилепсия, поведенческие, эмоциональные и когнитивные расстройства, моторные нарушения, задержка развития у детей, а также к формированию резистентности к антиэпилептическим препаратам (АЭП).

Длительные судороги вызывают нейродегенерацию и глиоз, наиболее выраженный в хилюсе, полях CAI и САЗ гиппокампа, миндалине, таламусе (Веп-Ari, 1985; Mello, et al., 1993; Fujikawa, et al., 2000). Клинические данные свидетельствуют, что перенесенные пациентом длительные судороги, в том числе, фебрильные судороги у детей, могут приводить к развитию мезиального височного склероза, который является одной из самых частых причин возникновения височной эпилепсии — одной из наиболее распространенных форм эпилепсии у детей и взрослых (Мухин, et al., 2008).

Гистологические исследования мозга пациентов, перенесших ЭС, выявили наличие у них склеротических изменений гиппокампа. Глиоз и атрофическая редукция, являющиеся патоморфологическим субстратом гиппокампального склероза, обнаруживаются у 50—70% пациентов после проведения амигдал-гиппокампэктомии по поводу резистентной эпилепсии (Федин, et al., 2006). Однако посмертные исследования и патоморфологическое изучение материала, полученного при проведении гиппокампэктомий, не дают возможности ответить на вопрос, являются ли эти изменения следствием длительной эпилептической активности, или связаны с последующим эпилептогенезом.

Исследование крыс с хронической эпилепсией после ЭС показало, что гибель нейронов в гиппокампе и парагиппокампальных структурах зависит только от длительности инициировавшего эпилептогенез ЭС, но не связана с частотой спонтанных судорог в хронический период после ЭС (Gorter, et al., 2003).

С развитием новых методов прижизненной визуализации структур головного мозга, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ), стало возможным проследить динамику изменений структур мозга после ЭС и при хронической эпилепсии. Серийные МРТ-исследования показали, что у пациентов, перенесших ЭС с последующим развитием хронической эпилепсии, в ряде случаев выявляются прогрессирующие морфологические нарушения головного мозга. У них наблюдается склероз и атрофия гиппокампа, редукция коры и увеличение объема мозговых желудочков (Wieshmann, et al., 1997; Herrmann, et al., 2006). У детей, перенесших эпизод длительных фебрильных судорог, на МРТ были выявлены острые патологии гиппокампа (усиление Тг сигнала, по-видимому, связанное с отеком), а через 4—8 месяцев у таких пациентов выявлялась значительно более выраженная, по сравнению с пациентами без фебрильных судорог в анамнезе, асимметрия гиппокампа (Scott, et al., 2003). В клинических исследованиях не всегда возможно с точностью установить, возникли ли подобные патологии до или после ЭС. Тем не менее, ряд данных, полученных на моделях ЭС, показал, что нейродегенеративные процессы в головном мозге крыс продолжаются в течение многих месяцев после перенесенных судорог (Roch, et al., 2002; Nairismagi, et al., 2004). Таким образом,.

16 получены свидетельства того, что гибель нейронов инициируется в основном в результате непосредственно ЭС, и не связана с последующим эпилептогенезом и кратковременными спонтанными судорогами, однако процесс нейродегенерации может происходить в течение длительного времени после ЭС.

Помимо нейродегенерации в результате ЭС происходит также активация пролиферации предшественников нервных клеток в гиппокампе, которые могут дифференцироваться в нейробласты или глиальные клетки. Было показано, что даже относительно кратковременные эпизоды судорожной активности могут инициировать нейрогенез в зубчатой извилине крыс. Параллельно этому процессу происходит спрутинг моховидных волокон в зубчатой извилине. Предполагается, что аксоны новообразованных нейронов в поле САЗ гиппокампа и в зубчатой извилине принимают участие в формировании аберрантных связей в гиппокампальной формации при эпилептогенезе (Parent, Lowenstein, 1997; Parent, et al., 1997; Parent, 2007).

Еще одним выраженным последствием длительной судорожной активности является глиоз. Глиальные клетки выполняют множество функций: поддерживающую, питательную, поддержание баланса воды и ионов, регуляцию нервной передачи, регуляцию воспалительного ответа. Длительные судороги вызывают активацию астроцитов и микроглии, которые синтезируют большое количество провоспалительных цигокинов (IL-1, IL-6, TNF-a), которые, в свою очередь, активируют сигнальные пути, которые через транскрипционный фактор NFkB модулируют экспрессию генов, связанных с регуляцией клеточной гибели и выживания, реорганизации синапсов и пластичности. Кроме того, выброс цитокинов приводит к активации ряда киназ, фосфорилирующих потенциалзависимые и рецепторные ионные каналы, непосредственно воздействуя на возбудимость нейронов и судорожный порог (Vezzani, et al., 2011).

Таким образом, запускаемый пролонгированной судорожной активностью каскад процессов приводит к необратимым прогрессирующим изменениям, затрагивающим нейронные сети гиппокампа и других структур, которые могут давать вклад в эпилептогенез и развитие функциональных расстройств ЦНС. Конкретные механизмы развития хронической эпилепсии после ЭС и роль в нем описанных патологических процессов остаются невыясненными. Существует гипотеза, что гибель ГАМК-эргических интернейронов в результате ЭС приводит к недостаточности ГАМК-эргической системы, а гибель глутаматэргических нейронов, сопровождаемая спрутингом аксонов уцелевших нейронов и в, некоторых.

17 областях мозга, нейрогенезом, приводит к формированию новых глутаматергических сетей. В условиях недостаточности торможения в этих сетях периодически может возникать спонтанная активность, которая и приводит к развитию эпилептического припадка (Ben-Ari, Dudek, 2010).

Литий-пилокарпиновая модель ЭС.

Разработка экспериментальных моделей ЭС дала возможность не только тестировать новые противосудорожные препараты, но и более подробно исследовать механизмы возникновения и поддержания судорожной активности, а также изучать отставленные патологические процессы в мозге, инициируемые длительной эпилептической активностью.

Широкое распространение получили модели самоподдерживающегося ЭС на животных, когда судороги продолжаются в течение длительного времени независимо от инициирующего стимула. Самоподдерживающийся ЭС можно вызвать электрическим раздражением гиппокампа, латерального или базолатерального ядра миндалины или других структур лимбической системы, либо при помощи химических конвульсантов (пилокарпиновая и каинатная модели) (Loscher, 2002). Изучение этих моделей может помочь понять механизмы, лежащие в основе ЭС, способствовать улучшению методов лечения и предотвращения последствий ЭС.

В качестве хемоконвульсантов, инициирующих длительные судороги, используют стрихнин, пентилентетразол, бикукулин, пикротоксин, кокаин, пилокарпин, каинат и другие вещества. Они вызывают генерализованные клонические судороги с тонической фазой или без нее. Пилокарпиновая и каинатная модели ЭС получили широкое распространение при изучении механизмов, последствий и методов его лечения. Литий-пилокарпиновая модель является модификацией модели пилокарпиновых судорог, при которой ЭС индуцируется совместно литием и малыми дозами пилокарпина.

Пилокарпин является парасимпатомиметиком, функционирующим главным образом как мощный агонист М-холинорецепторов (Ml — М5). Семейство М-холинорецепторов отвечает за широкий спектр физиологических функций. Работы с использованием техники нокаута белков-рецепторов показали, что у мышей с нокаутом М1-рецепторов при введении пилокарпина судороги не развиваются, т. е. только данный подтип рецепторов ответственен за судороги, вызываемые пилокарпином.

Литий долгое время используется в клинике при лечении маниакально-депрессивного психоза. Показан широкий спектр эффектов лития при изучении поведения грызунов, а также на моделях агрессии, депрессии, шизофрении (O'Donnell, Gould, 2007).

Литий способен ингибировать ряд ферментов, содержащих магний в качестве кофактора. Одним из таких ферментов является инозитол монофосфат фосфатаза, которая катализирует последний этап превращения инозитолтрифосфата в инозитол. Таким образом, введение лития вызывает понижение содержания инозитола в клетках мозга, которое сопровождается повышением концентрации инозитол-1-фосфата. Литий вызывает также снижение содержания миоинозитола. Влияние лития на метаболизм фосфоинозитидов обуславливает его способность модулировать фосфоинозитидный сигнальный путь, снижая количество доступного для сигнальных каскадов фосфоинозитолдифосфата через снижение концентрации инозитола (Quiroz, et al., 2004). Гипотеза истощения инозитола, предполагающая, что такой эффект лития лежит в основе его ингибирующего действия на поведение, подтверждается большим количеством исследований (O'Donnell, Gould, 2007).

Литий повышает чувствительность к пилокарпину. Honchar с соавт. (1983) показали, что введение лития совместно с пилокарпином вызывает развитие ЭС (Honchar, et al., 1983). Предполагается, что в основе этого эффекта лития также может лежать его способность снижать содержание инозитола и миоинозитола. Так, введение миоинозитола блокирует развитие литий-пилокарпиновых судорог. Вероятно, литий модулирует чувствительность к пилокарпину через воздействие на фосфоинозитольный сигнальный путь (Williams, Jope, 1995).

Пилокарпин может вызвать ЭС самостоятельно, но в значительно больших дозах, обычно более 300 мг/кг. При судорогах, индуцированных как пилокарпином, так и литием совместно с пилокарпином, наблюдаются сходные поведенческие особенности и типы повреждения мозга. При использовании литий-пилокарпиновой схемы благодаря снижению дозы пилокарпина удается снизить периферические побочные эффекты пилокарпина как холиномиметика (Leite, et al., 2002).

Пилокарпин при системном введении вызывает последовательные поведенческие и электрографические изменения, которые могут быть разделены на три периода:

1) острый период ЭС, который может длиться до 24 часов;

2) латентный период с прогрессивной нормализацией ЭЭГ и поведения, который длится 4−44 дня;

3) хронический период со спонтанными рекуррентными судорогами 3−5 раз в неделю.

Стадии литий-пилокарпиновой модели могут служить разным экспериментальным целям. Острая фаза может использоваться для изучения способности препаратов предотвращать рефрактерный ЭС или их нейропротекторных свойствлатентная фаза — для определения потенциальных возможностей препарата предотвращать эпилептогенез и развитие когнитивных нарушенийхроническая фаза — для тестирования препаратов с действием против вторичной генерализации или парциальных судорог (Leite, et al., 2002).

Литий-пилокарпиновая модель судорог достаточно хорошо воспроизводит большинство клинических и нейропатологических особенностей судорожного эпилептического статуса человека. Последовательность электроэнцефалографических изменений, наблюдаемых у крыс с пилокарпиновым ЭС, соответствует последовательности изменений, выявленных на ЭЭГ пациентов с генерализованным судорожным ЭС (Treiman, 1990). Литий-пилокарпиновая модель демонстрирует резистентность ко многим фармакологическим агентам, используемым при лечении эпилепсии. При этом антиконвульсанты вызывают эффект, сходный с их клиническим воздействием при ЭС. Диазепам и карбамазепин способны предотвращать развитие ЭС, если вводить их перед пилокарпином. Резистентность к диазепаму и фенобарбиталу развивается с увеличением длительности судорог. Через 10 мин после появления на ЭЭГ спайк-волновой активности диазепам и фенобарбитал становятся практически полностью неэффективными. Фенитоин не проявляет антиконвульсантного эффекта независимо от времени введения (Morrisett, et al., 1987; Jones, et al., 2002).

Одним из немногих антиконвульсантов, способных ингибировать уже развившийся ЭС, является паральдегид. Паральдегид подавляет моторные судороги и судорожную активность на ЭЭГ у взрослых крыс и крысят, однако через 2 часа после инъекции паральдегида эпилептическая активность на ЭЭГ возобновляется. Показано дозозависимое влияние паральдегида на исход и последствия эпистатуса у крысят: у крысят, получавших большие дозы паральдегида наблюдались меньшие моторные и когнитивные нарушения (Kubova, et al., 2005).

Хотя инициация эпилептической активности в литий-пилокарпиновой модели связана с активацией мускариновых рецепторов, установление судорог и.

20 последующие патологии связаны с гиперактивацией глутаматных NMDA-рецепторов. Было показано, что NMDA-рецепторы играют роль в развитии резистентности ЭС к бензодиазепинам.

Введение

блокатора NMDA-рецепторов МК-801 после развития ЭС снимало резистентность к диазепаму даже после 1 часа эпистатуса. Предварительное введение МК-801 способно ингибировать развитие ЭС на литий-пилокарпиновой модели, но не развитие ЭС при введении высоких доз только пилокарпина, хотя на обеих моделях показана способность МК-801 снимать резистентность к бензодиазепинам (Rice, DeLorenzo, 1999).

NMDA-рецепторы играют также важную роль в эпилептогенезе, вызванном ЭС (модель эпилепсии височной доли). Гиперактивация NMDA-рецепторов при эпистатусе приводит к пластическим изменениям, изменяет возбудимость нейронов, понижая судорожный порог и вызывая таким образом возникновение спонтанных судорог. Так, блокада NMDA-рецепторов при ЭС, индуцированном пилокарпином, способна предотвращать появление эпилептической активности на ЭЭГ и поведенческих проявлений судорог в хронический период после ЭС. Это свидетельствует о том, что NMDA-рецепторы необходимы для развития спонтанных повторяющихся судорог после ЭС (Rice, DeLorenzo, 1998).

Как и в случае судорожного ЭС у человека, в результате длительных судорог, индуцируемых пилокарпином, происходит повреждение мозга, в особенности амигдалы, таламуса, гиппокампа, обонятельной коры, неокортекса и substantia nigra (Turski, et al., 1989). В результате литий-пилокарпинового эпистатуса вероятнее происходит некроз нейронов, а не апоптоз (Fujikawa, et al., 2000).

Последствия эпилептического статуса, индуцированного пилокарпином, зависят от возраста. Все три периода (острая фаза — ЭС, латентный период, хронический период) проявляются у крыс, начиная с 18-дневного возраста. У таких крыс в результате ЭС развиваются морфологические и физиологические изменения, приводящие к установлению спонтанных судорог (Priel, et al., 1996). Развитие спонтанных судорог происходит у 10% 25-дневных крысят, у крысят меньшего возраста спонтанные судороги наблюдаются крайне редко (Kubova, et al., 2005). Крысята более устойчивы к повреждающему воздействию длительных судорог на мозг. На литий-пилокарпиновой модели было показано, что у 12-дневных крысят не обнаруживается заметных повреждений в пириформной и энторинальной коре, в то время как у 25-дневных и взрослых крыс наблюдается уменьшение числа нейронов и глиоз в этих структурах (Druga, et al., 2003).

Литий-пилокарпиновая модель хорошо воспроизводит клинические электроэнцефалографические, возрастные особенности фармакорезистентного судорожного эпилептического статуса человека с последующим развитием эпилепсии височной доли. Это позволяет применять данную модель как для поиска новых методов лечения, так и для изучения механизмов эпилептогенеза.

Поведенческие нарушения, вызываемые ЭС.

Структуры мозга, участвующие в механизмах обучения и памяти.

Гиппокамп и парагиппокампальные структуры. Многочисленные работы показали, что долговременная потенциация в гиппокампе играет центральную роль в процессах консолидации памяти. Долговременная потенциация была обнаружена в полях CAI, САЗ, септо-гиппокампальных проекциях и ряде других структур. Тем не менее, конкретная роль гиппокампа в процессах обучения и памяти до конца не выяснена (Martin, Clark, 2007; Izquierdo, et al., 2008). Роль долговременной потенциации в гиппокампе была хорошо изучена на примере простых поведенческих тестов, таких как однократная реакция избегания, водный лабиринт Морриса, 8-лучевой радиальный лабиринт. В настоящее время существует большое количество данных, подтверждающих центральную роль гиппокампа в пространственном обучении и распознавании контекста. Предполагается, что участие гиппокампа в пространственном обучении заключается в создании автоматической системы записи получаемого опыта, когда создаются временные ассоциации событиеконтекст, основанные на NMDA-зависимой синаптической потенциации (кратковременная консолидация памяти), которые могут быть забыты либо могут закрепиться в случае активации синтеза белков, связанных с пластичностью. В случае несовпадения нового события с текущей пространственной картой происходит активация исследовательского поведения (направленное внимание). Если полученная в результате информация требуется для локализации цели, то активируются компоненты системы долговременной памяти, и происходит обновление пространственной карты (Morris, Frey, 1997).

Помимо гиппокампа в процессы обучения и памяти вовлечено большое количество других кортикальных структур. В результате исследования поведения крыс с повреждениями в парагиппокампальных структурах было обнаружено, что помимо гиппокампа в запоминание контекста вовлечена постринальная, периринальная и энторинальная кора, т. е. для образования ассоциаций между стимулом и контекстом необходимы кортико-гиппокампальные взаимодействия (Burwell et al., 2004). Роль входов от парагиппокампальных структур в пространственном обучении остается дискуссионной (Parron, et al., 2006).

Тем не менее, предполагается, что взаимодействия гиппокампа и энторинальной коры, через которую в гиппокамп поступает информация от вышележащих корковых структур, важны для неассоцитивного обучения, когда выполняется задача по идентификации новой геометрической организации пространства. Возможно, вклад энторинальной коры в обработку пространственной информации может варьировать в зависимости от типа задачи и задействованного когнитивного процесса (Parron, et al., 2006). Энторинальная кора имеет большое количество входов от других корковых областей и подкорковых структур, являясь, вероятно, местом интеграции различных процессов, связанных с обучением и памятью (Izquierdo, et al., 2008).

Миндалина. Миндалина является гетерогенной структурой, имеющей обширные связи с целым рядом структур мозга, включая неокортекс, таламус, стриатум, гиппокамп. Входы от миндалины в стриатум участвуют в реализации поведенческих реакций избегания, а входы в гипокамп играют роль в формировании эмоциональной памяти и модулируют пространственную память. Реципрокные связи с кортикальными областями могут играть роль в процессе выбора соответствующего стимулу поведения (Davis, Whalen, 2001). Хорошо изучена роль миндалины в реакциях условного избегания. Предполагается, что миндалина играет одну из ключевых ролей в оценке угрозы и в поведенческих реакциях, связанных со страхом (Fiddick, 2011). Предполагается, что базолатеральная миндалина непосредственно принимает участие в консолидации памяти при адаптации к страху, и в ней имеет место долговременная потенциация. Другая версия предполагает модуляторное влияние базолатеральной миндалины на процессы запоминания событий, связанных со страхом или любыми раздражителями, вызывающими отрицательные эмоции. Как бы то ни было, существует достаточное количество свидетельств участия миндалины в процессах консолидации и хранении воспоминаний, ассоциированных с эмоциями.

Поясная кора. Поясная кора входит в состав медиальной префронтальной коры и имеет реципрокные связи с медиодорзальным таламусом, получает входы из базальных ганглиев, теменной коры, черной субстанции, миндалины, латерального гипоталамуса и гиппокампа, а также реципрокные выходы в эти структуры. Также у.

23 префронтальной коры существуют эфферентные связи с основными холинэргическими и моноаминэргическими ядрами, посредством которых осуществляется нейромодуляция активности нейронных сетей (Dalley, et al., 2004).

В настоящее время известно, что поясная кора играет ключевую роль в процессах извлечения воспоминаний, связанных с формированием условной реакции избегания. Было показано, что при формировании реакции избегания инактивация передней поясной коры у крыс приводила к нарушению долговременной памяти, которая была сформирована в достаточно отдаленный период времени (более 30 дней) (Frankland, et al., 2004). Согласно другим данным, повреждение передней поясной коры приводит к нарушению формирования условной реакции избегания уже через один день, но не препятствует формированию кратковременной памяти (несколько часов) при реакции избегания (Liu, et al., 2009). Таким образом, поясная кора принимает участие в консолидации и извлечении долговременной памяти, связанной с проявлениями страха.

Хорошо известно, что рабочая память у грызунов подвержена модуляторным воздействиям холинэргической и дофаминэргической систем префронтальной коры. Считается, что префронтальная кора является структурой, участвующей в контроле сложных когнитивных процессов, который необходим при выполнении сложных последовательностей поведенческих реакций, включая селективное внимание, переключение задач, подавление поведенческих реакций, планирование, принятие решений (Dalley, et al., 2004).

Формирование кратковременной памяти. Кратковременная память формируется в течение секунд и минут и сохраняется в течение нескольких часов, у крысы кратковременная память сохраняется около 3 часов (McGaugh, 1966; Vianna, et al., 2000). На протяжении многих лет оставался дискуссионным вопрос о том, является ли кратковременная память просто начальной стадией формирования долговременной памяти или же является отдельным явлением, имеющим под собой собственную морфологическую и биохимическую основу. Позже было показано, что путем применения различных фармакологических блокаторов возможно влиять на формирование кратковременной памяти, не затрагивая формирование долговременной памяти. В процессах, связанных с формированием кратковременной и долговременной памяти, задействованы разные РКА-зависимые каскады (Vianna, et al., 2000). Формирование кратковременной памяти, в отличие от формирования долговременной памяти, не требует активации экспрессии генов и синтеза белка, и активация РКА, необходимая в случае кратковременной памяти, не связана с фосфорилированием транскрипционного фактора CREB1 (Izquierdo, et al., 2002).

В формирование кратковременной памяти вовлечены следующие структуры мозга и медиаторные системы: гиппокамп, теменная, энторинальная кора — АМРА рецепторы глутамата, М-холинергическая система в гиппокампе и префронтальной коре, Р-адренергическая и серотонинергическая системы гиппокампа и энторинальной коры, D1 дофаминергическая система префронтальной, энторинальной коры и гиппокампа. Базолатеральная миндалина и передняя префронтальная кора, по-видимому, не вовлечены в формирование кратковременной памяти (Walz, et al., 1999; Izquierdo, et al., 2002).

Реакция на предъявление нового стимула и поведенческая адаптация. По одной из классификаций память может быть разделена на ассоциативную и неассоциативную в зависимости от механизма ее формирования. Ассоциативная память основана на создании связи между событием и стимулом, в то время как неассоциативная память не требует такой связи и задействуется при повторяющемся или продолжительном предъявлении незнакомого стимула или помещении в незнакомое окружение.

Адаптация в незнакомом окружении является одной из простейших форм неассоциативного обучения (Vianna, et al., 2000; Kudin, et al., 2004). Поведенческая адаптация определяется как затухание ответа при предъявлении длительного или повторяющегося стимула, которое не связано с мышечным утомлением или адаптацией рецепторов (Rankin, et al., 2009). Адаптация грызунов обычно анализируется в рамках исследовательского поведения, когда в ответ на предъявление нового стимула наблюдается выраженная поведенческая активация, а при повторных предъявлениях стимула поведенческая активность снижается (Thiel, et al., 1998).

Детекция нового пространства связана со значительным возрастанием активности гиппокампальной РКА, происходящим сразу же после предъявления стимула, но активность РКА не изменяется в дальнейшем. Также происходит возрастание активности CaMKII в гиппокампе. Однако неассоциативная память не нарушается при блокаде РКА или МАРК каскадов и синтеза белка в CAI поле гиппокампа в отличие от ассоциативной памяти, в то время как сигнальные пути, в которых задействована CaMKII, необходимы для формирования как долговременной ассоциативной, так и неассоциативной памяти (Vianna, et al., 2000).

Поведение крысы в незнакомом окружении можно оценивать по двум группам параметров:

1) Горизонтальная локомоторная активность (например, передвижение животного вдоль стенок открытого поля) является показателем чувствительности к стрессу, индикатором исследовательской активности.

2) Вертикальная активность — количество и продолжительность стоек, может быть индикатором не только исследовательской активности, но и эмоционального состояния. Различие между группами животных по количеству стоек может отражать различный уровень тревожности у крыс этих групп.

В настоящее время накопилось большое количество данных, свидетельствующих о критической роли ацетилхолинергической системы в процессах, лежащих в основе поведенческой активности, возбуждения, внимания, обучения и памяти. Известно, когнитивные нарушения, по крайней мере, отчасти, связаны с повреждением компонентов холинергической системы (Stancampiano, et al., 1999). Проекции холинергических нейронов медиального септума в гиппокамп имеют отношение к исследовательской активности и адаптации в незнакомом окружении, повреждения гиппокампа или фармакологическая блокада холинергической передачи оказывают на эти процессы значительное влияние (Thiel, et al., 1998). Гиппокампальная холинергическая система может быть также вовлечена в когнитивные процессы, лежащие в основе мотивации (Stancampiano, et al., 1999) Показано, что в гиппокампе крыс, которых помещали в незнакомое окружение (тест в открытом поле), происходит возрастание внеклеточного содержания ацетилхолина в ответ на предъявление незнакомого стимула. У животных с высоким уровнем вертикальной активности обнаружен более интенсивный выброс ацетилхолина в гиппокампе и фронтальной коре по сравнению с животными с более низкой активностью, т. е. повышенная активность ацетилхолинергической системы связана с усилением исследовательской активности и большей чувствительностью к предъявлению нового стимула. При адаптации к новизне снижения выброса ацетилхолина не происходит (Thiel, et al., 1998; Thiel, et al., 1999). Гиперактивность и стереотипные движения можно индуцировать введением скополамина в гиппокамп, фронтальную кору. (Mathur, et al., 1997). Таким образом, можно говорить о важной роли ацетилхолинергической системы в исследовательской активности, формировании ответа на предъявление нового стимула, а также в механизмах адаптации в незнакомом окружении.

Предполагается, что существует корреляция между гиперактивностью и объемом рабочей памяти: крысы, поведение которых оценивалось как гиперактивное, хуже выполняли задачи, тестирующие рабочую память, чем крысы с более низкой активностью (Dellu-Hagedorn, 2006).

Влияние эпилептического статуса на поведение, процессы обучения и памяти.

В результате пролонгированной эпилептической активности многие структуры мозга, ответственные за процессы обучения и памяти, могут подвергаться повреждениям. При этом важнейшие для обработки и хранения информации структуры, такие как гиппокамп, наиболее значительно повреждаются в результате ЭС. Таким образом, ЭС может вызвать не только эпилептогенез, но и значительные нарушения когнитивных функций.

Нарушения обучения и памяти у пациентов с височной эпилепсией связывают с гиппокампальным склерозом, причем степень нарушения некоторых типов памяти коррелирует с объемом левого гиппокампа. По-видимому, в нарушении памяти также играет роль асимметрия правого и левого гиппокампа (Lencz, et al., 1992; Kalviainen, et al., 1998; Martin, et al., 2001).

Пилокарпиновый ЭС y взрослых крыс приводит к развитию поведенческих нарушений и нарушений памяти уже до появления первых спонтанных судорог. При этом нарушения когнитивных функций слабо коррелируют с последующим эпилептогенезом. Было также показано, что в хроническую фазу после ЭС крысы хуже обучались в восьмилучевом лабиринте, т. е. у них наблюдалось выраженное нарушение пространственной памяти (Leite, et al., 1990). При этом известно, что степень повреждения гиппокампа хорошо коррелирует с нарушениями пространственного обучения в радиальном лабиринте и лабиринте Морриса (Morris, et al., 1982).

Одной из причин нарушений памяти способности к обучению являются повреждения гиппокампа и связанных с ним структур в результате повышенной активацией NMDA-рецепторов во время эпилептической активности (Rice, et al., 1998; Hort, et al., 1999). Применение нейропротекторов до некоторой степени уменьшает нарушения обучения и памяти, однако для проявления этого эффекта, по-видимому, необходимы препараты с достаточно мощным нейропротекторным действием, так как частичная нейропротекция практически не предотвращает развитие таких нарушений (Halonen, et al., 2001; Brandt, et al., 2006).

Депрессия и эпилепсия.

Давно известно, что некоторые типы эпилепсии часто сопровождаются депрессивными расстройствами. Эпидемиологические исследования показали, что у лиц, страдающих эпилепсией, в четыре-пять раз выше риск развития депрессии, и в пять раз выше частота суицидов, чем в целом по популяции. Особенно часто депрессия диагностируется у тех пациентов, у которых эпилептические приступы плохо контролируются противоэпилептическими препаратами (Kanner, Nieto, 1999; Kanner, et al., 2010). Депрессия является одним из самых распространенных заболеваний, сопутствующих эпилепсии височной доли. У пациентов с височной эпилепсией и мезиальным склерозом депрессивные расстройства диагностируются в 20—40% случаев, а среди пациентов с фармакорезистенной височной эпилепсией доля случаев, сопровождающихся депрессией, может составлять до 70%. При этом вероятность депрессивных расстройств выше у пациентов с часто повторяющимися приступами и с большой длительностью заболевания (Swinkels, et al., 2006).

Модели судорог у животных могут применяться для исследования ассоциированных с эпилепсией депрессивных расстройств. Депрессивное поведение отмечается у крыс с повторяющимися спонтанными судорогами, развивающимися после ЭС (модель эпилепсии височной доли), а также у крыс после электрического и химического киндлинга и у крыс с генетически обусловленной абсансной эпилепсией (Epps, Weinshenker, 2012). На литий пилокарпиновой модели было обнаружено, что у крыс с височной эпилепсией наблюдаются признаки депрессии, такие как ангедония и отчаяние, нарушение регуляции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и нарушение серотонинэргических связей между ядрами шва и гиппокампом (Pineda, et al., 2010). Показано, что блокада рецепторов IL-lp подавляет появление признаков депрессии у крыс с хронической эпилепсией после ЭС без воздействия на частоту спонтанных судорог. Таким образом, IL-1(3 участвует в механизмах развития депрессии, ассоциированной с эпилепсией (Mazarati, et al., 2010).

Механизмы развития депрессивных расстройств при эпилепсии и осуществления взаимосвязи между этими патологиями в настоящее время остаются невыясненными. Модели депрессивных расстройств, ассоциированных с депрессией, могут помочь выяснить, какие процессы происходят при развитии депрессии, однако адекватность таких моделей также требует дальнейших исследований.

Магнитно-резонансная томография (MPT).

В настоящее время накоплено большое количество данных, свидетельствующих о том, что продолжительная эпилептическая активность приводит к гибели нейронов в различных структурах мозга в результате некроза и апоптоза (Meldrum, et al., 1973; Ben-Ari, 1985; Fujikawa, et al., 2000). Так как продолжительную эпилептическую активность при ЭС можно рассматривать как повреждающий фактор, инициирующий каскад процессов, приводящих к патологическим изменениям, развивающимся в течение длительного времени, таким как нейродегенерация и эпилептогенез, изучение динамики структурных изменений в головном мозге является особенно важным. Для того, чтобы отслеживать динамику этих изменений в течение длительных периодов времени, необходимы достаточно чувствительные неинвазивные методы, позволяющие оценивать структурные изменения в тканях мозга.

Метод МРТ является удобным неинвазивным прижизненным методом изучения структур головного мозга. Кости черепа практически прозрачны для радиочастотного излучения, а получаемые изображения оптимальны по контрасту для мозга и мягких тканей, что позволяет использовать метод для визуализации структурных изменений мозга. В клинике МРТ применяется как мощный метод диагностики, позволяющий выявлять разнообразные патологии, такие как интракраниальные опухоли, последствия ишемии головного мозга, инсульта, а также патологии позвоночника, сердечно-сосудистой системы. Томографы для малых животных с высоким разрешением позволяют проводить исследование изменений с течением времени различных структур в хронических экспериментах (Хауссер, Кальбитцер, 1993; Kherlopian, et al., 2008).

Физические основы метода.

В основе метода MRI лежит явление ядерного магнитного резонанса (ЯМР), впервые продемонстрированное Rabi с соавт. в 1939 г. В 1949 г. F. Bloch и Е. Pursell независимо друг от друга показали возможность магнитного резонанса в крупных объектах.

Элементы ядра атома обладают собственным магнитным моментом. Если наложить внешнее магнитное поле Во, то протоны будут ориентированы по направлению или против направления этого поля и вращаться вокруг направления поля (такое движение называется прецессией). При этом протоны будут приобретать.

29 более высокую энергию, если они ориентированы по направлению поля, и более низкую, если они ориентированы против направления поля. Число протонов с более низкой энергией будет превышать число протонов с более высокой энергией. Вследствие этого произойдет возникновение суммарного магнитного момента, ориентированного параллельно направлению внешнего поля. Для измерения величины магнитного момента необходимо ориентировать вектор магнитного момента М перпендикулярно направлению внешнего магнитного поля. Для этого используют явление резонанса, возбуждая протоны исследуемого объекта радиочастотным импульсом. При этом происходит переход протонов, находящихся на низкоэнергетическом уровне, на высокоэнергетический уровень. После прекращения действия излучения протоны возвращаются на исходный энергетический уровень, испуская полученную ими энергию окружающей структурной решетке. Время релаксации Т1 является константой, характеризующей среднее время пребывания протона на высокоэнергетическом уровне. За это время происходит восстановление продольной намагниченности до 63% от исходной. Одновременно происходит поперечная релаксация, заключающаяся в нарушении синхронизации прецессии, приводящем к уменьшению поперечной намагниченности. Время релаксации Тг характеризует расфазировку спинов, отклоненных под определенным углом от направления постоянного магнитного поля. Ко времени Тг поперечная намагниченность уменьшается на 69%.

Время продольной релаксации Т1 при постоянной температуре зависит от подвижности молекул, размера молекул, присутствия парамагнитных ионов и молекул. Подвижные небольшие молекулы имеют большее время продольной релаксации, чем крупные молекулы. Молекулы воды, связанные с белковыми, липидными и другими крупными органическими молекулами, имеют большую продолжительность продольной релаксации по сравнению с молекулами свободной воды.

Время поперечной релаксации Тг зависит от степени гомогенности внешнего магнитного поля и локальных магнитных полей в исследуемом объекте, напряженности магнитного поля, температуры, подвижности спинов, молекулярного окружения спинов, т. е. присутствия макромолекул, парамагнитных ионов или молекул или других препятствий.

У небольших подвижных молекул Тг больше, чем у крупных молекул, т.к. магнитные поля небольших молекул быстрее усредняются, синхронность прецессии сохраняется дольше.

В подвижных жидкостях значение Тг близко к значениям Ть в то время как в среде с большой вязкостью время релаксации Т2 значительно укорачивается по сравнению с временем релаксации Ть Продольная релаксация в живых тканях имеет длительность от нескольких секунд (свободная вода) до 150−250 мс (липиды, белки). Поперечная релаксация имеет длительность 30−500 мс.

Измеряемой величиной является намагниченность ядер определенного типа в определенном элементе объема (спиновый отклик на переменное магнитное поле). Наблюдаемый сигнал ЯМР в тканях определяется в основном протонами воды и других небольших протонсодержащих молекул. Вклад дают также молекулы, обладающие большой подвижностью, такие как липиды. Вклад молекул в суммарный сигнал пропорционален их концентрации. Поэтому интенсивность сигнала этих тканей будет в значительной степени зависеть от содержания воды в этих тканях. Существенным параметром является время спиновой релаксации, величина которого свидетельствует о взаимодействии молекул воды с молекулярными компонентами клетки. Обычно спиновый ответ зависит от всех трех параметров: спиновой плотности р, времени продольной Ti и поперечной Т2 релаксации. Поэтому ткани, однородные по какому-либо одному параметру могут различаться по другим параметрам, что увеличивает возможности разрешения по контрасту этого метода. Важным преимуществом MRI является также то, что в нем не используются ионизирующие излучения. Клинические томографы имеют пространственное разрешение порядка 1 мм, томографы для животных — менее 100 мкм. (Хауссер, Кальбитцер, 1993; Kherlopian, et al., 2008).

Построение MP-томограммы.

Для создания изображения на основе получаемого сигнала необходимо знать, из какой точки исходит сигнал. Для локализации сигнала применяют градиентные магнитные поля, однообразно изменяющиеся вдоль осей х, у и z. Градиентные магнитные поля создают разброс резонансных частот в зависимости от пространственных координат.

Для регистрации сигнала в присутствии градиентных полей применяют различные последовательности радиочастотных импульсов (импульсных последовательностей). Наиболее часто используется метод спинового эха. Термин «спиновое эхо» применяется для обозначения импульсных последовательностей, в которых 180° радиочастотный импульс воздействует на объект через определенное время после 90° радиочастотного импульса. За это время происходит расфазировка прецессирующих спинов. Воздействие 180° радиочастотного импульса вызывает рефазировку спинов и восстановление намагниченности, которое приводит к возникновению эхо-сигнала. Амплитуда эхо-сигналов отражает спин-спиновую релаксацию образца. Количество информации, получаемой при помощи последовательности спин-эхо можно увеличить, если использовать серию импульсов, создающую множественные эхо-сигналы (мульти-эхо). На последовательности мульти-эхо основана последовательность RARE (Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement), которая позволяет значительно сократить время, требуемое на сбор информации для построения томограммы (Ринкк, 2003).

Построение изображения может осуществляться в режимах Ti и Тг (т.е., ТУ и Т2-взвешенные изображения), а также изображения, взвешенные по спиновой плотности (протонно-взвешенные или р-взвешенные). Эти изображения не являются расчетными изображениями, отражающими истинное значение Ti, Т2 или протонной плотности, а зависят от всех трех параметром с преобладанием какого-либо одного.

Интенсивность сигнала в каждом пикселе на экране пропорциональна степени магнетизации в данной единице объема — вокселе. Максимальная интенсивность сигнала соответствует белому цвету, минимальная — черному. Разные ткани в пределах одного воксела на экране неразличимы, поэтому необходимо подобрать оптимальный размер воксела для предотвращения значительного искажения структуры тканей или же избыточного объема информации.

При построении MP-изображения возможно получать изображения в любых плоскостях за счет применения градиентных магнитных полей, накладываемых на внешнее магнитное поле вдоль координатных осей (Гусев, др., 2000).

Применение МРТ в диагностике и исследовании эпилепсии.

До появления методов прижизненной визуализации структур головного мозга изучение их изменений было возможно только после смерти пациента. С внедрением в 80-х годах XX века методов компьютерной томографии (КТ) и магнитно-резонансной томографии (МРТ) в клиническую практику стало возможным исследовать мозг пациентов, страдающих неврологическими нарушениями, в том числе, эпилепсией, на наличие патологий.

В настоящее время МРТ является рутинным методом при обследовании пациентов с черепно-мозговыми травмами, опухолями, гидроцефалией, кортикальной дисплазией, мезиальным височным склерозом. Показания к проведению МРТ есть у пациентов с судорогами для выявления возможных патологий мозга и эпилептогенного очага при фокальных эпилепсиях (Алиханов, et al., 2010; Malmgren, Thom, 2012). В клинической практике применяют МРТ-сканнеры с постоянным магнитным полем 1,5 или ЗТ, для исследовательских целей существуют томографы с полем 7 Т, которые позволяют получать изображения с более высоким разрешением. МРТ является более чувствительным методом по сравнению с КТ.

Особенное значение имеет МРТ-диагностика пациентов с фармакорезистентными эпилепсиями, которым показано проведение хирургического вмешательства. Выявление структурных изменений на МРТ совместно с данными ЭЭГ-исследований иктальной и интериктальной эпилептической активности позволяет оперировать больного без дальнейших инвазивных исследований. Показано, что приблизительно у 72—83% детей с фармакорезистентными эпилепсиями при МРТ-исследовании выявляются глиозные рубцы, арахноидальные кисты, диспластические изменения коры (Алиханов, et al., 2010; Маматханов, et al., 2011).

У взрослых пациентов с фармакорезистентной эпилепсией наиболее частой патологией, выявляемой при гистологическом исследовании мозга, является склероз гиппокампа. Было обнаружено, что МРТ-исследование способно выявить склероз гиппокампа у таких пациентов. При этом признаками гиппокампального склероза, выявляемыми на МРТ, является усиление Тг-сигнала в области гиппокампа на Т2-взвешенных изображениях, уменьшение гиппокампального объема, нарушение архитектуры структур мозга (Jackson, et al., 1990). Также наблюдаются атрофия серого и белого вещества височной доли и расширения височных рогов боковых желудочков. Гистологические исследования материала, полученного после гиппокампэктомии, показали, что число нейронов в полях СА2, САЗ и СА4 гиппокампа коррелирует с размерами гиппокампа, измеренными по МРТ-изображениям (Bronen, et al., 1991; Lencz, et al., 1992). Кроме того, асимметрия гиппокампа, выявляемая в результате МРТ, наблюдается при фокальной височной эпилепсии, причем редукция гиппокампа наблюдается ипсилатерально эпилептическому фокусу (Lencz, et al., 1992).

Несмотря на наличие явной зависимости между развитием эпилепсии височной доли и гиппокампальным склерозом, до сих пор достоверно не известно, является ли гиппокампальный склероз причиной или следствием эпилептических приступов.

МРТ-исследования мозга пациентов, страдающих семейной мезиальной височной эпилепсией показали, что усиление Тг-сигнала и атрофия гиппокампа наблюдается приблизительно в 70% случаев. При этом атрофия гиппокампа часто наблюдается у пациентов, страдающих семейной височной эпилепсией, но находящихся в ремиссии. Таким образом, у этих больных наличие патологий гиппокампа может быть обусловлено генетически (Kobayashi, et al., 2003). Тем не менее, волюметрические исследования показали, что гиппокампальный объем у пациентов с генерализованными тонико-клоническими судорогами коррелирует с длительностью судорог и возрастом начала эпилепсии (Tasch, et al., 1999).

МРТ-исследования мозга пациентов с височной эпилепсией выявили патологию не только гиппокампа, но и экстрагиппокампальных структур. В передней височной доле пациентов с височной эпилепсией было выявлено усиление Тг-сигнала, уменьшение Ti-сигнала, атрофия серого и белого вещества. При этом не наблюдалось глиоза и диспластических изменений в исследованной области (Mitchell, et al., 1999). Волюметрические исследования показали, что атрофия серого вещества в экстрагиппокампальных структурах прогрессирует со временем. Степень атрофии хорошо коррелирует с временем, прошедшим после выявления эпилепсии (Bonilha, et al., 2006).

Визуальный анализ MP-изображений и волюметрический анализ может быть довольно субъективным и зависеть от квалификации исследователя. Кроме того, контраст изображений может зависеть от параметров, которые устанавливаются при помощи программного обеспечения, используемого при обработке томограмм. Поэтому для повышения надежности результатов используют количественную релаксометрию, которая позволяет получить абсолютные значения времен релаксации, которые являются физическими величинами и не зависят от режима обработки изображений (Cheng, et al., 2012). Так, у 20—30% пациентов с фокальной эпилепсией не удается обнаружить видимых изменений на МРТ-изображениях (Malmgren, Thorn, 2012). Показано, что у пациентов с височной эпилепсией наблюдается увеличение времени релаксации Тг в височной доле как пациентов с атрофией гиппокампа, так и пациентов с нормальным гиппокампальным объемом (Townsend, et al., 2004). При измерении времени релаксации Тг возможно получение значений для различных исследуемых областей мозга, которые выделяют вручную при проведении обработки Тг-карт. Другим подходом является статистическое сравнение Тг-карт с выделением областей с наибольшим временем релаксации Тг. Этот метод позволяет проводить более объективную оценку различий между.

34 пациентами и может применяться при автоматизированном анализе больших объемов данных (Pell, et al., 2004).

Возможности изучения механизмов, лежащих в основе эпилепсии, значительно расширились с появлением томографов для малых животных. В настоящее время существуют томографы с магнитным полем 7—14Т, позволяющие получать детальные изображения мозга крыс и мышей. На экспериментальных моделях также можно исследовать динамику изменений в различных структурах мозга в результате эпилепсии и эпилептического статуса, проводить волюметрический анализ, измерять времена релаксации в различных структурах. Накопленные данные свидетельствуют о том, что в ряде моделей, таких как пилокарпиновый эпилептический статус, изменения в мозге, выявляемые на МРТ, хорошо соотносятся с известными клиническими данными. Так, развитие у крыс хронической эпилепсии сопровождается уменьшением объема гиппокампа и увеличением времени релаксации Т2 в гиппокампе и ассоциированных структурах (Pitkanen, et al., 2002; Roch, et al., 2002; Andre, et al., 2007).

Таким образом, MPT является важным методом диагностики гиппокампального склероза и других ассоциированных с эпилепсией структурных нарушений мозга. Длительные мультипараметрические МРТ-исследования динамики изменений в структурах мозга больных эпилепсией дают возможность получить данные, которые можно применять не только для диагностики и лечения, но и для более полного исследования структурных изменений мозга, лежащих в основе эпилепсии.

Антиэпилептические препараты — нейропротекторы.

Применение препаратов с нейропротекторным действием долгое время считалось ключевой стратегией предотвращения патологических последствий ЭС, проявляющихся в хроническую фазу. Тем не менее, было обнаружено, что даже значительное подавление нейродегенерации в гиппокампе не предотвращает развитие хронической эпилепсии (Ebert, et al., 2002; Brandt, et al., 2003). По-видимому, нейродегенерация не является основной причиной эпилептогенеза. Несмотря на неэффективность многих исследованных нейропротекторных препаратов против развития хронической эпилепсии, применение нейропротекторов все же может предотвращать развитие когнитивных и поведенческих нарушений (Brandt, et al., 2006).

Основной стратегией предотвращения повреждений мозга в результате ЭС является своевременное подавление судорожной активности с помощью противоэпилептических препаратов, причем начинать купирование судорог необходимо не позднее 5−10 мин от их начала. Препаратами первого выбора при генерализованном судорожном ЭС обычно являются бензодиазепины — диазепам, мидазолам, лоразепам, клоназепам. Однако бензодиазепины обладают серьезными побочными эффектами — подавляют дыхательную активность и деятельность сердечно-сосудистой системы. Кроме того, при продолжительном ЭС развивается резистентность к бензодиазепинам, поэтому препараты этой группы наиболее эффективны для применении в течение короткого времени после начала ЭС. В 2035% случаев бензодиазепины оказываются неэффективными и тогда применяются фенитоин (дифенин), фосфенитоин, вальпроат. В третью очередь возможно применение фенобарбитала. Если 2−3 применяемых препарата оказываются неэффективными в течение 1ч, ставится диагноз рефрактерного ЭС, который, характеризуется неблагоприятным прогнозом, т.к. сопровождается длительным периодом восстановления и высокой смертностью. Если применяемые методы лечения не дают результата, используют сверхдлительный наркоз совместно с миорелаксантами и искусственной вентиляцией легких (Карлов, 2003).

Для многих препаратов, применяемых в качестве антиконвульсантов, был показан собственно нейропротекторный эффект. Наибольшее количество исследований было проведено на экспериментальных моделях инсульта. Предотвращение гибели нейронов в результате ЭС при экспериментальной эпилепсии изучено значительно меньше (Pitkanen, Kubova, 2004).

Механизмы действия антиэпилептических препаратов разнообразны. В частности, диазепам связывается со специфическим сайтом на ГАМКд рецепторе, изменяя его конформацию, модулируя, таким образом, активность рецептора и усиливая вызванный связыванием ГАМК с рецептором ток ионов хлора через ионные каналы (Baur, Sigel, 2005). Другие противоэпилептические препараты (фелбамат, фенитоин, топирамат, габапентин, прегабалин, ламотриджин и окскарбазепин) обладают способностью ингибировать Са2+ каналы различного типа, предотвращая избыточное повышение внутриклеточной концентрации Са2+ в нейронах, и блокируя, таким образом, ключевой этап процессов, ведущих к клеточной гибели (Pitkanen, Kubova, 2004).

Диазепам. В ряде работ показана возможность частичного нейропротекторного действия классического противоэпилептического препарата диазепама. На модели глобальной ишемии обнаружено, что диазепам может проявлять кратковременное нейропротекторное действие.

Введение

диазепама песчанкам после ишемии вызывало задержку гибели нейронов в поле СА1 гиппокампа до 3 дней после ишемии (Corbett, et al., 2008).

Введение

диазепама после пролонгированных судорог, индуцированных каинатом, приводило к снижению повреждений нейронов амигдалы, пириформной и эндопириформной коры, но не гиппокампа (Qashu, et al., 2010). Такой эффект диазепама может быть связан с его антиконвульсантным действием, а не с прямым нейропротекторным эффектом. При ЭС, индуцированном электростимуляией миндалины, введение диазепама через 2−3 часа после начала судорог, частично предотвращает гибель нейронов в гиппокампе, при этом применение диазепама уменьшает вероятность дальнейшего развития спонтанных судорог, а в случае развития хронической эпилепсии приводит к снижению частоты спонтанных судорог. Однако применение диазепама, по-видимому, эффективно только не позже, чем через 2 ч после начала судорог, т.к. уже через 3 ч его эффективность значительно уменьшается (Pitkanen, et al., 2005).

Вальпроат. Еще одним противоэпилептическим препаратом с нейропротекторными свойствами стал вальпроат, который уже длительно применяется в качестве антиконвульсанта и при терапии маниакально-депрессивных состояний (Richens, Ahmad, 1975; Ramsay, 1984). Описано несколько механизмов действия вальпроата на возбудимость. Вальпроат потенциирует ГАМК-ергическую систему посредством ингибирования вальпроатом ГАМК-трансаминазы и других ферментов, участвующих в метаболизме ГАМК в мозге, что приводит к резкому возрастанию содержания ГАМК. В то же время, вальпроат подавляет синтез глутамата и глутаматергическую синаптическую передачу Таким образом, вальпроат приводит к сдвигу баланса возбудительных и тормозных медиаторов в мозге, снижая возбудимость нейронов и подавляя эпилептическую активность. Также хорошо изученным является ингибирование вальпроатом потенциалзависимых натриевых каналов и подавление их экспрессии (Johannessen, Johannessen, 2003).

В ряде работ было показано наличие нейропротекторных свойств вальпроата in vivo и in vitro (Bolanos, et al., 1998; Morland, et al., 2004; Brandt, et al., 2006).

Введение

вальпроата сразу после ЭС, и затем в течение нескольких недель приводило к снижению гибели нейронов в гиппокампе, включая зубчатую извилину (Bolanos, et al., 1998; Brandt, et al., 2006). Однако этот эффект вальпроата не влиял на развитие.

37 спонтанных судорог в результате ЭС. Тем не менее, применение вальпроата приводило к заметному уменьшению нарушений обучения и памяти, снижало гипервозбудимость и локомоторную активность крыс, перенесших ЭС (Brandt, et al., 2006).

Вальпроат активирует ряд протеинкиназ, включая РКВ и МАРК, осуществляя таким образом регуляцию киназных сигнальных каскадов, опосредующих выживание нейронов, а также процессы, связанные с нейрональной пластичностью (Monti, et al., 2009).

Интересен также эффект вальпроата на деацетилазы гистонов, которые участвуют в регуляции экспрессии генов. Вальпроат в терапевтических дозах является мощным ингибитором деацетилаз гистонов и приводит к активации экспрессии различных генов (Phiel, et al., 2001). Было показано, что ингибирование вальпроатом деацетилазы гистонов предотвращает патологический нейрогенез в гиппокампе крыс, индуцированный каинатными судорогами, а также развитие у этих крыс нарушений памяти (Jessberger, et al., 2007).

Влияние вальпроата на сигнальные каскады и экспрессию генов, по-видимому, лежит в основе большого спектра его эффектов, включая нейропротекторный эффект и предотвращение развития нарушений обучения и памяти.

Топирамат. Топирамат — относительно новый противоэпилептический препарат, подавляющий эпилептическую активность как в экспериментальных моделях, так и при клинических испытаниях. Топирамат не купирует ЭС, однако на экспериментальных моделях показано, что введение топирамата после перенесенного ЭС частично предотвращает гибель нейронов в полях СА1 и САЗ гиппокампа (Niebauer, Gruenthal, 1999; Kudin, et al., 2004; Rigoulot, et al., 2004). Однако повреждение этих областей, по-видимому, не является критическим для последующего эпилептогенеза (Ebert, et al., 2002; Rigoulot, et al., 2004) и, несмотря на наличие нейропротекторного эффекта, применение топирамата не препятствует возникновению спонтанных судорог после ЭС.

Хотя для некоторых противоэпилептических препаратов показано наличие нейропротекторных свойств, не все из них способны действительно эффективно предотвращать гибель нейронов при проведении терапии после эпилептического статуса. В то же время, ни топирамат, ни вальпроат, предотвращающие гибель нейронов в гиппокампе, не оказывают влияние на дальнейшее развитие эпилепсии. Так как большинство применяемых противоэпилептических препаратов обладает рядом побочных эффектов, поиск новых препаратов с нейропротекторным действием остается актуальным.

Эффекты гликозидов женьшеня.

Большая группа веществ растительного происхождения, интересных с точки зрения фармакологии, представлена гликозидами — органическими соединениями, молекулы которых состоят из двух частей: углеводного (пиранозидного или фуранозидного) остатка и неуглеводного фрагмента (агликона). Определенный интерес представляют гликозиды женьшеня настоящиго (Panax ginseng С.А. Meyer) и родственного ему американского женьшеня (Panax quinquefolius L.). Это нейтральные гликозиды, называемые гинзенозидами, содержащие в качестве агликона тетрациклические тритерпеноиды — панаксадиол и панаксатриол, а также олеаноловую кислоту. Углеводные цепи содержат от 3 до 6 моносахаридных остатков. Для многих гинзенозидов показан широкий спектр эффектов на центральную нервную систему, в том числе, ноотропный, нейропротекторный и противосудорожный. Гинзенозиды Rgl и Rbl и Rh2 обладают ноотропным эффектом и способны препятствовать развитию у крыс когнитивных нарушений, вызванных антагонистом ацетилхолина — скополамином (Wang, et al., 2010).

Нейропротекторный эффект выделенных из женьшеня гинзенозидов широко изучается на разнообразных моделях повреждения нейронов in vitro. Было обнаружено, что некоторые из гинзенозидов, включая Rbl, Rgl, Rg3, Rd, способны предотвращать гибель нейронов в клеточных культурах. Гинзенозиды Rbl и Rgl оказывали нейротрофическое и на некоторых моделях нейропротекторное действие на культуры гиппокампальных клеток (Rudakewich, et al., 2001). Также был показан дозозависимый нейропротекторный эффект гинзенозидов Rbl и Rgl, но не Re, на in vitro модели повреждения нейронов спинного мозга (Liao, et al., 2002). Гинзенозид Rd предотвращал индуцируемый глутаматом апоптоз нейронов в культуре клеток коры головного мозга крысы и предотвращал гибель нейронов культуры клеток гиппокампа в условиях недостатка глюкозы и кислорода (Ye, et al., 2008; Li, et al., 2010).

Результаты, полученные в экспериментах на культурах клеток, в ряде случаев подтверждаются исследований in vivo на моделях различных патологий ЦНС. Так, центральное введение гинзенозида Rbl препятствовало гибели нейронов зоны CAI гиппокампа, вызванной ишемией, а также препятствовало развитию ишемического очага на модели ишемического инсульта у приматов (Lim, et al., 1997; Yoshikawa, et al., 2008). Было показано, что хроническое введение гинзенозидов снижало гибель нейронов в зонах CAI и САЗ гиппокампа, индуцированную каинатом (Lee, et al., 2002).

Получены свидетельства противосудорожных эффекттов гинзенозидов. На нескольких моделях судорог показано, что предварительное введение экстракта, содержащего Rbl, Rb3, Rd, вызывало увеличение латентного периода развития судорожной активности. Происходило замедление развития ЭС, индуцируемого пилокарпином, каинатом, а также судорог, вызываемых пентилентетразолом.

Введение

экстракта приводило к облегчению протекания ЭС, инициированного пилокарпином и каинатом, и уменьшало длительность судорог, инициируемых пентилентетразолом (Lian, et al., 2005).

Ряд экспериментов in vitro позволил сделать несколько предположений о возможных механизмах антиконвульсантного и нейропротекторного действия гинзенозидов. Экстрагированные из женьшеня сапонины, в частности, гинзенозиды Rg3, и Rgl, ингибируют NMDA рецепторы нейронов гиппокампа и оказывают нейропротекторный эффект на нейроны культуры клеток гиппокампа, снижая внутриклеточную концентрацию Са2+ (Kim, Rhim, 2004; Zhang, et al., 2008). Также было показано ингибирующее действие гинзенозида Rf на Са2+ каналы N-типа, ответственные за выброс медиатора из сенсорных нейронов (Nah, et al., 1995). Предполагется, что антиоксидантные свойства некоторых компонентов женьшеня могут играть роль в защите нейронов от гибели при различных патологических состояниях, таких как ишемическое повреждение мозга. Так, было показано, что гинзенозиды Rbl, Rd, а также смеси гинзенозидов, выделенные из Р. ginseng и Р. quinquefolius могут оказывать защитный эффект на нейроны в моделях окислительного стресса in vitro (Ye, et al., 2008).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Литий-пилокарпиновая модель ЭС.

LiCl (Lithium Chloride, Acros Organics), растворенный в физиологическом растворе, вводили внутрибрюшинно за 24 часа до HCl эксперимента для потенциации действия пилокарпина из расчета 127 мг/кг (3 ммоль/кг).

Рис. 1. Пилокарпина гидрохлорид Для инициации судорог вводили 3.

QH внутрибрюшинно пилокарпина гидрохлорид (Pilocarpine 3 hydrochloride, Acros Organics) из расчета 40 мг/кг, О О растворенный в физрастворе. Для наблюдения крыс помещали в пластиковые боксы с прозрачными стенками сн о сн3 (25×30×25 см). Отмечали время начала судорожной 3 ^ активности (3−4 стадии) — латентный период;

Рис. 2. Паральдегид эпилептический статус наблюдали в течение 2 часов. Тяжесть судорог оценивали с помощью модифицированной пятибалльной шкалы, табл.1. Через 2 часа после начала ЭС судороги купировали паральдегидом (Paraldehyde, Acros Organics, 0,6 мл/кг внутрибрюшинно). После купирования ЭС каждому животному внутрибрюшинно вводили по 5 мл 5% раствора глюкозы.

Таблица 1. Шкала для оценки тяжести судорог при ЭС (Racine, 1972).

Балл Поведенческие проявления судорог.

0 Нормальное поведение животного.

1 Абнормальное поведение животного (замирание, затаивание), жевание, отдельные вздрагивания головы.

2 Атипичные миоклонические судороги головы.

3 Клонические судороги конечностей и тела.

3,5 Сильные клонические судороги конечностей и тела с отрывом обеих конечностей от пола.

4 Поза «кенгуру»: клонические судороги конечностей, тонические судороги тела.

5 Тяжелые тонико-клонические судороги с потерей позы.

Схема эксперимента представлена на рис. 3.

Л'-і у У LiCI, 127мг/кг.

24 часа.

Пилокарпин, 40 мг/кг НННш І^НІІННННІ.

Рис. 3. Схема эксперимента с использованием литий-пилокарпиновай модели эпистатуса.

Магнитно-резонансная томография.

Процедура МРТ-исследования.

МРТ-исследование мозга крыс проводили в томографе для малых животных Bruker BioSpec 70/30 (Bruker, Германия) с программным обеспечением ParaVision 5.0 в лаборатории магнитной томографии и спектроскопии факультета фундаментальной медицины МГУ. Характеристики томографа:

• постоянное магнитное поле Во = 7.05 Тл;

• диаметр отверстия 310 мм;

• свободный доступ для генерации изображений 154 ммчастота переменного магнитного поля 50 ГГц;

• максимальное разрешение 200 мкм.

Для проведения МРТ-исследования крысам внутрибрюшинно вводили 300−350 мг/кг хлоралгидрата (Chloralhydrate, Sigma). Наркотизированных животных помещали в «кроватку», оборудованную держателями для зубов и ушей для фиксации головы и системой подогрева, обеспечивающей поддержание постоянной температуры тела животного во время эксперимента. На голове крысы закрепляли приемную катушку и помещали «кроватку» с крысой в катушку прибора. МРТ-исследование проводили в двух режимах: T2-RARE для получения Т2-взвешенных изображений с высоким разрешением и Т2-тар (Т2-карта) для проведения количественного МРТ-исследования.

Режим T2-RARE.

Т2-взвешенные изображения с высоким разрешением получали в режиме Т2-RARE. В этом режиме используется импульсная последовательность RARE, которая позволяет быстро получать изображения с хорошим разрешением и контрастом. Время проведения исследования в этом режиме составляло 3 мин. 15 с. Построение изображения осуществлялось в матрице 156×156 пикселей с захватом поля 26×26 мм. Разрешение изображения составляло 167 мкм/пиксель.

В результате исследования получали серии томографических срезов мозга крысы во фронтальной проекции, начиная от мозжечка и заканчивая обонятельными луковицами. Расстояние между плоскостями срезов составляло 1 мм, толщина срезов — 0,5 мм.

Режим Т2-тар

Режим Т2-тар применяли для построения Т2-карт, представляющих собой серии томографических срезов, полученных с разным временем эхо ТЕ. Этот режим необходим для проведения количественного МРТ-исследования, когда требуется измерить значения времени релаксации Т2 в разных участках исследуемого образца. Для измерения времени поперечной релаксации Т2 необходимо учесть, что МР-сигнал (S) протонов зависит от ТЕ по следующей формуле (1):

S (T2,TE) ~ р[ехр (-ТЕ/Т2)], где р — плотность спинов в исследуемой зоне (1).

Таким образом, если построить график зависимости S от ТЕ, можно вычислить время поперечной релаксации Т2. В работе были выбраны следующие значения ТЕ: 16 мс, 32 мс, 50 мс, 66 мс, 82 мс, 100 мс, 116 мс, 132 мс, 150 мс, 166 мс, 182 мс, 200 мс, 216 мс, 232 мс, 250 мс, 266 мс.

Время сбора сигнала для построения Тг-карты составляло 11 мин. В результате получали серии томографических срезов мозга крысы во фронтальной проекции с расстоянием между плоскостями срезов в 1 мм.

Обработка результатов МРТ-исследования.

Т2-взвешенные изображения с высоким разрешением.

Для обработки полученных Тг-взвешенных изображений мозга крыс использовали программу Image J. При получении томограммы осуществляется построение изображения из точек — пикселей, отличающихся по сигналу от соответствующих им областей в исследуемой ткани. Чем больше сигнал в данной области, тем светлее пиксели на изображении. Области с пониженным сигналом выглядят черными. У крыс, перенесших ЭС, изменения структур мозга носили диффузный характер и в основном проявлялись в виде областей с повышенным сигналом, которые выглядели светлее нормальных тканей. Степень повреждения мозга оценивали по площади участков с усиленным сигналом. Участки с усиленным сигналом выделяли по яркости пикселей, вручную устанавливая пороговое значение яркости. Затем производили подсчет площади выделенных областей.

Для оценки степени общего повреждения мозга подсчитывали суммарную площадь выделенных областей на 12 срезах, захватывая область мозга от АР -7,3 до АР +4 от брегмы (Paxinos, Watson, 1998).

Измерение объема гиппокампа.

Объем гипокампа оценивали путем измерения площади зон, соответствующих гиппокампу на томографических срезах, полученных в режиме T2-RARE. Измерение площади гиппокампа на срезе производили в программе Image J. При измерении выделяли зоны на срезах, соответствующие гиппокампу, включая субикулюм (Paxinos, Watson, 1998).

Обработка Т2-карт.

Для получения значений времени релаксации Тг в различных структурах мозга полученные Тг-карты обрабатывали с помощью программного обеспечения ParaVision 5.0 (Bruker, Германия). Подсчет времени Тг производился с помощью сертифицированной программы Image Sequence Analysis. Для этого сначала на МРТ-изображении были выбраны области для измерения. Затем программа по формуле (1) осуществляла построение зависимости S (TE) и рассчитывала численное значение Т2 и погрешность измерения. Время релаксации Т2 — это физическая величина, которая зависит от микровязкости среды и ее состава: чем выше подвижность спиновой системы, тем больше время Т2. В первом приближении можно считать, что увеличение времени релаксации Т2 в исследуемых структурах и усиление сигнала, обнаруживаемое на MP-томограммах, связано с увеличением содержания и подвижности воды в исследуемой ткани.

Были выбраны следующие области для исследования: дорсальный и вентральный гиппокамп, теменная кора, энторинальная кора, ретросплениальная кора, поясная кора, пириформная кора, миндалина, таламус. Выбранные зоны выделяли вручную. Затем программа осуществляла подсчет времени релаксации в выбранных зонах на основе полученных Т2-карт мозга крыс. Исследуемые области, в которых было проведено измерение времени релаксации Т2, представлены на рис. 2 и рис. 3. Подсчет времени релаксации Т2 осуществляли отдельно для правого и левого полушария.

Рис. 2. Исследуемые области, в которых производился подсчет времени релаксации Т2. 1- вентральный гиппокамп- 2 — теменная кора- 3 — энторинальная кора- 4 -дорсальный гиппокамп- 5 — ретросплениальная кора- 6 — пириформная кора- 7 -миндалина- 8 — таламус. Ф I.

Рис. 3. Области, включающие правую и левую поясную кору, в которых производился подсчет времени релаксации Т2.

Исследование отставленного эффекта длительной судорожной активности при ЭС: поведенческие нарушения.

Поведенческие тесты проводили через 5 недель после ЭС, через неделю после последнего МРТ-исследования, проводившегося на 30 день после ЭС.

Адаптация в открытом поле.

Для проведения эксперимента в открытом поле (ОП) крыс помещали в круглую арену с серым полом, расчерченным на 7 центральных и 12 периферических секторов. Диаметр арены составлял 97 см, высота стенок — 42 см. Во время эксперимента арену освещали красным светом. Каждую крысу помещали в центр арены и фиксировали ее поведение в течение 5 мин с помощью видеокамеры, а также в письменный протокол. После каждого животного пол арены тщательно очищали 10% раствором этанола. Для исследования адаптации к новизне для каждой крысы было проведено три 5-минутные сессии в открытом поле с интервалом в 24 часа. Полученные записи обрабатывали при помощи программы 11еаШтег (ОрепБаепсе, Россия). При оценке поведения в открытом поле отмечали количество и среднюю и суммарную длительность стоек и груминга, количество пересеченных центральных и периферических квадратов, умываний, почесываний, а также болюсов.

Тест «принудительное плавние».

При проведении теста «принудительное плавание» (порсольт-тест) крыс помещали в прозрачный цилиндр высотой в 50 см и диаметром 25 см, заполненный.

46 водопроводной водой до уровня 35 см. Температура воды составляла 25±-1ПС. За сутки до эксперимента была проведена тренировочная сессия, в которой крыс помещали в цилиндр с водой на 10 мин. Экспериментальные сессии длились 5 минпосле каждого животного воду в цилиндре заменяли. Поведение крыс регистрировали при помощи видеокамеры. Полученные записи обрабатывали при помощи программы ЯваШтег (ОрепБаепсе, Россия). При обработке учитывали суммарную длительность трех типов поведения: активное плавание (карабканье), при котором крыса совершала активные движения, пытаясь выбраться из цилиндрапассивное плавание, при котором крыса совершала движения, достаточные для поддержания головы над поверхностью воды и перемещения вдоль стенок цилиндразамирание, при котором крыса совершала только минимальные движения для поддержания головы над поверхностью воды.

Тест на вкусовое предпочтение.

За несколько дней до проведения теста крыс рассаживали из клеток в отдельные боксы, оснащенные двумя одинаковыми поилками, чтобы крысы адаптировались к новой обстановке. В первый день эксперимента проводили предварительный тест: в одну из поилок наливали 100 мл водопроводной воды, в другую — 100 мл 1% раствора сахарозы. Через 24 часа измеряли объем жидкости, оставшейся в каждой поилке. После этого снова наливали в них по 100 мл воды или раствора сахарозы. На второй день через 24 часа снова измеряли объем оставшейся жидкости. На третий день повторяли тест, поменяв поилки с водой и раствором сахарозы местами для исключения предпочтения крысами определенной стороны. Подсчитывали среднее потребление воды и раствора сахарозы за второй и третий дни эксперимента и их процентное соотношение. Если крыса потребляла приблизительно поровну воды и раствора сахарозы, считали, что у этого животного отсутствует вкусовое предпочтение.

Исследование нейропротекторного эффекта бутанолового экстракта культуры клеток корня женьшеня и конвенционального противоэпилептического препарата вальпроата.

В работе были использованы взрослые самцы крыс линии Vistar весом 300— 350 г, полученные из питомника ИМБП РАН.

Повреждения мозга, вызываемые длительной эпилептической активностью, были исследованы на модели литий-пилокарпинового эпилептического статуса. За 7 дней до ЭС было проведено МРТ-исследование мозга крыс, участвующих в эксперименте, для исключения возможных патологий структур мозга у этих животных (день 0). Степень повреждений мозга крыс и его динамику оценивали через 2, 7 и 30 дней после ЭС неинвазивным методом, используя МРТ.

Препараты.

Для исследования возможности оценки протекторного эффекта препаратов был выбран бутаноловый экстракт культуры корня женьшеня Д-25 (БИОХИММАШ, Москва) (Константинова, et al., 1995). В используемом экстракте содержались гинзенозиды RgiRe, Rd, Rc, Rbi, Rb2, Rf (50 мг/г сухого экстракта), а также олигои полисахариды.

В качестве конвенционального противоэпилептического препарата, предположительно способного предотвращать повреждение мозга в результате ЭС нами была выбрана вальпроевая кислота (Конвулекс для внутривенного введения, Gerot Pharmazeutika, Австрия). В предварительных экспериментах мы подобрали дозу вальпроата, которую крысы переносили после эпилептического статуса, составившую 150 мг/кг внутрибрюшинно.

Исследование антиконвулъсантного и нейропротекторного эффекта экстракта культуры клеток корня женьшеня.

Антиконвульсантный и нейропротекторный эффект бутанолового экстракта женьшеня исследовали, проводя эксперименты по трем схемам.

В первой серии экспериментов крысам опытной группы вводили экстракт женьшеня (18 мг/кг внутрибрюшинно) ежедневно в течение 4 недель, после чего инициировали ЭС и проводили МРТ исследование головного мозга. Крысы контрольной группы получали эквивалентные объемы физраствора.

Чтобы исследовать собственно нейропротекторный эффект экстракта женьшеня, во второй серии экспериментов препараты вводили однократно через 30 мин после прерывания ЭС паральдегидом. Крысы получали 18 мг/кг или 180 мг/кг бутанолового экстракта женьшеня, либо 150 мг/кг вальпроата внутрибрюшинно. Контрольные крысы (группа ЭС) получали физраствор.

Также был исследован эффект хронического введения экстракта женьшеня на повреждения мозга крысы в результате ЭС. В этой серии экспериментов крысам вводили экстракт женьшеня через 1 час после купирования судорог, а затем в течение 4 недель — ежедневно в дозе 18 мг/кг. Крысы контрольной группы получали эквивалентные объемы физраствора.

Результаты МРТ-исследования мозга крыс всех групп, перенесших ЭС, сравнивали с результатами исследования мозга интактных крыс, которые подвергались тем же манипуляциям, что и крысы из экспериментальных групп, но не получали пилокарпин и не переносили ЭС.

Статистическая обработка результатов.

Статистическая обработка полученных данных была проведена с помощью пакета программ 81айзйса 6.0. Полученные выборки данных были проверены на нормальность распределения. Для анализа достоверности различий между группами применяли^{критерий} Стьюдента для выборок с нормальным распределением и непараметрический и-критерий Манна-Уитни. При анализе динамики изменений статистическую достоверность различий оценивали с помощью 1:-критерия Стьюдента для связанных выборок с нормальным распределением и непараметрический критерий Вилкоксона. При анализе долей в выборках применяли точный критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

выводы.

1. Крысы линии Вистар характеризуются большой индивидуальной вариабельностью по степени и распределению повреждений в структурах мозга (гиппокампе, пириформной коре, миндалине, таламусе), выявляемых при МРТ-исследовании после литий-пилокарпинового эпилептического статуса.

2. Время релаксации Т2, возрастание которого наблюдается в гиппокампе крыс в острый период после ЭС, является маркером, предсказывающим степень редукции гиппокампа, выявляемой в хронический период после ЭС.

3. В тесте «открытое поле» для крыс, перенесших ЭС, характерна гиперактивность в новой обстановке и нарушение долговременной поведенческой адаптации к новизне. Степень ранних изменений в мозге крыс, выявляемых при МРТ-исследовании, не коррелирует с этими нарушениями.

4. Время релаксации Т2 в миндалине, ретросплениальной и поясной коре коррелирует с параметрами поведенческой активности в открытом поле в хронический период после ЭС.

5. Однократное введение экстракта культуры клеток корня женьшеня ДАН-25 после ЭС уменьшает степень ранних изменений в гиппокампе, выявляемых при МРТ-исследовании мозга крыс на 2 день после ЭС, но не предотвращает развитие редукции гиппокампального объема.

6. Хроническое предварительное введение экстракта культуры клеток корня женьшеня ДАН-25 перед инициацией ЭС уменьшает тяжесть судорог во время ЭС, а его хроническое введение в течение 4 недель после ЭС достоверно уменьшает степень редукции гиппокампа через 30 дней после ЭС.