Механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии

В В Е Д Е НИ Е Актуальность проблемы В настоящее время широко изучаются межклеточные взаимодействия, в основе которых лежат механизмы сигнализации, опосредуемые цитокинами. Известно, что непосредственная адгезия играет существенную роль во взаимодействии между тромбоцитами и нейтро филами. Установлено, что адгезивные взаимодействия между тромбоцитами и лейкоцитами являются важными звеньями механизмов, обеспечивающих миграцию лейкоцитов в зону повреждения, а, следовательно, воспаления и развития там иммунных и репаративных реакций.

Тромбоциты способны вступать в контакт с гранулоцитами в процессе остановки кровотечения и развития воспалительной реакции (Hawrylowich С.М. et al., 1991). Установлена взаимосвязь между гемостатическими и воспалительными реакциями при повреждении тканей, в которой ключевым звеном выступает взаимодействие полиморфноядерных лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток. Эту кооперацию с участием ряда интегринов, регулируют хемокины, цитокины, факторы роста, производные радикалов кислорода, вызывающие усиленную коагуляцию и репарацию тканей в месте их повреждения (Folkman J. et al." 2001; Hawrylowich С.М. et al., 1991; KuijupesT.W. etal., 1991). Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ (приказ Минобразования РФ № 1632 от 30.04.2002 г.).

Выражаем сердечную признательность профессору Борису Шенкману (Израиль) за помощь в выполнении работы.

Данный феномен может иметь определенное патофизиологическое значение, так как активация тромбоцитов на поврежденной поверхности сосудистой стенки может служить важным фактором в миграции лейкоцитов в толщу сосуда и дальнейшему формированию тромба. Так известно, что при активации нейтрофилы человека высвобождают микрочастицы, называемые эктосомами, непосредственно с поверхности клеточной мембраны. Микрочастицы тромбоцитов, эндотелиальных клеток и моноцитов поддерживают коагуляцию или модулируют сосудистый гомеостаз через активированные моноциты и эндотелиальные клетки (Gasser О., Schifferli J.A., 2004).

Адгезия лейкоцитов и тромбоцитов к эндотелиальным клеткам вовлекается в патогенез ишемического повреждения сосудов (Ishikawa М. et al., 2004). Это связано с экспрессией тканевого фактора, перемещение которого к моноцитам может осуществляется через CD62P-опосредованную адгезию тромбоцитов или микрочастицы (Losche W. et al., 2004).

Тромбоциты повышают фагоцитоз лейкоцитов через факторы, высвобождаемые тромбоцитами, например. АДФ (Miyabe К. et al., 2004). Вместе с этим, активированные кровяные пластинки усиливают экспрессию Р-селектина Т-лимфоцитами (Danese S. et al., 2004).

Однако наряду с реакциями неспецифической защиты организма развивается иммунный ответ, главными участниками которого являются лимфоциты. К сожалению, механизмы взаимодействия этих клеток с кровяными пластинками недостаточно изучены.

В последнее время установлено, что CD40L экспрессируется не только активированными Т-лимфоцитами, но также активированными тромбоцитами, причем растворимая фракция лиганда имеет исключительно тромбоцитарное происхождение (NagasawaM, et al. 2005).

Более того, высказываются мнения, что кровяные пластинки являются провоспалительными клетками и принимают участие в иммунных реакциях, модулируя функции лимфоцитов, моноцитов, антигенпрезентирующих клеток (Fricke I. et al., 2004; Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004).

Однако до сих пор еще не ясен характер межклеточного контакта и механизмы передачи сигналов тромбоцитами. В связи с вышесказанным изучение лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия является актуальной задачей, решение которой раскрывает новые возможности для понимания механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

Цель и задачи исследования

Основной целью нашего исследования явилось изучение механизмов лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в опытах in vitro.

В связи со сказанным нами решались следующие задачи.

1. Выяснить, какие субпопуляции лимфоцитов способны к спонтанной адгезии с интактными тромбоцитами. Изучить роль молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 в лимфоцитарно-пластиночном контакте.

2. Исследовать влияние цитокинов — IL-lj3, IL-2, JL-4, IL-10, IL-16, TNFa, IFNy на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию.

3. Исследовать влияние индукторов агрегации тромбоцитов (ADP, коллагена, адреналина, тромбина, PAF) на лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию.

4. Получить С04±субпопуляцию лимфоцитов методом иммуномагнитной сепарации и проследить влияние тромбоцитов на адгезию клеток к субэндотелиальному матриксу.

5. Выяснить роль тромбоцитов в адгезии клеточной линии CD4+ (HVST-клона) к экстрацеллюлярному матриксу в условиях статики и разных сдвигах тока жидкости.

6. Сравнить экспрессию интегринов ociPi (VLA-1), a2Pi (VLA-2), a4Pi (VLA-4), a5Pi (VLA-5) свежевыделенных и культивированных С04±лимфоцитов доноров с HVST трансформированной линией CD4+ лимфоцитов. Изучить роль интегринов aiPi (VLA-1), ОС2Р1 (VLA-2), a4Pi (VLA-4), a5Pi (VLA-5), CD40L и PSGL в опосредованной тромбоцитами адгезии С04±лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу.

Научная новизна Впервые установлено, что Т-хелперы (CD4+) способны к спонтанной, а натуральные киллеры (CD 16+) — к IL-2-индуцированной адгезии с интактными тромбоцитами. Адгезивную активность лимфоцитов стимулирует также IL-ip. Ингибиторами ЛТА являются IL-4, IL-10 и IFNy. Агонисты агрегации кровяных пластинок коллаген и ADP повышают лимфоцитарно-тромбоцигарную адгезию. Лигандом лимфоцитарно-пластиночного контакта выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1).

Впервые обнаружено, что тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. В этих условиях лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоцитарно-тромбоцитарные коагрегаты, находится в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток — в обратной.

Впервые описаны механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия, включающие в себя образование интегриновых и неинтегриновых мостов, таких как ссць/Рзи р i-связанные интегрины, Р-сел ектин-Р S GL и CD40-CD40L.

Впервые показано регулирующее действие интерлейкинов в формировании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса: IL-2 и IL-16 повышают адгезивные свойства клеток и кровяных пластинок.

Теоретическая и практическая значимость работы Полученные сведения о субпопуляциях лимфоцитов, адгезивных молекулах, принимающих участие в образовании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов, роли цитокинов в регуляции функции JITА, раскрывают новые возможности для изучения механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

На основании исследований, разработанный и предложенный нами тест оценки лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии позволяет оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток, эффективность иммуномодулирующей терапии, проследить течение и прогноз заболевания.

Внедрение в практику Теоретические сведения о функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, механизмах ее регуляции и биологическом значении внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия. Тест лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии используется в диагностической лаборатории ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия.

Материалы по исследованию лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в норме и патологии вошли в отчет за 2003 год по федеральной программе «Совершенствование технологии трансплантации стволовых гемопоэтических клеток, химио-, иммунои сопроводительной терапии заболеваний системы кровиразработка новых форм организации средств и методов трансфузионно-инфузионной терапию) (договор № 005/037/002 от 25.09. 2001 г.).

Апробация диссертации Материалы диссертации доложены на: Фестивале «Студенческая медицинская наука '98» (Москва, 1998), 15, 16, 17, 18 Международных конгрессах по тромбозу (Antalya, Porto, Bologna, Lubljana, 1998, 2000, 2002, 2004), XVII, XVIII, XIX Конгрессах Международного общества по тромбозу и гемостазу — ISTH (Washington, 1999; Paris, 2001, Birmingham, 2003), на Международном симпозиуме «Platelets 2000» (Ma'ale Hachamisha, Israel), XVIII съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Казань, 2001), Конференции международного цитокинового общества — ICS (Гаваи, 2001), на заседании проблемной комиссии по физиологии тромбоцитов (Университет Тель-Авива, Израиль, 2004), Второй Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2005).

Положения, выносимые на защиту.

1. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии представляет собой одну из физиологических функций, присущую различным субпопуляциям лимфоцитов, и реализуемую посредством адгезивных молекул. Наиболее выраженной способностью к образованию коагрегатов с интактными лимфоцитами обладают Т-хелперы (CD4+) и NK-клетки.

CD 16+). Лигандом лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (1СAM-1).

2. Лимфоцитарно-тромбоцигарная адгезия регулируется цитокинами и индукторами агрегации тромбоцитов. Повышают эту функцию IL-ip, IL-2, коллаген, адреналин и ADP Ингибиторами лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии являются IL-4, IL-10 и IFNy.

3. Тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. При этом лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, находятся в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток — в обратной. Механизм лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия включает в себя образование интегриновых и неинтегриновых мостов, таких как ащ/Рзи Pi-связанные интегрины, Р-селектин-PSGL и CD40-CD40L.

4. Интерлейкины 2 и 16 повышают число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса в условиях тока жидкости.

ВЫВОДЫ.

1. Лимфоциты образуют коагрегаты с тромбоцитами. Т-хелперы (CD4+) способны к спонтанному розеткообразованию с интактными тромбоцитами. Интерлейкин-2 и IL-ip повышают розеткообразующую способность хелперно-индуцирующих клеток с интактными тромбоцитами и индуцирует ее у натуральных киллеров (CD16+). Антитела против IL-2 ликвидируют стимулирующее влияние IL-2 на формирование лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов.

2. Ингибиторами лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии являются IL-4, IL-10 и IFNy. IL-8 и TNFa не оказывают влияния на лимфоцитарно-пластиночные контакты.

3. Степень лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии зависит от функционального состояния кровяных пластинок. Коллаген, ADP и адреналин наиболее выражено повышают лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию. Другие агонисты агрегации (PAF и тромбин) не оказывают влияния на способность тромбоцитов прилипать к лимфоцитам.

4. Тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, но не в статическом состоянии. При этом лимфоцитарно-тромбоцитарные кластеры, сформированные на поверхности экстрацеллюлярного матрикса, являются главными триггерами адгезии лимфоцитов. Число лимфоцитов, вовлеченных в лимфоцитарно-тромбоцитарные коагрегаты, находятся в прямой зависимости от скорости сдвига жидкости, тогда как количество единичных клеток — в обратной.

5. Проявление интегринов на лимфоцитах здоровых людей отличается от клеток культивируемой линии HVST. На поверхности покоящихся CD4+ лимфоцитов доноров наиболее сильно экспрессируются молекулы a4Pi, в меньшей степени — a5J3b и практически отсутствуют интегрины aiPi и а2Рь После культивирования в присутствии IL-2 повышается экспрессия интегрина а^Рь и не изменяется для молекул с агРь a4Pi и а5Рь На поверхности CD4+ лимфоцитов линии HVST выявляются интегрины а4рь а5Рь a^i и а2Рь.

6. Лигандом лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1). Механизм лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия включает в себя образование интегриновых и неинтегриновых мостов, таких как аць/Рзи Pi-связанные интегрины, Р-селектин-PSGL и CD40-CD40L. Блокада ргзависимых интегринов и комбинированная блокада PSGL и CD40L на мембране лимфоцита уменьшает адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости (на 40% и 60% соответственно). Блокада (Хщ/Рз (т.е. агрегации тромбоцитов) тирофибаном предупреждает образование кластеров, тем самым подавляя 95% лимфоцитарной адгезии к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости.

7. Интерлейкины 2 и 16 повышают число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на поверхности экстрацеллюлярного матрикса в условиях тока жидкости. Присутствие IL-ip в среде роста культивируемых CD4+ лимфоцитов линии HVST снижает лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию, а IL-10 не изменяет адгезивные свойства клеток и кровяных пластинок.

8. Тромбоциты способствуют миграции лимфоцитов и их фиксации на поврежденной поверхности сосудистой стенки, что позволяет им противостоять силе сдвига протекающей жидкости. Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии занимает важное место в развитии атеросклероза, воспаления, тромбоза, иммунных реакций, репаративных процессов.

Заключение

Представленные исследования позволяют утверждать, что феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии представляет собой одну из физиологических функций, присущую различным субпопуляциям лимфоцитов, и реализуемую посредством адгезивных молекул. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия регулируется цитокинами и индукторами агрегации тромбоцитов. Сами тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, что позволяет им противостоять силе сдвига, способствуют миграции лимфоцитов.

Полученные сведения о субпопуляциях лимфоцитов, адгезивных молекулах, принимающих участие в образовании лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов, роли цитокинов в регуляции функции ЛТА, раскрывают новые возможности для изучения механизмов миграции клеток, развития иммунных реакций, патогенеза атеросклероза, воспаления, тромбоза и др.

На основании исследований, разработанный и предложенный нами тест оценки лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии позволяет оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток, эффективность иммуномодулирующей терапии, проследить течение и прогноз заболевания.