Изучение комплексного влияния лазерного излучения и искусственных магнитных полей на золотистый стафилококк

Актуальность темы

Лечение гнойно-воспалительных заболеваний является актуальной проблемой для всех областей амбулаторной и клинической хирургии [Шендеров Б.А., 1987; Апанасенко Б. Г., 1999; Митрохин С. Д., 2002; Howard R.J., 1995.] в связи с возникновением значительного числа до — и послеоперационных осложнений.

Наряду с неблагоприятным течением гнойно-воспалительных процессов в ходе терапевтического лечения, связанным с индивидуальной непереносимостью антибактериальных (АБ) препаратов, явлениями дисбактериоза и другими причинами, часто наблюдается прогрессирование и генерализация [Гости-щев В.К., 1998; Смирнова A.M. и соавт., 1977; Лепилин A.B., 1995] процесса распространения инфекционного нагноения костной и мягких тканей при механических травмах, а также послеоперационных осложнений в виде абсцессов и флегмон [Подильчак М.Д., 1989; Степанов Н. Г., 2001].

Постоянно ухудшающиеся экологические условия и снижение уровня жизни населения обуславливают увеличение числа больных с исходным изменением иммунологической реактивности’и наличием фоновой патологии [Ле-щенко И.Г. и соавт., 1996; Колесов А. П. и соавт., 1989]. Кроме того, массовое бесконтрольное и часто неграмотное применение современных антибактериальных препаратов и противовоспалительных средств, привело к нарушению естественного биологического равновесия в микробных ассоциациях, выдвинув на первый план условно-патогенную микрофлору — основной возбудитель гнойных и гнойно-септических воспалительных процессов мягких тканей [Ок-ропидзе Г. Г. и соавт., 1996; Fraimow H.S., 1995; Skurray R.A. et al., 1997]. Под влиянием этих двух факторов значительно увеличилась частота абсцессов и флегмон, протекающих атипично и требующих особого подхода к оперативному и неоперативному лечению, а оперативное лечение всех гнойно-септических инфекций часто приводит к необходимости повторных операций ввиду про-грессирования острого воспалительного процесса [Штафова И.Л., Ермолов A.C., 1995; Ерюхин И. А., 1997; Апанасенко Б. Г., 1999].

Ведущая роль в возникновении большинства гнойно-септических заболеваний отводится инфекции стафилококковой этиологии, прочно занявшей одно из первых мест, несмотря на изменения эпидемических характеристик возбудителей инфекций, связанных с использованием антибактериальных препаратов [Сильвестров В.П. и соавт., 1990; Сидоренко C.B., 1999; Маянский А. Н., 1999; Яковлев C.B., 2001; Laverdiere M. et al., 1998]. Бактериологический анализ микрофлоры гнойных ран у больных с флегмонами и абсцессами различной локализации показал [Шульга И.А. и соавт. 1994; Губин М. А. и соавт. 1998; Gia-cometti A. et al., 2000], что стафилококк, играющий ведущую роль в гнойном очаге, высевался в 53,6% случаев. Причём необходимо отметить, что у 22,5% больных обнаружена монокультура стафилококка, а 30,5% - в ассоциации с другими микроорганизмами [Домарадский И.В., 1997; Фадеев С. Б., 1999; Жа-магорцян JI.M., 2001; Shuttleworth R. et al, 1997].

Штаммы S. aureus, как и его ассоциации, обычно выявлялись при абсцессах и флегмонах с наиболее тяжёлым течением заболевания. При наличии стафилококковых ассоциаций микроорганизмов чаще отмечались воспалительные процессы с более глубоким и выраженным некрозом тканей, что значительно увеличивало сроки очищения и заживления ран [Pearson M.L., 1996; Высоцкая А. Т., 1990; Лепилин A.B., 1993; Бондаренко В. М., 1997; Степанов Н. Г., 1999].

Многочисленные микробиологические исследования микрофлоры гнойного отделяемого определили приоритет в отношении объекта исследования настоящей работы — стафилококковой инфекции (по образному выражению &bdquo-чумы XX века") [Лобзин Ю.В., 1998; Ерюхин И. А., 1998; Cone L. A. et al., 1992; Klebanoff SJ. et al., 1994;].

В связи с изменением видовой структуры возбудителей гнойной инфекции, появлением форм микроорганизмов, резистентных к антибиотикам и, вследствие этого, изменением клинического течения заболевания, существующие способы лечения оказываются мало эффективными [Ерюхин И.А. и соавт., 1990; Страчунский Л. С. и соавт., 2000; Wenzel R.P., 1991;].

В последние годы предприняты многочисленные попытки комбинированного лечения инфицированных ран стафилококковой этиологии путём применения АБ препаратов широкого спектра действия в сочетании с воздействием ряда физических факторов (ФФ) (лазерного излучения, гипертермии, искусственных магнитных полей и др.) [Мухсинов М.Э., 1991; Брискин Б. С. и со-авт., 1991; Улащик B.C., 1998; Курлаев П. П. и соавт., 2000; Райгородский Ю. М. и соавт., 2000].

Необходимость изучения влияния физических факторов на жизнедеятельность S. aureus обусловлена тем, что в последние годы несмотря на значительное число АБ препаратов, существенно увеличилось число больных с гнойно-септическими инфекциями (ГСИ). [Каплан A.B. и соавт., 1985; Робу-стова Т.И.и соавт., 1993; Дворецкий Л. И., 2002]. Это связано с постоянно растущей резистентностью микроорганизмов к АБ препаратам [Егоров A.M., 2001; Stefani S., 2000; Thomas J.K., 1998], причем выраженность последней бывает настолько велика, что многие широко применяемые лекарственные средства теряют терапевтический эффект при лечении ряда инфекций [Губин М.А. и соавт., 1998; Яковлев В. П., 2002]. Кроме этого, сами АБ препараты оказывают ряд побочных действий на организм больного, вызывая различные осложнения [Рыбкин А.К.1993; Дерябин Е. И., 1999; Кулешов Е. В., 2002].

Исследователи, принадлежащие к различным научным школам, трактуют вопросы, связанные с влиянием ФФ на структуру микроорганизма по-разному, в зависимости от цели конечного результата, состоящей либо в стимулировании, либо в угнетении жизнедеятельности последнего [Каплан М.А., 1997; Козлов В. И. и соавт., 1993; Зубкова С. М., 1996]. Так, в исследованиях [Голант М.Б., 1989], связанных с активизацией роста микроорганизмов вида Saccharomuces carlsbergensis, приводятся данные по использованию для этой цели ЭМИ длин о волн 6,0 — 6,6 мм при плотности потока мощности 0,25 мВт/см. Отечественные исследования, посвященные вопросам влияния ряда ФФ на угнетение роста S. aureus [Курлаев П.П. и соавт., 2000], а также иностранные источники информации [Hofmann G.А., 1989; Podbelska H., 1999], связывают эффективность воздействий на эту культуру как с природой используемых для этой цели ФФ с одной стороны, так и с диапазонами их параметров с другой. В большинстве исследований отмечается наличие непосредственной связи отклика системы (культуры микроорганизма) с резонансным характером и набором определённых частот (длин волн) воздействующих факторов [Скобелкин O.K., 1997; Боголюбов В. М. и соавт., 1998; Рогаткин Д. А. и соавт., 2001]. Диапазон частот физических факторов определяет так называемое &bdquo-окно прозрачности", в котором реализуется наиболее эффективное для микроорганизма преобразование энергии воздействующего фактора (или комплекса факторов) в энергию метаболизма культуры бактерий [Илларионов В.Е., 1989]. Есть данные по комбинированному использованию ФФ (СВЧ энергии диапазона длин волн — 6,0 — 6,7 мм нетепловой интенсивности при плотности потока падающей мощности в 1 мВт/см, времени облучения 30 мин) для угнетения жизнедеятельности Е. coli и S. aureus на клеточном уровне [Лунёва И.О. и соавт., 1983]. Таким образом, изучение раздельного и комплексного воздействия ряда физических агентов на штаммы культуры S. aureus, представляется весьма актуальным направлением научного поиска.

Цель исследования: Исследовать эффективность раздельного и комплексного влияния лазерного излучения и искусственных магнитных полей на изоляты популяции S. aureus для изыскания оптимальных параметров, угнетающих жизнедеятельность культуры.

Задачи исследования.

1. Определить эффективность влияния ряда физических факторов — инфракрасного лазерного излучения, бегущих переменных магнитных полей, постоянного магнитного поля и их комплексного воздействия на динамику развития бактериальных клеток S. aureus.

2. Получить количественное описание динамики роста в различных фазах развития популяции на основе оригинальной компьютерной программы обработки экспериментальных данных.

3. Разработать техническое устройство для экспериментального изучения воздействия физических факторов (лазерного излучения, стационарных и нестационарных магнитных полей) на микроорганизмы.

4. Выявить изменения уровня воздействия физических факторов и АБ препаратов на бактериальные клетки S. aureus «in vitro» и «in vivo» .

Научная новизна.

В результате проведенного исследования впервые показано, что комплексное влияние лазерного излучения и искусственных магнитных полей на популяции клеток S. aureus в эксперименте «in vitro» эффективнее раздельных физических воздействий, оптимально угнетающих рост клеток, что нашло подтверждение в лечении больных с абсцессами и флегмонами. На основе оригинальной компьютерной программы обработки экспериментальных данных впервые построена математическая модель динамики роста в различных фазах развития популяции S. aureus. Получены количественные данные роста микроорганизмов позволившие установить существенное различие во влиянии физических факторов на фазы развития популяции клеток S. aureus, а также оптимальный эффект комплексного воздействия физических факторов на лаг-фазу роста.

Впервые обнаружено существование резонансных частот следования импульсов лазерного излучения, на которых достигнут эффект максимального угнетения роста популяции клеток S. aureus.

Экспериментально получены количественные данные изменения уровня воздействия ряда АБ препаратов на бактериальные клетки S. aureus под влиянием физических факторов от условно-чувствительных до чувствительных.

Для практического использования впервые создано устройство для микробиологических исследований, защищенное свидетельством на полезную модель RU (11) 21 742 (13) Ul), позволившее провести эксперименты по комплексному воздействию ряда физических факторов и АБ препаратов на культуры микроорганизмов.

Экспериментально подобраны оптимальные параметры магнитолазерного воздействия, способствующие угнетению роста бактериальной культуры S. aureus.

Рекомендован принцип экспериментального подбора оптимальных рабочих параметров лечебно-терапевтического оборудования, оказывающих влияние на угнетение роста культуры S. aureus (как на эталонном штамме 209 Р, так и на клинических, выделенных от больных, штаммах).

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспериментально подобран диапазон оптимальных параметров воздействий физических факторов с частотой следования импульсов инфракрасного лазерного излучения (ИКЛИ) от 600 до 1500 Гц, частотой модуляции бегущего переменного магнитного поля (БПеМП) — 10 Гц, напряженностью постоянного магнитного поля (ПМП) — 65 мТл, позволяющий угнетать рост клеток культуры микроорганизмов S. aureus на 56% по сравнению с контролем.

2. Разработано техническое микробиологическое устройство, позволяющее проводить экспериментальные исследования по оценке воздействия физических факторов и АБ препаратов на бактериальные культуры микроорганизмов.

3. Магнитолазерная терапия эффективна в комплексном лечении больных с абсцессами и флегмонами.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

• 11-й Всероссийской научной конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов 1998);

• XIV Международной научной конференции «Применение лазеров в медицине и биологии» (Харьков 1999);

• 60-й, 61-й и 62-й Научных конференциях молодых учёных и студентов Саратовского Государственного Медицинского Университета (1999, 2000, 2001);

• Всероссийской научной конференции «Новые технологии в медицине» (Саратов2001);

• XII Философской конференции (Саратов, СГМУ, 2000);

• Международной конференции «Естествознание на рубеже столетий», (Дагомыс, 2001);

• VIII Всероссийском съезде микробиологов и эпидемиологов (Москва, 2002).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 1-я журнальная статья и свидетельство на полезную модель. Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 145страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, характеризующей объекты и методы исследования, 3-х глав экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, практической значимости, заключения, выводов, списка литературы и приложения.

ВЫВОДЫ.

1. Комплексное воздействие физических факторов — ИК лазерного излучения и искусственных магнитных полей на штаммы бактерий S. aureus в экспериментах «in vitro» эффективнее их разделённых. Физические факторы либо угнетают рост штаммов S. aureus бегущим переменным магнитным полем с частотой модуляции 10 Гц, полем постоянного магнита индукцией 65 мТл, ИК лазерным излучением при частоте следования импульсов в диапазоне 600 — 1500 Гц, либо стимулируют их рост бегущим переменным импульсным магнитным полем с частотой модуляции 1−5 Гц, полем постоянного магнита индукцией 65 мТл, ИК лазерным излучением на частоте следования импульсов в диапазонах 80 — 600 Гц и 1500 — 3000 Гц. При угнетении роста S. aureus этот эмпирический результат справедлив для физических факторов как в отсутствие АБ препаратов, так и при их совместном использовании.

2. Существует область параметров воздействий физических факторов, обеспечивающих оптимальное влияние их на угнетение роста штаммов бактерий S. aureus. При комплексном воздействии физических факторов угнетение роста штаммов S. aureus на 18 ± 5% выше относительно контроля, чем разделённых при том же значении экспозиции. Комплексное воздействие физических факторов при оптимальных параметрах:

— бегущего переменного магнитного поля — частоте модуляции 10 Гц;

— поля постоянного магнита — индукции 65 мТл и ориентировке его в направлении распространения лазерного излучения;

— ИК лазерного излучения длиной волны 890 нм на частоте следования импульсов 1050 Гцспособствует максимальному угнетению роста штаммов S. aureus на 24 ± 5 по сравнению с контролем при экспозиции 2 минуты.

3. Полученные количественные данные роста микроорганизмов выявили существенные различия во влиянии физических факторов на фазы роста культуры S. aureus. Наибольший оптимальный эффект комплексное воздействие физических факторов оказало на лаг-фазу — 56,5% относительно контроля. На остальные фазы роста это влияние менее заметно — 24−34,6%, причём все последующие фазы роста имели отношение уже к новой, видоизменённой структуре S. aureus, сформированной под воздействием комплекса физических факторов.

4. Угнетение роста штаммов S. aureus под действием физических факторов привело к увеличению на 14,4 26,5% коэффициента чувствительности относительно зон угнетения роста за счёт использования АБ препаратов (при времени экспозиции 2 мин). Комплексное воздействие физических факторов при оптимальных параметрах и режимах уменьшает резистентность клинических штаммов, проявивших себя до воздействия к ряду АБ препаратов как «умеренно-чувствительные», до категории &bdquo-чувствительные" .

5. В клинических условиях испытаны разные временные воздействия магнитными полями при постоянных энергетических параметрах ИК излучения на стафилококк как раздельно, так и в комплексном виде. Важным показателем эффективности применения комплексного магнитолазерного воздействия при лечении больных явилось его бактерицидное влияние па возбудитель, оставшийся в содержимом очага поражения, в определённый срок наблюдения (вы-севаемость S. aureus в контрольной группе составила 11,7%, по отношению к основной группе, в которой отмечена почти полная санация раны — 1,7% высе-ваемости).

Практическая значимость работы.

Анализ литературных источников не дал сведений о комплексном использовании физических агентов — импульсного инфракрасного лазерного излучения, бегущего переменного магнитного поля и коллинеарного постоянного магнитного поля для угнетения культуры бактерий S. aureus. Поэтому проведенные исследования позволят использовать нетрадиционные подходы к практической реализации эффективных воздействий факторов физической природы на микроорганизмы стафилококковой этиологии. Практическим обоснованием послужил экспериментально доказанный факт угнетения роста колоний бактерий S. aureus (как референтного 209 Р, так и клинических штаммов), понижение их функциональной активности при неблагоприятных условиях, созданных внешним воздействием физических агентов электромагнитной природы посредством функционального объединения элементов, создавших эти факторы, в единое устройство. Это важно не только для понимания механизмов, лежащих в основе процесса ассоциативных взаимоотношений &bdquo-клетка — физическое воздействие", но и необходимо для подбора наиболее эффективных параметров воздействий, обладающих значительным влиянием на угнетение жизнедеятельности микроорганизмов, реализованных в настоящей работе.

По результатам работы установлены определённые закономерности изменения биологических свойств культуры бактерий S. aureus при воздействии на них ряда физических агентов. Они могут быть использованы в микробиологической практике, связанной с появлением форм микроорганизмов, условно резистентных к АБ и, вследствие этого, изменением клинического течения заболевания, при котором существующие способы лечения оказываются мало эффективными. Усовершенствована и апробирована методика исследования влияния лазерного излучения, переменных и постоянных магнитных полей на популяции бактериальных клеток S. aureus при помощи оригинального устройства для микробиологических исследований, созданного для проведения экспериментов. Её можно рекомендовать для дальнейших исследований с целью использования физических агентов при физиотерапевтическом лечении ГСП.

Проведенные исследования дали теоретические и практические предпосылки для разработки новых нетрадиционных подходов к реализации эффекта воздействия факторов физической природы на микроорганизмы стафилококковой этиологии. Значительное (более 25% относительно контроля) угнетение зон роста, полученное в результате комплексного применения ряда АБ препаратов и физических агентов при схожести величин степени угнетения роста культуры бактерий S. aureus, полученных различными методами, дало основание для прогноза клинического использования полученных результатов. В качестве дополнительно воздействующего на условно-патогенные микроорганизмы фактора при разработке современной тактики борьбы с гнойносептическими осложнениями стафилококковой этиологии, результаты исследования могут быть применены в физиотерапии постхирургического пособия.

Комплексное влияние физических факторов, изменившее, как показали результаты экспериментов, антибиотикоустойчивость ряда клинических штаммов (особенно условно-устойчивых), может быть применено в некоторых областях экспериментальной биологии и практической медицины. При высокой стоимости сильнодействующих лекарственных средств, положительным можно считать эффект использования физических агентов, способствующий повышению воздействия ряда АБ препаратов. Тем более что каждый организм, очевидно, имеет достаточно широкий диапазон доз электромагнитного излучения, внутри которого наблюдается положительный лечебный эффект.

На основе проведённых исследований предложены варианты разработки конструкций новой медицинской аппаратуры как для обустройства современных бактериологических лабораторий, так и оснащения физиотерапевтических кабинетов специализированных клиник.

Внедрение практических результатов диссертационной работы подтверждено соответствующими документами и актами, представленными в приложении к диссертации, в частности:

— разработано и внедрено устройство для микробиологических исследований, защищенное свидетельством на полезную модель № RU (11) 21 742 (13) U1);

— изданы информационные листки № 8−2000 (УДК 535.5) &bdquo-Электронный термометр" и № 26−2000 (УДК 57.03.1) &bdquo-Устройство для микробиологических исследований" ;

— получены удостоверения на четыре рац. предложения, внедрённые в медицинскую практику соответствующих подразделений (акты о внедрении, приведённые в Приложении 2).

Материалы диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедр микробиологии и биохимии СГМУ, Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) СГМУ. Представленные в диссертации материалы будут включены в информационные пособия для курсов усовершенствования врачей, специалистов в области микробиологии, биохимии, экспериментальной и клинической медицины.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Ведущая роль в возникновении большинства гнойно-септических заболеваний отводится инфекции стафилококковой этиологии, прочно занявшей одно из первых мест по способности этой группы микроорганизмов, определяющих инфекционную патологию человека, к образованию форм, обладающих высокой резистентностью к АБ препаратам [Маянский А.Н., 1999;Сидоренко C.B., 1999; Яковлев C.B., 2001; leven M., 1995; Laverdiere M. et al., 1998].

Несмотря на успехи медицинской науки в разработке новых эффективных АБ препаратов, методов местного и общего лечения, проблема борьбы со стафилококковой инфекцией не стала менее актуальной и приобрела особую значимость в современных условиях [Губин М.А., 1998; Dajania A.S., 1990; Flournoy D.J., 1993]. Снижение эффективности лечения инфицированных ран стафилококковой этиологии связано как с изменением чувствительности к АБ препаратам из-за индивидуальной лекарственной непереносимости их отдельными больными [Eliopoulos G.M., 1989; Helovuo О.Н., 1993; Goessens W.H. 1993], так и с повышением степени резистентности микрофлоры [Borde J.R., 1990; Moreillon P.L., 1995; Westh Н.К., 1995; Jesudason M.V., 1997; Barie P. S., 1998], вызывающей гнойно-септические инфекции на фоне ослабленной иммунологической реактивности организма [Высоцкая А.Т., 1990; Sabath L.D., 1982; Pallasch Т.J., 2000].

Многообразие и множественность факторов патогенности стафилококков способствует неизменному присутствию этих микроорганизмов в инфекционной патологии человека [Бухарин О.В., 1994; Sutra L., 1994; Nilsson I.M., 1997; Schlager Т.А., 1997]. При этом в каждом конкретном случае высокая адаптационная способность отдельных биологических свойств культуры стафилококка обеспечивает ему состояние экологической адекватности специфическим условиям существования, складывающимся в различных органах и тканях организма хозяина [Murai M., 1992; Lavery L.A., 1994; Amir M., 1995; Almeida R.J., 1996; Lundberg F., 1997; Mahoudeau I. 1997]. Подобная &bdquo-патогенетическая универсальность «стафилококков находит своё отражение и в изменении видового состава возбудителей хирургической инфекции, поэтому сложно назвать какую-либо группу нозологий, в развитии которой так или иначе не приняли бы участие представители этого микробного таксона [Покровский В.И., 1998; Дерябин Д.Г.2000; Neely J. L., 1994; Personne P., 1997].

В течение ряда лет проводились исследования возможного влияния различных физических факторов на угнетение роста микроорганизмов и поиска эффективных воздействий на их поведение. Начало изучения результатов влияния физических факторов было положено работами, посвященными влиянию стационарных магнитных полей на культуры микроорганизмов [Leusden F.P., 1929; Kimball G.C., 1938; Gerenscer V.F. et al., 1962; Пресман A.C., 1968; Дорф-ман А.Г., 1971; Пирузян JI.A., 1970; Абдуллина З. С., 1975]. В последнее десятилетие исследованиями ряда авторов [Frankel R.B. et al., 1995, Hart F.M. et al., 1999] существенно расширены представления о характере влияния магнитных полей на биологические объекты. Показано, что угнетающее действие магнитных полей на патогенную микрофлору обусловлено не прямым их влиянием на микроорганизмы, а косвенным — через иммунные системы последних за счёт развития гиперергической реакции, а также инактивацией микробных токсинов. Для лечения осложнений гнойно-септической инфекции рядом авторов [Райго-родский Ю.М., и соавт. 2000] успешно применены нестационарные магнитные поля, обладающие форетическими свойствами.

Широко распространённые в медицинской практике полупроводниковые импульсные лазеры инфракрасного (0,78−1,3 нм) диапазона длин волн [Полонский А.К., 1983, Лобков В.В.и соавт., 1986], используются как для изучения влияния лазерного излучения на биологические ткани и условно-патогенные культуры микроорганизмов, так и при лечении послеоперационных ран, осложнённых гнойно-септической инфекцией [Кару Т.Й., 1987; Тифлова O.A., 1987; 1989; 1993; Dowlatshahi К., et al. 1992].

Следующим этапом явилось изучение совместного влияния магнитных полей и лазерного излучения. Различная пространственная ориентация магнитных полей по отношению к объекту и направлению распространения лазерного излучения, наряду с возможностями варьирования длиной волны излучения и временными характеристиками (частотой модуляции и длительностью воздействий) создаёт исключительно большое разнообразие реализации возможных совместных воздействий физических факторов.

Лечение инфицированных ран стафилококковой этиологии с применением АБ препаратов и факторов физической природы, в частности, электромагнитных полей, широко распространено как в России, так и за рубежом [Cone L.A. et al., 1992; IClebanoff S.J. et al., 1994; Лобзин Ю. В., 1998; Ерюхин H.A., 1998]. Результаты лечения инфицированных ран стафилококковой этиологии [Носов A.A., 1989, Лепилин A.B., 1994, Прохончуков A.A. и соавт., 1999] показали высокую терапевтическую эффективность применения лазерного излучения видимого и инфракрасного спектра, гипертермии, искусственных постоянных и переменных магнитных полей. Известно также, что действие лазерного излучения и переменных магнитных полей, используемых в физиотерапевтической клинической практике, усиливается в присутствии коллинеарного им постоянного магнитного поля [Боголюбов В.М. и соавт. 1998].

Многочисленные результаты микробиологических исследований, так же как и результаты клинического применения физиотерапевтических факторов физической природы, подтвердили особую актуальность проблемы поиска совокупности параметров комплексного магнитолазерного воздействия, которые определяют возникновение тех или иных физико-химических реакций в клетках тканей, глубину проникновения в них ЭМ излучения [Владимиров В.А., 1994, Королёв Ю. Н., 1996].

Однако данные ряда других исследований [Тифлова O.A., 1987; Кибисов Р.К.- 1997 Пасевич H.A., 1998] показали, что ни одна из существующих гипотез магнитолазерного воздействия не раскрывает полностью механизм действия физических факторов, а лишь демонстрирует множественность точек их приложения и к настоящему времени требует проведения целенаправленных исследований.

Приведенный выше анализ литературных данных свидетельствует о необходимости изучения разделённого и комплексного воздействия физических факторов — стационарного и нестационарного магнитных полей, ИК лазерного излучения с различной частотой следования импульсов.

Нуждаются в более широком изучении вопросы, посвящённые влиянию частоты модуляции магнитного поля на угнетение роста золотистого стафилококка как при разделённом воздействии нестационарного магнитного поля, так и при комплексном воздействии ИК лазерного излучения и магнитных полей. Поэтому работа была направлена на экспериментальное изучение влияния этих физических факторов на кинетику и динамику роста популяции клеток S. aureus как музейного штамма 209 Р, так и штаммов, выделенных от больных с гнойно-воспалительными процессами.

Нами исследовано влияние постоянного магнитного поля напряженностью 35 и 65 мТл, бегущих переменных и импульсных магнитных полей с различной частотой модуляции (0,5 Гц- 1,0 Гц- 10 Гц- 20 Гц) и лазерного ИК излучения с частотой следования импульсов 80-К3000 Гц как в отсутствие химиотерапевти-ческих препаратов, так и при совместном использовании физических факторов и ряда АБ препаратов.

Постановка этой задачи привела к необходимости создания нового устройства для микробиологических исследований. Приборы, использующиеся для физиотерапевтических процедур, например магнитотерапевтический аппарат «АТОС» и аппарат лазерный терапевтический «УЗОР», не позволили осуществлять комплексное воздействие на микроорганизмы стационарного и нестационарного магнитных полей и ИК излучения.

Нами было разработано, создано и внедрено в исследовательскую, а затем и в практическую деятельность бактериологических лабораторий устройство для микробиологических исследований, состоящее из камеры, внутри которой расположен столик с вращающейся подставкой под чашки Петри. В верхней крышке камеры выполнено отверстие и установлен корпус магнитного излучателя бегущего переменного магнитного поля, внутри которого расположен цилиндрический лазерный излучатель. Плоскость, в которой находятся оба торца излучателей совпадает с плоскостью верхней крышки камеры, причем отверстие в крышке камеры и оба излучателя соосны. На внешней цилиндрической поверхности излучателя бегущего переменного магнитного поля установлен источник постоянного магнитного поля в форме кольца с возможностью перемещения его по вертикали и ориентировкой постоянного магнитного поля в направлении распространения лазерного излучения. На разработанное устройство Комитетом по изобретениям получено свидетельство на полезную модель RU (11) 21 742 (13) U1 [Семенова О.П. и соавт., 2001].

При проведении исследований основное внимание было уделено обеспечению достоверности и возможной общности полученных результатов. С этой целью изучение воздействия физических факторов на угнетение роста штаммов культуры S. aureus проводилось тремя методами — спектра мутности для определения фаз роста, подсчета выросших колоний, диско-диффузионным, выбор которых задан следующими критериями:

— надёжность используемых методов должна быть подтверждена многолетней практикой микробиологических исследований;

— характеристики питательной среды, используемые для периодического культивирования микроорганизмов в каждом из них должны отличаться друг от друга;

— результаты измерений полученных величин для каждого метода должны поддаваться количественным оценкам.

Дополнительными условиями по выбору методов явились:

— любой из них должен реализоваться при комплексном воздействии выбранных физических факторов при помощи разработанного устройства для микробиологических исследований;

— энергия за время возбуждения на всех частотах следования импульсов лазерного излучения должна быть одинаковой.

Полученные нами результаты при изучении воздействия физических факторов на рост культуры S. aureus методом спектра мутности показали, что воздействия бегущих переменного и импульсного магнитных полей существенно различны — импульсное поле практически очень слабо угнетает рост S. aureus (0,2%), а в некоторых случаях даже стимулирует его, тогда как бегущее переменное поле угнетает рост тех же микроорганизмов (24% от контроля) при одинаковых значениях частот модуляции (10 Гц) для обоих видов полей. Выбор частоты модуляции бегущих импульсного и переменного магнитных полей (10 Гц), при которой отмечалось максимальное угнетение роста S. aureus, произведен по результатам предварительных исследований [Куляш Ю.В. и соавт., 1998].

Микробная деструкция большинства клеток культуры S. aureus под воздействием физических факторов, отмеченная в методе спектра мутности для определения фаз роста, началась с ограничения роста колоний. Одновременно происходят временные изменения в сторону удлинения лаг-фазы. Длительность лаг-фазы при разделённом влиянии бегущего переменного магнитного поля и РЖ лазерного излучения незначительно отличается от контроля. При комплексном воздействии этих лее факторов происходит &bdquo-затягивание" лаг-фазы до 6 часов (против 1,5−2 часов на контроле), что сказывается на уменьшении скорости роста культуры в экспоненциальной и стационарной фазах при сохранении постоянства величины отрицательного ускорения. Это подтверждает факт появления новой, видоизменённой структуры S. aureus, возникшей под воздействием лазерного излучения в комплексе со стационарными и нестационарными магнитными полями. Период лаг-фазы, определивший закономерности процессов, ответственных за дальнейшее поведение микроорганизмов, находился в прямой зависимости от параметров комплексного воздействия физических факторов. При значениях экспозиции 20−25 минут на дискретной частоте следования импульсов ИК излучения в 600 Гц активность роста S. aureus снижена в среднем на 56% (по сравнению с контролем).

Выявленная нами зависимость фаз роста бактериальной культуры от параметров воздействия факторов физической природы, полученная методом спектра мутности, подтверждена методом подсчёта выросших колоний при посевах бактериальной суспензии культуры S. aureus на плотные питательные среды. Величина разницы числа выросших колоний в результате раздельного и комплексного воздействия физических факторов (отдельно по каждому режиму) и контролю обеспечила достоверность общности полученных результатов.

Анализ угнетения роста штамма 209 Р под воздействием физических факторов в методе подсчёта выросших колоний, позволил сделать следующие выводы:

— бегущие переменные магнитные поля угнетали рост S. aureus на 38 ± 5% сильнее, чем импульсные при одном и том же значении частоты модуляции;

— бегущие переменные импульсные поля на частотах модуляции 1−5 Гц способствовали росту культуры (аналогичные результаты получены в исследованиях, проведённых методом спектра мутности для определения фаз роста);

— максимальное угнетение роста колоний для бегущего переменного магнитного поля наступило при значении частоты модуляции 10 Гц и экспозиции 20 мин;

— применение постоянных магнитов усиливало действие обоих типов полей как в сторону стимуляции роста S. aureus (бегущее импульсное переменное магнитное поле), так и в сторону угнетения роста (бегущее переменное магнитное поле), а постоянный магнит с индукцией 65 мТл был более эффективен (25%), чем 35 мТл (12% по отношению к контролю) в сочетании как с переменными, так и импульсными полями;

— применение комплекса бегущего переменного магнитного поля и поля постоянного магнита (65 мТл) позволило получить то же снижение роста числа колоний, что и в случае только одного переменного поля, но при меньшем значении экспозиции (15 мин);

— лазерное излучение инфракрасного диапазона длин волн в диапазоне частот следования импульсов (80 3000 Гц) влияло только на процессы угнетения роста, при этом степень угнетения меньше зависела от времени экспозиции, оставаясь постоянной практически как при 20 мин, так и при 10−12 мин;

— зависимость степени угнетения роста культуры S. aureus от дискретной частоты следования импульсов ИК лазерного излучения (80, 150, 300, 600,.

1500, 3000 Гц) явно выражена на частоте 600 Гц и на 28 — 35% выше, чем та же зависимость от частоты модуляции бегущего переменного магнитного поля.

Поскольку вклад в угнетение роста S. aureus постоянного магнитного поля индукцией 35 мТл меньше по сравнению с постоянным магнитным полем индукцией 65 мТл, далее для угнетения роста культуры мы применили комплексное воздействие бегущего переменного магнитного поля, ИК лазерного излучения и постоянного магнитного поля индукцией 65 мТл. в результате реализации метода подсчета выросших колоний, нами были определены оптимальные параметры комплексного магнитолазерного воздействия физических факторов. Максимально (55 ± 5% по соотношению площадей, ограниченных экспериментальными кривыми на графике к площади, ограниченной линией контроля) угнетающих рост штамма 209 Р культуры S.aureus.

Для аппарата «АТОС»:

— БПеМП — частота модуляции — 10 Гц.

Для аппарата AJIT «УЗОР»:

— ИКЛИ — длина волны излучения — 0,89 мкм, частота следования импульсов — 600 и 1500 Гц.

Для постоянного магнита:

— индукция постоянного магнитного поля — 65 мТл, ориентировка постоянного магнитного поля в направлении распространения лазерного излучения.

Практически они совпали с аналогичными параметрами тех же физических факторов, эмпирически найденными при экспериментальной реализации метода спектра мутности для определения фаз роста. Несмотря на разницу в среде обитания в экспериментах, проведенных по методам спектра мутности для определения фаз роста и подсчета выросших колоний отмечено наличие аналогичной реакции, управляемой за счет подбора оптимальной величины рабочих параметров воздействующих факторов и приводящей к угнетению роста.

S.aureus что позволило в полном объёме решить задачу исследования совместного применения АБ препаратов и физических факторов, поставленную в работе. Высокая трудоёмкость метода подсчёта выросших колоний при определении МПК и сложность подсчёта этих колоний в случае неоднородного характера распределения АБ по объёму суспензии, содержащей клетки культуры S. aureus, вызвала необходимость применения в качестве третьего — диско-диффузионного метода.

Дифференциация 28-и клинических штаммов по степени резистентности к 23-м АБ препаратам позволила распределить их на 3 группы по категориям чувствительности. В одной из них (&bdquo-условно чувствительные" - 14 штаммов и референтный 209 Р) резистентность к заданным АБ препаратов не превысила 30%. Из двух оставшихся групп одну (&bdquo-чувствительные") составили 2 штамма, вторую (&bdquo-резистентные", точнее &bdquo-полирезистентные") — 12 штаммов. Разделение штаммов S. aureus по категориям позволило нам в эксперименте доказать, что комплексное воздействие физических факторов на наименее рациональную в смысле применяемости к ним АБ препаратов категорию &bdquo-условно чувствительных" штаммов оказывает такой же эффект, как если бы эти штаммы попали в категорию &bdquo-чувствительных" по отношению к тем же АБ препаратам.

Комплексному магнитолазерному воздействию была подвергнута первая группа штаммов, поскольку получить увеличеиие степени угнетения роста за счёт воздействий физических факторов на уровнях влияния АБ препаратов категории &bdquo-чувствительных" к ним штаммов второй группы не представлял, по нашему мнению, достаточно убедительной информации, как и третьей, содержащей заведомо &bdquo-полирезистентные" штаммы.

Оптимальные параметры комплексного магнитолазерного воздействия физических факторов, угнетающих рост штаммов S. aureus первой группы, подтверждённых результатами, полученными диско-диффузионным методом, составили:

— бегущее переменное магнитное поле — частота модуляции — 10 Гц;

— ИК лазерное излучение — длина волны излучения — 0,89 мкм, частота следования импульсов — 600 Гц и 1500 Гц ;

— постоянное магнитное поле — индукция магнитного поля — 65 мТл, ориентировка постоянного магнитного поля в направлении распространения лазерного излучения;

— время экспозиции — 2 мин;

Оценка каждого из 15 штаммов первой группы по степени чувствительности к 19 АБ препаратам для окончательной проверки произведена на всех значениях частот следования ИКЛИ, а не только тех, на которых отмечена максимальная степень угнетения культуры S. aureus, как в методе подсчёта выросших колоний.

Определив диаметр зоны угнетения роста контрольного посева культуры вокруг стандартного диска с АБ, мы, тем самым, получили информацию о влиянии АБ препарата на штамм. Комплексное воздействие физических факторов: бегущего переменного магнитного поля с частотой модуляции 10 Гц, постоянного магнитного поля с индукцией 65 мТл), ИК лазерным излучением на частотах следования импульсов (80-К5000 Гц), совместно с применением АБ препаратов подтверждается ростом зоны угнетения исследуемой культуры, зафиксированной в результате применения диско-диффузионного метода. Величина диаметра зоны угнетения роста культуры S. aureus при этом включила интегральный эффект комплексного воздействия физических факторов и АБ препарата на соответствующий штамм первой группы (включая и 209 Р).

Долевое участие физических факторов на фоне угнетения роста культуры АБ препаратами, полученное нами в результате применения диско-диффузионного метода, реализовалось в интервале от 14,4 до 26,5% угнетения роста S. aureus при времени экспозиции воздействия 2 мин. Используя диско-диффузионный метод мы экспериментально доказали, что комплексное воздействие бегущего переменного магнитного поля, ИК лазерного излучения и постоянного магнитного поля при оптимальных параметрах и режимах, приведённых выше, уменьшает резистентность клинических штаммов к ряду АБ препаратов, характеризуемых до воздействия как &bdquo-умеренно чувствительные" .

Основываясь на выявленных положительных свойствах магнитолазерного воздействия нами были применены вышеуказанные оптимальные режимы ИК лазерного излучения, бегущего переменного и постоянного магнитного полей в клинической практике при лечении осложнений гнойно-септических инфекций, в частности абсцессов и флегмон.

Группой контроля послужили лица, лечившиеся традиционными методами. Основную группу составили больные, которые после оперативного вмешательства получили наряду с АБ терапией местное лечение комплексом импульсного ИК лазера &bdquo-УЗОР" с частотой следования импульсов 1500 Гц, бегущее переменное магнитное поле с частотой модуляции 10 Гц, постоянное магнитное поле индукцией 65 мТл, экспозицией 5 мин в течение 5−7 сеансов.

Клинические исследования показали, что применение комплексной магни-толазерной терапии привело к более быстрому прекращению гнойного отделяемого из раны, быстрее наступало гранулирование и эпитализация раны (4−5 сутки) по сравнению с больными контрольной группы. Исчезновение отека, рассасывание инфильтрата наблюдались на 4−5 день.

Важным показателем эффективности применения комплексного магнитолазерного воздействия при лечении больных явилось его бактерицидное влияние на возбудитель, оставшийся в содержимом очага поражения, в разные сроки наблюдения. На 3-й сутки после операции микробная колонизация раны в равной степени была выявлена у больных основной и контрольной групп. Особенно наглядно различие в количестве больных, у которых высевался стафилококк, проявлялось на 5-е сутки. Если в контрольной группе лечившейся по традиционной схеме в 63% случаях из очага поражения продолжал выделяться возбудитель, то после комплексной магнитолазерной терапии частота его высе-ваемости оказалась в 6,5 раз ниже. На 7-е сутки, высеваемость в контрольной группе составила 11,7%, а в основной группе отмечена почти полная санация раны (1,7% высеваемости S. aureus).

Помимо этого, после применения при лечении больных комплексного магнитолазерного воздействия, отмечено повышение чувствительности микробной флоры к АБ препаратам, к которым до воздействия на неё физическими факторами, микробная флора была умеренно чувствительной. Проведенные выше исследования доказали этот факт, in vivo" в клинических условиях.