Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Новые диагностикумы для оценки функции гемостаза

Диссертация: Новые диагностикумы для оценки функции гемостаза
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Апробация работы состоялась 9 февраля 2000 года на заседании Проблемной комиссии '" Патология гемостаза" ГНЦ РАМН. Отдельные фрагменты работы были представлены на III (1996г.) и VI (1999г.) Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», а также на Международной школе-семинаре по проблемам гемостаза (Норвегия, 1995), на конгрессах, проводимых Международным обществом по проблемам тромбоза… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
  • ГЛАВА I. Новые подходы к диагностике функции гемостаза 10 (Обзор литературы)
    • 1. Использование хромогенных субстратов в лабораторных П исследованиях свертывающей системы крови
    • 2. Иммунологические методы в коагулологических исследованиях
  • ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • ГЛАВА III. Разработка новых методов диагностики функции 44 гемостаза
    • 1. Скрининг хромогенных субстратов
    • 2. Разработка набора для определения содержания плазминогена
    • 3. Разработка набора для определения антитромбина III
    • 4. Разработка набора для определения продуктовдеградации фибриногена/фибрина
  • ГЛАВА IV.
  • ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  • ВЫВОДЫ

Новые диагностикумы для оценки функции гемостаза (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы.

Несмотря на определенные успехи в разработке вопросов, касающихся диагностики ДВС-синдрома, предтромботических и геморрагических состояний, проблема далека от своего разрешения [4, 10, 13, 15, 29, 109]. В нашей стране это положение усугубляется тем, что в широкой клинической практике применяются старые методики, многие из которых уже не используются в передовых странах, Одной из причин, тормозящих внедрение современных методик в клиническую коагулологию является, отсутствие современных отечественных реактивов (хромогенных субстратов, иммунодиагностикумов и др.). Между тем. появление хромогенных субстратов привело к широкому внедрению фотометрических тестов в гемостазиологию [15, 13, 47]. Синтетические хромогенные пептиды имеют последовательность аминокислот, аналогичную участкам естественных субстратов, расщепляемых тромбином, плазмином и другими ферментами системы гемостаза. Отщепление от хромогенного субстрата окрашивающего фрагмента, обычно п-нитроанилина (р№), позволяет по степени развивающейся окраски определить активность действующего фермента. Энзиматическое расщепление субстратов определяется с помощью спектрофотометрии при длине волны 405 нм. Величина изменения поглощения прямо пропорциональна концентрации фермента [8, 23]. Таким образом, хромогенные субстраты позволяют проводить прямые измерения биологической активности энзимов. Амидолитические методы характеризуются простотой выполнения, высокой точностью, воспроизводимостью результатов, возможностью кинетических измерений и автоматизации. Неслучайно Н. БШгтогкеп сказал, что с началом промышленного производства хромогенных субстратов в лабораторной коагулологии начинается новая эра, которая знаменует переход от секундомера к спектрофотометру, от ручных методов исследования к автоматическим [1 22].

Важную роль в современной экспресс-диагностике патологии гемостаза играют также иммунологические методы, в частности, латексные тесты [80, 100]. Латексный иммунодиагностикум представляет собой суспензию частиц полпстирольногс латекса, на поверхность которого иммобилизованы высокоспецифичные антитела к фибриногену и продуктам его ферментативного гидролиза. Иммобилизованные антитела способны избирательно взаимодействовать с определяемым белком, что приводит к агглютинации латексных частиц, которые видны невооруженным глазом. Нагруженный антителами носитель и исследуемый образец, содержащий определяемый антиген, смешивают на стекле и наблюдают агглютинацию при непрерывном покачивании стекла в течение нескольких минут. Таким образом, диагностикум предназначен для количественного экспресс-анализа ПДФ в сыворотке крови. Зная минимальную концентрацию белка, тестируемого по стандартной плазме, можно определить его содержание в исследуемом образце.

В связи с тем, что в нашей стране подобные реактивы не производятся,.-они дороги и покупка их недоступна широкой сети больничных учреждений. Кроме того, структура хромогенных субстратов защищена зарубежными патентами и для производства в нашей стране целесообразен поиск новых структур, которые бы не уступали по диагностической ценности лучшим зарубежным прототипам.

Цель работы.

Цель работы — разработка новых оригинальных отечественных хромогенных субстратов, специфичных для плазмина и тромбина, а также создание зкспресс-диагностикума для определения продуктов деградации фибриногена/фибрина,.

Основные задачи исследования.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

1. Разработка оптимальной структуры оригинального хромогенного субстрата для оценки действия плазмина.

2. Разработка оптимальной структуры оригинального хромогенного субстрата для оценки действия тромбина.

3. Разработка метода оценки содержания плазминогена с помощью отечественного хромогенного субстрата,.

4. Разработка метода определения антитромбина III с помощью оригинального хромогенного субстрата.

5. Оценка возможности использования оригинального плазминового хромогенного субстрата для скрининга и контроля активности активаторов и и н гиб иторо в ф и б р и н ол и з а.

6. Оценка возможности использования оригинального тромбинового хромогенного субстрата для скрининга и контроля активности антикоагулянтов прямого действия.

7. Разработка иммунодиагностикума для определения продуктов деградации фибриногена/фибрина,.

Научная новизна.

Разработаны оригинальные отечественные хромогенные субстраты для определения активности плазмина, отвечающий формуле For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr, и тромбина, отвечающий формуле z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr. Показано, что указанные субстраты не уступают по своим свойствам зарубежным аналогам, производимыми фирмами «Kabi» и «Behring» .

Созданы методики скрининга и контроля активности активаторов и ингибиторов фибринолиза на основании разработанных оригинальных отечественных хромогенных субстратов.

Разработана методика скрининга и контроля активности антикоагулянтов прямого действия.

Практическая ценность.

Настоящая работа выполнена в рамках гранта РФФИ «Селективные пептидные ингибиторы громбообразования и фибринолиза. Разработка их фер м е н та т и в н о го си н тез а» .

В результате проведенного исследования разработан оригинальный отечественный хромогенный субстрат для оценки активности плазмина, на основе которого создан набор для быстрого и точного определения активности плазминогена и а.2-антиплазмина. Набор может быть внедрен в производство и клинико-диагностическое исследование. Показана пригодность плазминового субстрата для скрининга активаторов и ингибиторов фибринолиза.

Разработан оригинальный отечественный хромогенный субстрат для определения активности тромбина. Показана пригодность тромбинового субстрата для скрининга антикоагулянтов прямого действия.

Разработан иммунодиагностикум для определения содержания продуктов деградации фибриногена/фибрина, который по своим свойствам не уступает диагностикуму Fibro-Tec фирмы «Behring» .

Апробация работы состоялась 9 февраля 2000 года на заседании Проблемной комиссии '" Патология гемостаза" ГНЦ РАМН. Отдельные фрагменты работы были представлены на III (1996г.) и VI (1999г.) Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», а также на Международной школе-семинаре по проблемам гемостаза (Норвегия, 1995), на конгрессах, проводимых Международным обществом по проблемам тромбоза и гемостаза (FibrinolysisHaemostasis, 1996, 1997, 1998, 1999), а также на конгрессах и симпозиумах, проводимых Средиземноморской лигой по проблемам тромбоза и гемостаза (1997, 1998).

Объем и структура диссертации.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан оригинальный хромогенный субстрат For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr, обладающий селективностью по отношению к плаз ми ну. По своим свойствам он идентичен известному и широко применяемому субстрату H-D-Val-Leu-Lys-pNa, 2HG.

2. Создан набор для определения содержания плазминогена, в состав которого включен оригинальный хромогенный субстрат For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr. Набор состоит исключительно из отечественных реактивов.

3. Показана возможность использования указанного набора для оценки специфической активности активаторов и ингибиторов фибринолиза.

4. Разработан оригинальный хромогенный субстрат z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr, обладающий селективностью по отношению к тромбину. По своим свойствам он идентичен известному и широко применяемому субстрату H-D-CHA-But-Arg-pNa.HBr.

5. Создан набор для определения активности антитромбина III, содержащий хромогенный субстрат z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr. Набор включает только отечественные реактивы.

6. Указанный набор пригоден для оценки специфической активности антикоагулянтов прямого действия.

7. Разработан латексный тест, позволяющий быстро установить содержание продуктов деградации фибриногена в сыворотке крови.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Агафонова О, Г. Виноградов Д. В., Хаспекова С. Г, и др. / Иммунодиагностика дефицитов мембранных гликопротеинов тромбоцитов: тромбастении Глануманиа синдрома Бернара-Судье и дефицита белка GMP-140 БЭ БМ. // 1992.- 12, — с, 635−637.
  2. Г. В. / Методы исследования фибринолитической системы крови, // М., Издат.Моск.Ун-та.-1981,
  3. В.П., Баркаган З. С., Гольдберг Е. Д. / Лабораторные методы исследования системы гемостаза. // М, Москва.- 1980.
  4. В.П., Деянов И. И., Балуда М. В. и соавт. / Профилактика тромбозов. // Издательство Саратовского университета.- 1992.- с.3*5-
  5. З.С. / Общие принципы исследования системы гемостаза и анализ новых методов выявления внутрисосудстого свертывания крови. // Тер. арх, — 1988, — 5, — с. 104−110.
  6. Баркаган З. С, / Антикоагулянты волчаночного типа. Клиническое значение, диагностика, лечение, // Методические рекомендации.- Барнаул.-1993.
  7. З.С., Момот А. П. / Основные методы лабораторной диагностики нарушений системы гемостаза. //Барнаул.- 1998.
  8. И. Мартинек К, / Основы физической химии ферментативного катализа, // Мм Высшая школа, — 1977.
  9. И.В., Варфоломеев С. Д. / Химическая и биологическая кинетика, // М." Из-во Московского Университета, — 1983.
  10. Ю.Гаффни Дж, /Фибринолнз. //М., Медицина, — 1982.
  11. КГаффни Дж,/ Фибринолиз. // М., Медицина. -1992.
  12. Головина О, Г., Папаян Л. П., Белезо О. Е. и др, // Особенности диагностики болезни Виллебранда, Терапевтический архив.// 1996.- 4.- с.58−61.
  13. Исследование системы крови в клинической практике / под ред, КозинцаГ.И.и Макарова В, А. // М, Триада-Х, — 1997.
  14. М.Лычев В. Г, / Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, //М, Медицина, — 1993.
  15. Макаров В. А, / Лекарственные средства для лечения ДВС-синдрома. // Materia Medica.- 1997, — 1, — 13,-с, 37−43.
  16. В.В., Гаранина Е.Н, / Контроль качества клинических лабораторных исследований. // М.- 1994.
  17. О.Е., Потетинова Ж. В., Воюшина Т. Д., Макаров В. А. / Использование первых отечественных хромогенных субстратов для скрининга лекарственных регуляторов функции гемостаза. // В кн.: Лекарства-человеку.-Харьков, — 1999, — 11.- 3, — с.236−241,
  18. Р.В. / Иммунология, // М., Медицина, — 1987.
  19. Р.В., Хаитов P.M., Манько В. М. / Контроль и регуляция иммунного ответа,// Л., Медицина, — 1981.- с, 311,
  20. Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови. / под. ред ГавриловО.К.//М: Медицина, 1981
  21. Семенов Н. Н, / О некоторых проблемах химической кинетики и реакционной способности, // М., Из-во АН СССР.- 1958.
  22. Blomback M. Blomback B., Olsson P., Svencisen L, / The assay of antithrombin using a synthetic chromogenic substrat for thrombin. // Thronib. Res.-1984.- 5, — p.621−632.
  23. M. / Synthetic peptide substrates Registry of trial. // Thromb, Haemost.- 1989, — 41, — 2.- p.452−458,
  24. Bonner G., Marin-Grez M. / Measurement of kallikrein activity in urine of rats and man using a chromogenic tripeptide substrate. // J.Clin.Chem, CI in, Biochem, — 1981, — 19.-3, — p. 165−8.
  25. J.T. Barna L.K., 'Triplet! D.A, / Laboratory identification of lupus anticoagulants- results of the second international workshop for identification of lupus anticoagulants, //Thromb. Haemost.- 1995, — 6.- 74, — p. 1389−1613.
  26. Butenas S., DiLorenzo M.E., Mann Iv.G. / Ultrasensitive fluorogenic substrates for serine proteases. // Thromb.Haemost.- 1997, — 78, — 4, — p, 1193−201,
  27. L.O. / Pathogenic role of antiprotein phospholipid antibodies. // Haemostasis, 14th International Congress on Thrombosis. Abstract.- 1996- 3, — L-232,-p, 615.49.Chromogenix. / 1997.
  28. Claeson G, Friberger P., Knos M, Eriksson E. / Methods for determination of prekallikrein in plasma glandular kallikrein and urokinase. // Haemost.- 1978, — 1.- 2−3.- p.76−78,
  29. Coleman P, L, Perry J, P., Wehrly J, A, / Optimization of enzyme-based assays in coagulation testing. II Clin, Chem, — 1983, — 29, — 4, — p, 603−8,
  30. P. S. / Laboratory evalution of protein S status. // Thromb. Haemost.- 1990, — 16, — p. 177−181.
  31. Coombs G. S, et, aL / Distinct mechanisms contribute to stringent substrate specificity of tissue-type plasminogen activator. // J, 13iol, Vhem.- 1996, — 271.- 8, — p. 4461−7.
  32. Cronlund A.L., Walsh P.N. I A low molecular weight platelet inhibitor of factor Xla: purification, characterization, and possible role in blood coagulation, // Biochemistry, — 1992, — 31, — 6, — p. 1685−94,
  33. Dang Q.D. et.al. / Chromogenic substrates selective for activated protein C.- Blood.- 1997, — 89.- 6, — p.2220−2.
  34. Exner TM Cotton B, Howden M. / Detection of specific proenzyme activators in snake venoms by a new immunoabsorbant-chromogenic substrate method//Biochim.Biophys.Acta, — 1985, — 832, — 3,-p.351−6,
  35. Fijalkowska 1., Jastrezebowska J., Cierniewski C.S. / Contribution of Pro212-Ile276 sequence of human protein C to its anticoagulant and profibrinolytic activity. //Yhromb, Res.- 1998, — 89, — 2,-p.65−71.
  36. Friberger P., Knos M., Gustavsson S. et.al. / Methods for determination of plasmin, antiplasmin and plasminogen by means of substrate S-2251. // Haemostasis.- 1978, — 7, — 2−3,-p. 138−145.
  37. C., Iijima K., Nakamura K. / Blood coagulation-fibrinolysis tests by a biochemical method. // Rinsho Byori.- 1993.- 41, — 7, — p, 743−9.
  38. GafTney P. J, / Standartization of plasminogen assays, Haemostasis, // 1988, — 18, — 1, — p.47−60.
  39. Gaffney P. J, Edgell T.A., Creighton-Kempsford L.J. et all. / Fibrin degradation product (FnDP) assay. Analysis of standardisation issues and target antigens in plasma, // Br.J.Haemat.- 1995, — 90, — p.187−194.
  40. Gallimore M. J, Friberger P. / Chromogenic peptide substrate assay and their clinical application. // Blood Rev.- 1991.- 5, — 2.- p. l 17−27,
  41. Gan Z.R., Connolly T.M., Sardana M.K. et. al, / Importance of the Arg-Gly-Asp triplet in human thrombin for maintenance of structure and function. // Arch.Biochem.Biophys, — 1993, — 301, — 2.- p.228−36.
  42. Gar1oett E. A, et.al. / Proteolysis in human breast and colorectal cancer.-Br, J, Cancer.- 1999, — 81, — 2, — p.287−93.on
  43. H.A., Vides M.A. / A hovel functional assay of protein C in human plasma and its comparison with amidolytic and anticoagulant assays. // Thromb, Haemost.- 1992.- 67, — 1, — p, 46−49,
  44. Hawiger J. et.al. / Methods for determination of plasma components by means of substrate. //J, Lab, Clin, Med.- 1970, — 75, — p.93−108.
  45. Herrmann R, PM Bailey P.E. / Plasma thrombin assay using a chromogenic substrate in disseminated intravascular coagulation due to snake bite envenomation. //Thromb, Haemost, 1979, — 41, — 3, — p, 544−552.
  46. L. / Fibrinolysis in human peritoneum during operation. // Surgery.- 1996, — 119.- 6, — p.701−5.
  47. Hopfner K.P. ei.al. / Coagulation factor IXa: the relaxed conformation of Tyr99 blocks substrate binding. // Structure Fold Des.- 1999, — 1 5, — 7, — 8, — p.989−96.
  48. G.L., Trimpe B.L. / Allosteric changes in thrombin’s activity produced by peptides corresponding to segments of natural inhibitors and substrates. //J.Biol.Chem.- 1991.- 266, — 11.- p, 6866−71.
  49. BOJovov B., Wills N.K., Donaldson P.J., Lewis S. A, / Vectorial secretion of a kallikrein-like enzyme by cultured renal cells. General properties, // Am.J.Physiol.-1990, — 259, — 6.- 1, — p.869−882.
  50. K., Endo Y., Sasaki T. / Assay and detection methods for urokinase-type plasminogen activator and its related-factors. // 1999.- 26.-7, — p. 100 917.
  51. Kobayashi I., Amemiya N., Endo T. et.al. / Amidolytic kinetic assay of protein C by selective spectrophotometry in a centrefugal analyzer. // Clin.Chem.-1988, — 34, — 11, — p.2260−3,
  52. Kroon M.E. Koolwijk P., van Goor H. et.all. / Role and localization of urokinase receptor in the formation of new microvascular structures in fibrin matrices. //Am J.Pathol.- 1999, — 154, — 6.- p. 1731−42,
  53. Latallo Z.S., Teissereyre E., Lopac-iuk S. / Assessment of plasma fibrinolytic system with use of chromogenic substrate, // Haemost, — 1978.- 7, — 2−3.-p. 150−154.
  54. Ledwozyw A., Jablonka S, Tusinska E., Herbut M. / The estimation of factor VII in livestock plasma of domestic animals by the use of tripeptide chromogenic substrate,// Arch. Vet, Pol.- 1993, — 33, — 1−2, — p. 1 23−127.
  55. E.L. / Substrate specificity of tissue type plasminogen activator. // Adv.Exp.Med.Biol, — 1997.-425,-p. 109−21
  56. M., Pekcelen V. / Antitrombin III. protein C and protein S plasma levels in patients with Behcet’s disease. //J, Int.Med.Res.- 1998, — 26, — 4.-p.206−8.
  57. Nicham F, Guichaoua J.F., Com ant G, Marti noli J.L. / Rapid determination of protein C activity, //Ann, Biol, Clin, — 1988, — 46, — 10, — p.805−9.
  58. Peisach E, et.al. / Crystal structure of the proenzyme domain of plasminogen. // Biochemistry.- 1999.- 38.- 34.- p. l 1180−8.
  59. Plasminogen, / Reagent for determination of plasminogen. // Behring E.-Berichrom, — 1990.
  60. K. Patfalusi M., Vereczkey E. / Chromogen-substrate assay astool for monitoring a new thrombin inhibitor, // Acta Pharm. Hung.- 1993, — 63, — 1,-p.3−12,
  61. Recllitz A. et. al, / Inducible carboxypeptidase activity, A role in clot lysis in vivo, //Circulation, — 1996, — 93, — 7, — p. 1328−30.
  62. Reed G.L. et. al, / A catalytic switch and the conversion of streptokinase to a fibrin-targeied plasminogen activator. // Proc. Mat!, Acad. Sci, USA.- 1999, — 96,16, — p, 8879−83.
  63. Rock G" Chauhan K., Jamieson G. A, Tandon N.N. / Anti-CD36 antibodies in patients with lupus anticoagulant and thrombotic complications. // Br.J.Haematol.- 1994, — 88, — 4, — p.878−80.
  64. J., Boulo V., Mislhe E., Bachere E. / Characterisation of shimp haemocytes and plasma components by monoclonal antibodies. // H. Cell Sci, — 1995.-108,-p. 1043−50,nn
  65. OS.Rojkjaer R. et.al. / Activation of the plasma kallikrein/kinin system on endothelial cells. //Proc, Assoc.Am.Physicians.- 1999.- 111.- 3.- p.220−7.
  66. Van de Werf F. / What do new lytics add to t-PA? // Am. Heart J.- 1999.138, — 2, — p. 115−20.
  67. H. / Photometric assay of antitrombin III with a chromogenic substrate. // Haemost.- 1975, — 4, — 2, — p. 101−9.
  68. H. / Gerinnugsphysiologie und methoden im Blutge gerinnugslaboratorium. //Stuttgsrt, G. Fischer Yerlag.- 1979.
  69. Vinazzer IT, Pangraz L". / Protein C: comparison of different assays in normal and abnormal plasma samples, //Thromb.Haemost.- 1987, — 46, — 1, — p. 1−8.
  70. Vindigni A, / Energetic dissection of specificity in serine proteases. // Comb, Chem, High, Throughput Screen, — 1999, — 2, — 3, — p.139−53,
  71. T.L. Terenteva E.Yu., Stepanov V.M. / The synthesis of chromogenic peptide substrate containing p-nitroanilicles of arginine and lysine, catalyzed by proteinase adsorbed on support material. // Biomed.Biochim.Acta.-1991, — 50, — p.209−212.
  72. Wadhwa M., Barrowcliffe T.W., Mire-Sluis A.R., Thorpe R. / Factor VIII concentrates and the immune system laboratory investigation. // Blood Coagul.Fibrinolysis.- 1995.- 6, — 2, — p.65−79.no
  73. Wang C, Tang C.Q. Zhou G.X., Chao L., Chao J. / Biochemical characterization and substrate specificity of rat prostate kallikrein: comparison with tissue kallikrein, tonin and T-kininogenase, // Biochim.Biophys.Acta.- 1992.- 1121.3.- p.309−16,
  74. Wang J, Mazar A., Quan N., Schneider A, Henkin J. / Plasminogen activation by pro-urokinase in complex with its receptor-dependence on a tripeptide (Spectrozyme plasmin), // Eur.J.Biochem, — 1997, — 247, — 1, — p, 256−261.
  75. Wang X.L. et.al. / Crystal structure of the catalytic doman of human plasmin c-omplexed with streptokinase. //Science.- 1998.- 281, — 5383.- p. 1662−5.
  76. Wang X, L, et. al, / Protease activity induced by nicotine in human cell, // Int.J.MoI.Med, — 1999, — 4, — 5.- p.537−40.
  77. Wendel H.P., Heller W,. Gallimore MJ. / Aprotinin in therapeutic doses inhibits chromogenic peptide substrate assays for protein C. // Thromb.Res.- 1994,74.- 5.- p.543−8.
  78. I., Hasler H., Muschietti F. / Prothrombin and factor X estimation during dicoumaroi treatment,//J, Clin, Chem.- 1977.- 15,-p.197−202,
  79. Witting J, I, Miller T.M., Fenton J, W. / Human alfa- and gamma-thrombin specificity with tripeptide p-nitroanilide substrates under physiologically relevant conditions. //Thromb.Res.- 1987.- 46, — 4, — p.567−74,
  80. M. / Urokinase-type plasminogen activator binding to its receptor stimulates tumor cell migration by enhancing integrin-mediated signal transduction. // Exp, Cell Res, — 1999, — 250, — 1, — p.231−40.
  81. Young K, C. et. al, / Plasminogen activation by streptokinase via a unique mechanism. //J, Biol, Chem.- 1998, — 273, — 5, — p.31 10−6.
  82. S.G., Gorin V.S. / The effects of alpha 2-antiplasmin complex and alfa 2-antiplasmin on the secretion of JgG and IgM by cultured human mononuclear cells, //J, Clin, Lab, Immunol, — 1997, — 49, — 2, — p.77−82,
Заполнить форму текущей работой

На отлично!