Применение низкоинтенсивного лазерного излучения для коррекции цитокинового баланса и активности фагоцитоза возбудителей внутрибольничных инфекций (экспериментальное обоснование на модели лабораторных животных)

Актуальность проблемы., Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) широко используется в настоящее время в практической медицине в качестве эффективного лечебного и профилактического средства (Козлов, Буйлин, 1993; Илларионов, 1992, 1997; Владимиров- 1994, 1998; Кару, 1995, 1999; Брилль, 1997, 2005; Клебанов, 2001, 2005; Бугаева и др., 2004; Tuner, Hodl, 1996). Установлено, что даже небольшие дозы лазерногоизлучения оказываются достаточными: для получения выраженной ответной реакции, живой клетки, ткани и всего организма (Байбеков, 1991, 1996; Илларионов, 1992, 1994; Козлов, 1993; Девятков. и др, 1998;Артюхов, 1999; Брилль, 1999, 2005; Бугаева, 2006; Рудик, 2006).

Известночто воснове многих патологических процессов-лежат нарушения механизмов иммунологической защиты: (Сепиашвили, 2000— 2005; Ярилин, 2000; Хаитов и др., 2002; Елисеев и др., 2004). Несмотря на имеющиесяв литературе данные об иммуномодулирующем действии НИЛИ (Кау-легг и др., 1980; Першин, 1997; Бугаева, 2006), его влиянии на процесс фагоцитоза. и функциональное состояние фагоцитирующих клеток (Рязанцева и др., 2001; Брилль и др, 2003, 2005; Тихомирова, и др., 2004; Рудик, 2006), в отношении возможности его использования прилечении различных гнойно-воспалительных и инфекционных заболеваний многое остается неясным. Необходимость разработки новых немедикаментозных методов лечения обусловлена широким распространением лекарственноустойчивых штаммов возбудителей внутрибольничных инфекций (ВВБИ), которые при-тяжелых и генерализованных формах инфекции могут приводить к летальному исходу. Характер течения’и исход гнойно-септических заболеваний во^ многом определяется-нарушением цитокинового баланса между прои противовоспалительными цитокинами. В связи с этим разработка методов активации: защитных сил организма, коррекции цитокинового статуса и стимуляции эффективного киллинга бактерий имеет большое значение: ' ¦. 6.

Цель работы — экспериментальное обоснование использования НИЛИ, генерируемого полупроводниковыми лазерными диодами, для коррекции ци-токинового баланса и активности фагоцитоза ВВБИ при моделировании инфекционного процесса. ;

Для достижения указанной цели нами были поставлены и решены следующие задачи: .

1. Изучить активность процесса фагоцитоза возбудителей внутрибольнич-ных инфекций и индукцию провоспалительных цитокинов интактными перитонеальными макрофагами белых мышей в условиях in vitro.

2. Опрёделить действие ИК НИЛИ (А- - 890 нм) на активность, перитонеаль-ных макрофагов белых мышей и синтез цитокинов in vitro в процессе фагоцитоза ВВБИ.. ;

3. Выявить влияние ИК НИЛИ (к -890 нм) на активность кислородзависимо-го и кислороднезависимого киллинга бактерий в' макрофагах белых мышей ш vz'/ro в процессе фагоцитоза ВВБИ.

4. Изучить, цитокиновый статус организма экспериментальных животных при моделировании инфекционного процесса, введением возбудителей внутрибольничных инфекций.

5. Оценить иммунобиологическую значимость транскутанного облучения ИК1-ЩЛИ (?1 — 890 нм) инфицированных экспериментальных животных.

6. Определить возможность использования различных критериев комплексного иммунологического. мониторинга функций фагоцитирующих: клеток для оценки эффективности действия НИЛИ.

Научная новизна. Впервые было проведено комплексное исследование на организменномклеточном: и субклеточном уровнях влияния ИК НИЛИ (?V — 890 нм) in vitro и in vivo на фагоцитарную, цитокиновую, и функциональную активность перитонеальных макрофагов белых, мышей в отношении ВВБИ. Установлено, что ИК НИЛИ оказывает стимулирующее действие на все стадии фагоцитоза ВВБИ макрофагами. Показано влияние ИК НИЛИ in vitro и in vivo на синтез провоспалительных и регуляторных цито.

7 • •. кинов — ИЛ-la, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-a иИФН-у в процессе фагоцитоза ВВБИ. Дана оценка действия ИК НИЛИ на состояние кислороднезависимого и кислородзависимого киллинга бактерий в макрофагах. Определен комплекс наиболее информативных показателей эффективности действия НИЛИ на процесс фагоцитоза ВВБИ. Впервые экспериментально обоснована возможность использования ИК НИЛИ (А. — 890 нм) для коррекции цитокинового баланса на начальных стадиях инфекционного процесса, вызванного ВВБИ.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты вносят определенный, вклад в понимание эффектов, оказываемых лазерным излучением на различных уровнях организации биологических систем, и механизмов активации одного из основных факторов, естественной резистентности — фагоцитоза, исход которого во многом определяет развитие специфических иммунологических реакций организма. Отобраны наиболее информативные показатели количественных и качественных иммуноморфоло гических и функциональных изменений для оценки характерадействия ИК.

НИЛИ на активность фагоцитоза ВВБИ для рекомендации к применению' в биологических и медицинских исследованиях. Полученные результаты могут быть использованы в клинической практике для' стимуляции фагоцитарной функции в отношении ВВБИ и-коррекции^цитокинового статуса.

По материаламданной работы подготовлено научно-методическое пособие «Оценка эффективности действия НИЛИ ш и in vivo на: функциональную активность фагоцитирующих клеток». Материалы" диссертационного исследования^ используются при чтении лекций общих (иммунология, микробиология) и специальных (современные методы иммунологических исследований) курсов студентам биологического факультета ОГУ. Полученные результаты использованы при подготовке курсовых и дипломных работ, студентами биологического факультета СГУ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III Международном конгрессе молодых ученых и специали.

-. — - 8'.

1 • стов «Науки о человеке» (Томск, 2002) — Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002) — V Съезде иммунологов и аллергологов России (Санкт-Петербург, 2003) — Симпозиуме по оптическим технологиям в. биофизике и медицине «SARATOV FALL MEETING» (Саратов,' 2004) — Объединенном иммунологическом форуме и III съезде иммунологов: России (Екатеринбург, 2004) — Международномконгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005) — общероссийских научных конференциях «Гомеостаз иинфекционный процесс» (Москва, 2006, 2007) — X Всероссийском форуме «Дни иммунологии в. Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006) — Российской научно-практической конференции- «Современные технологиив иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006) — II Открытой Всероссийской научно-практической конференции «Молодежь и наука в XXI веке» (Ульяновск, 2007) — I конференциимолодых ученых медико-биологической секции Поволжской? ассоциации государственных университетов (ПАРУ, Ульяновск, 2007).,.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1: ИК 11ИЛИ (к — 890 нм) in vitro оказывает стимулирующее действиена все стадии фагоцитоза-ВВБИ перитонеальными макрофагами— белых мышей, усиливает синтез провоспалительных цитокинов, повышает интенсивность «респираторного взрыва» и активность миелопероксидазы в процессе кисло-родзависимого киллинга ВВБИ. !

2. PIK НИЛИ (А. — 890'нм) in vivo изменяет цитокиновыш баланс организма на начальных стадиях инфекционного процессатранскутанное облучение инфицированных мышей снижает гиперпродукцию ИЛ- 1а при стафилококковой, эшерихиозной и цитробактерной инфекциях, а также ФНО-а — при. стафилококковой инфекцииувеличивает содержание в сыворотке крови мышей ИЛ-6, ИФН-у и ИЛ-4. «.

3. 1−1аиболее информативными показателями эффективности действия ИК МИЛИ (X — 890 нм) на фагоцитарную функцию макрофагов в отношении.

ВВБИ являются: индекс завершенности фагоцитоза, содержание провоспали-тельных цитокинов — ИЛ-1 а, ФНО-а и ИФН-у, уровень активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте и активность миелопероксидазы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ и 1 научно-методическое пособие.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, главы «Современное состояние проблемы (обзор литературы)», главы «Материалы и методы исследований», четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 145 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 15 рисунками.

Список литературы

содержит 255 источников, в числе которых 187 отечественных и 68 зарубежных.

ВЫВОДЫ.

1. Выявлены различия в индукции провоепалительных цитокинов и характере фагоцитоза разных клинических штаммов ВВБИ перитонеальными макрофагами мышей in vitro. Процесс фагоцитоза энтеробактериш Serratia sp, Citrobacter sp. и E. agglomerans сопровождается незначительной активацией ПМФ и частичным перевариванием микробных клеток на фоне активной индукции ИЛ-1а и ФНО-а к 12 ч инкубации-: при незавершенном фагоцитозе^. coli содержание этих цитокинов превышает контрольные значения в 7 раз к 24 ч. Отмечена сходная динамика индукции цитокинов при разной активности процесса фагоцитоза клинических штаммов стафилококков:

2. ИК 11ИЛИ (к — 890 нм) in vitro оказывает зависимый от дозы стимулирующий эффект на все стадии фагоцитоза ВВБИ, синтез ИЛ- 1а, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-8: макрофагами мышей.

3. И К НИЛИ (X. — 890 нм) влияет на активность, кислороднезависимого и кислородзависимого киллинга ВВБИ в: макрофагах, вызываядостоверное: увеличение активности кислой фосфатазы, фазное изменение содержания ка-тионных белков, значительную активацию миелопероксидазы и увеличение образования активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте.

4. Показаны отличия в динамике содержания: основных цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных при внутрибрюшинном заражении разными клиническими штаммами: ВВБИ. Концентрация ИЛ-Га и ФНО-а увеличивается, в 5−7 раз по сравнению с контролем через 12 ч после введения S. aureus, E. coli и Citrobacter sp.- содержание ИЛ-б возрастает к 6 ч и снижается к 24 ч, превышая исходные значения, при введении клинических штаммов стафилококков.

5. Транскутанное облучение ИК НИЛИ через 3 и 6 ч после заражения животных изменяет баланс провоепалительных цитокинов в сыворотке крови: снижается гиперпродукция: ИЛ-1а при стафилококковой, эшерихиозной и цитробактерной инфекциях, ФНО-а — при стафилококковой инфекцииповышается содержание ИНФ-у и усиливается процесс фагоцитоза ВВБИ в пе-ритонеальных макрофагах.

6. Наиболее информативными показателями эффективности действия ИК НИЛИ на процесс фагоцитоза ВВБИ являются индекс завершенности фагоцитоза, содержание провоспалительных цитокинов — ИЛ-1 а, ФНО-а и ИФН-у, уровень образования активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте и активность миелопероксидазы.

109,.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Одним из наиболее: перспективно развивающихся направлений современной биофизики является лазерная биофизика, основной задачей которой является, изучение эффектовоказываемых лазерным излучением на биологическую систему на всех уровнях организации живой материиОсобый, науч-. ный. интерес представляет исследование влияние, НИЛИ на биологические объекты в связи с тем, что оно нашло широкое применение в различных областях медицины, для достижения выраженного, терапевтического эффекта.

Многими авторамибыло отмеченочто лазерное воздействие: с низкой.- энергией активизирует многие метаболические процессы в организме, повышает энергетический обмен, оказывает анальгезирующий эффект и противовоспалительное действие, стимулирует репаративные процессы, а также нормализует общий иммунитет и повышает резистентность, организма (Клейм, 1981; Кару и др., 1983; Кузьмина, 1984; Кузник, 1989; Байбеков и др., 1991; Козлов, Буйлин, 1995; Брискин и др., 1996). При этом НИЛИ практически не имеет противопоказаний и лишено побочного действия (Головин и др, 2003; Ибадова и др., 1995). Несмотря на столь необычайную широту терапевтических эффектов НИЛИ, до настоящего времени остается не выясненным вопрос о причинах его терапевтической эффективности и о механйз-мах его влияния на биологическую систему.

По мнению некоторых авторов, терапевтическая эффективность лазер' ' '. ного излучения с низкой интенсивностью основана на’многофакторном, воздействии излучения на все уровни, организации живой-материи (Крюк, 1986; ОЬзЫго, Са1ёегЬеас1, 1988; Илларионов, 1992; Брискин и др., 1996);

Г. И. Клебанов (1999) указывал на то, что существует некое общее звенов патогенезе всех нозологических форм: заболеваний, в терапии которых благотворно проявляется лазеротерапия. Это подразумевает наличие единого общего механизма действия НИЛИ применительно ко всем патологиям, а не множества разнообразных индивидуальных реакций для каждого конкретного заболевания. Наиболее вероятно, что таким связующим звеном является ¦ -, по универсальный патологический процесс, а именно: — воспаление, которое встречается во многих случаях применения лазеротерапии, и либо играет роль ведущего патогенетического звеналибо • носит реактивный, характер. (Seymor et al., 1978; Клебанов и др., 1998; Клебанов, Владимиров, 1999).) Мы полагаем, что в основе многих наблюдаемых эффектов-НИЛИ^лежит, в первую очередь, его модулирующее воздействие на процесс фагоцитоза и связанные с ним реакции: воспаленияконкретные механизмы действия I • которых, к сожалению, на сегодня остаются гипотетическими, i-: Базой для развертывания специфических иммунных процессов, являются реакции, связанные с воспалением. Поскольку они присутствуют в любом-организме до начала агрессии, их называют естественными (Галактионов, 2004). При этом основными свойствами естественного в отличие от при. обретенного иммунитета всегда считалась, быстрая реакция на чужеродные — I агенты и полное отсутствие какой-либо специфичности ответа. Данные, полученные в последние годы, заставляют совершенно по-новому взглянуть на роль механизмов естественной резистентности, лежащих в основе врожденного — иммунитета (Ройт и др., 1995). На настоящий момент стало совершенно оче.

I видно, что эффекторы естественной резистентностиспособны различатьсвои. и потенциально опасные для организма чужеродные структуры (Luster, — 2002).- Доказано также, что система естественной резистентности выполняет инструктивную функциюопределяя вкаком, направлении будет развиваться приобретенный иммунитет (Fearon, Locksley, 1996)".. -I Фагоцитоз, как. известно, является одним изважнейших механизмов защиты организма от бактериальных инфекций и^занимает оербое место среди факторов естественной резистентности. Явление фагоцитоза стало предi ' - метом изучения, а затем и методом исследования функции фагоцитирующих клеток, благодаря работам И. И. Мечникова (1883 — 1892).

Процесс фагоцитоза осуществляют фагоциты — специализированная.

•¦'. группа клеток, обладающих способностью к поглощению и уничтожению живых и мертвых микроорганизмов, различных клеток, органических и неорi ¦., '¦¦¦ ' 111 ' - ' ' ганических частиц, что относится: к проявлениям врожденного’иммунитета (Роит и др., 2000).

Макрофагишредставляют собой главный тип клеток, системы-мононук-леарных фагоцитов (Фрейдлин, 1984). Основная, функция1 макрофагов — фагоцитоз, особенно внутриклсточно размножающихся микробов. Кроме того, они в кооперации с Ги В-лимфоцитами участвуют в: индукции, реализации. и регуляции иммунного ответаспособны, при1 определенных условиях проявлять, цитотоксическое действие на опухолевые клетки. (Галактионов, 2004) — Секретируют лизоцим, компоненты комплемента, интерфероны,. интерлейт киньг, колониестимулирующие факторы. В свою очередь функция макрофагов регулируется’интерлейкинами (КетлинскийКалинина- 1995.):.

Расширение: представлений о функциях фагоцитирующих клеток в последние годьг было, в, первую очередь, связано с разработкой учения о секреторной активности этих клеток (ТотолянФрейдлин, 2000; Долгушин, Бухарин. 2001). За последние годы значительно расширились знания о продукции цитокинов, спектр. и механизм действия которых значительнорасширился (Кетлинский, Симбирцев, Воробьев, 1992; Кетлинский, Калинина, 1995; Симбирцев, 2004).Цитокины обеспечивают интеграцию функциональной активности фагоцитов, от которых в значительной степени зависит активация, пролиферация и дифференцировка иммунокомпетентных клеток.

Известно, что взаимодействие МИЛИ с клетками вызывает изменения их функциональнойактивности, нарушения в стационарном? состоянии клеточного гомеостаза, — усиление1 синтеза сигнальных, и регуляторных молекул (Медуницин, Литвинов, Мороз,. 1980; Кузник, Васильев, Цыбиков, 1989). В связи с этим изучение особенностей продукции цитокинов, с помощьюкоторых осуществляются процессы авторегуляции функций, воспалительных и иммунных процессов, представляет особый научный интерес., Наиболее’важ ". ной группой цитокинов,, принимающих участие в регуляции воспаленияи фагоцитоза, являются провоспалительные цитокины, такие как ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а, ИЛ-8, ИФН-у и некоторых других, которые опосредуют общие гематологические сдвиги, характерные для неспецифического ответа макроорганизма на: инфекцию (Ярилин, 1997; Хаитов, Игнатьева, Сидорович, 2000). Они играют центральную роль в развитии острой фазы, воспаления, вызываемого проникновением, инфекционного агента и — повреждением' тканей. (Кетлинский, Калинина, 1995; Хаитов и др., 2000;. Демьянов, Котов, Симбир-цев, 2003).

Имеющиеся в литературенаучные данные свидетельствуют о том, что фагоциты обладают мощными-системами кислородзависимого и кислородне-зависимого киллинга бактерий. Компоненты первой действуют неспецифично, разрушают грамположительные и грамотрица’гельные бактерии, вирусы и клетки организма-хозяина, включая сами фагоциты. Вторая' система состоит из множествабелков ипептидов, обладающих в разной степени выраженной антимикробной: активностью по отношению к, различным клеткам-мишеням: Неферментные катионные белки являются одним: из мощных факторов неспецифической защиты организма, так как обладают сильным антибактериальным действием и выполняют функцию нейтрализации и умерщвления фагоцитированных бактерий (Тотолян, Фрейдлин, 2000). «'.

К другим белкам, обладающим антимикробным действием, относится фермент миелопероксидаза! Это железосодержащий фермент, которыйвместе с перекисью водорода и галоидами образует мощную миелопероксидаз-ную систему фагоцитов. Существует несколько концепций: о системах регенерации перекиси водорода в покоящихся-:и фагоцитирующих нейтрофилах. Согласно одной из них, ведущей системой регенерацииперекисиводорода является НАДФ-Н2-оксидазная система (Ройт и др, 2000).

• Следует отметить также, что кроме антибактериального действия мие-лопероксидазная система, обладает и антитоксической функциейТаким образом, фагоциты имеют на вооружении «мощную миелопероксидазную систему с многогранным спектром, действия».: Исследованию состояния микро-боцидных систем уделяется впоследние годы особое внимание, поскольку показана их важная роль в обеспечении: фагоцитарной реакции, а также опре > деленные возможности в диагностике и прогнозировании инфекционной и неинфекционной патологии (Коротяев, Бабичев, 2002). В связи с этим оценка ' из характера влияния и изучение механизмов действия ¡-НИЛИ? на фагоцитарную активность, представляет особый научный интерес: для понимания терапевтической эффективности данного типа воздействия на организм Bt целом:

Значительное количество цитокинов, продуцируемых макрофагами, отражает их полифункциональность в регуляции многих систем-, организма. Активация/ макрофагов ! цитокинами, последующая выработка! спектра: цитокинов макрофагами, могут предопределить дальнейшую успешную защиту от микроорганизмов, на очень ранней стадии инфекционного1 процесса. Это представляется чрезвычайно актуальным в связи с-: проблемой? борьбы с антибиотикоустойчивыми штаммами внутрибольничных инфекций" Широкое распространение и. Bi ряде случаев тяжелое течение заболеванийвызываемых лекарственноустойчивымиштаммами, определяется биологическими' свойствами возбудителейВ связи с этим разработка методов ¡-активации защитных сил организмачеловека и животных, где огромную роль ¦ играют цитокины, является приоритетным. • ¦

В связи с вышеизложенным представляло интерес в, комплексных исследованиях оценить характер воздействия НИЛИ, генерируемого полупроводниковыми, лазерными приборами, на функциональную' активность фагоцитирующих клеток, и коррекцию цитокинового баланса и активности процесса фагоцитоза .ВВБИ1 при моделировании инфекционного: процесса.

На первом этапе. исследований: намибыла изучена активность процесса фагоцитоза перитонеальными макрофагами энтеробактерий: Е. agglomerans, Serratia sp., Citrobacter sp., E. coli 21 и E. coli K-13. Был. проведен. сравнительный анализ, данных по активности макрофагов, степени, завершенности процесса фагоцитоза микробных клеток и индукции, цитокинов. Установлено, что процесс незавершенного фагоцитоза: энтеробактерийSerratia spи Citrobacter sp. сопровождался достоверным повышением к 12 ч содержания в среде: культивирования макрофагов ИЛ- 1а. и ФНО-а, и незначительным — ИЛ-6: Частичное переваривание бактерий E. agglomerans в, макрофагах происходило на фоне динамичного увеличения концентрации ИЛ-1а, ИЛ^-б и ФНО-а в интервале от 3 до 24 ч наблюдения. При фагоцитозе Е. coli содержание ИЛ-l a и ФНО-a превышало контрольные показатели в 7 и 6 раз соответственно к 24 ч эксперимента. .',•'" .

Однако динамика активности макрофагов была менее выраженной: по сравнению с данными в отношении: других энтеробактерий, что^ сопровождалось незавершенным фагоцитозом. Был установлен цитопатический характер действияклинических штаммов энтеробактерий на макрофаги/ к 24 ч процесса фагоцитоза, проявляющийся появлением большого числа разрушенных клеток.

Сравнение индукции синтеза, провоспалительных цитокинов при фагоцитозе клинических штаммов стафилококков позволило отметить сходную динамику: незначительное увеличение содержания цитокинов. к, 3, ч> процесса фагоцитоза и резкое снижение их уровня к концу срока наблюдения. В тоже время индукция ФНО-a была высокой для штамма S. aureus. Это сопровождалось. снижением числа, активных макрофагов: и низким индексом: завершенности фагоцитоза, показателем частичного5 переваривания: микробных клеток.

При фагоцитозе S. epidermidisMeHee выраженная динамика активности макрофагов и невысокие, значения-'индекса завершенности сопровождались увеличением синтеза ИЛ-1а-и снюкением содержания: ФНО-a до уровня контрольных значений к 24 ч. Аналогичное увеличение’концентрации ФНО-a отмечено и в процессе фагоцитоза микробных клеток Shaemolyticus. При этом максимальное содержание: ИЛ-la отмечено через 6 часов с последующим снижением к 24 ч. Число активных макрофагов и значения индекса завершенности фагоцитоза были выше, чем при фагоцитозе S. aureus.

Затем было изучено влияние ИК НИЛИ (890'нм) с различными дозами in vitro на активность процесса фагоцитоза возбудителей внутрибольничных инфекций и индукцию провоспалительных цитокинов: былоустановлено’Выраженное стимулирующее действие данного излученияна активность фагоцитоза на, всех его стадиях, на завершенность этого процесса, а также на фагоцитарную активность самих фагоцитов. Показано, что данный вид излучения приводил к значительному усилению процессов адгезии' бактериальных клеток на макрофагах. Установлено также, что увеличение дозы излучения1.

О. • до 1500 мДж/см" вызывало значительное повышение активности макрофагов. на-1, 3 и 6 ч фагоцитоза. При этом был выявлен дозозависимый эффект данного воздействия, особенно через 1 и 3 ч фагоцитоза. Полученные значения. ИЗФ свидетельствуют об увеличении числа, фагоцитов, завершивших процесс фагоцитозамикроорганизмов по сравнению с контролем (при Р<0,05).

Определение1 уровня: продукции провоспалительных и регуляторных цитокинов является необходимым условием при, оценке влияния МИЛИ на фагоцитарную активность макрофаговтак как позволяет оценить уровень, их функциональной активности при фагоцитозе на фоне лазерного воздействия * по сравнению с интактными клетками.

В наших экспериментах показано влияние И К МИЛИ с длиной волны 890 нм с различными дозами на динамику продукции макрофагами ИЛ-1,. ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-4 и ИЛ-8, что позволяет сделать заключение о еш модулирующем влиянии на цитокиновую активность фагоцитов. Для большинства цитокинов это влияние носило стимулирующий характер. Причем в некоторых случаях был отмечен дозозависимый эффект действия ПИЛИ.

Рассуждая о причинах изменения цитокиновой. активности^ клеток, под. влиянием-НИЛИ следует отметить, что снижение или увеличение синтезацитокинов, может быть следствием’как прямого действия лазерного’света, так. и косвенного: В результате прямой^активации продукции-цитокинов! возможны варианты, когда НИЛИ либо оказывает действие на экспрессию: цитоки-новых генов (регуляторные. или структурные гены, промоторы цитокинов), либо приводят к переходу неактивных, форм цитокина (молекул-предшественников) в биологически активную форму. Вариантов косвенного влияния может быть достаточно много. Увеличение цитокиновой активности фагоцитов’может быть следствием активациигенетическогоаппарата клетки-', белок-синтезирующей системы, ферментного комплекса. О другой стороны, показанное ранее повышение фагоцитарной активности макрофагов и ней-трофилов под влиянием ИК НИЛИ может быть как причиной увеличенияцитокиновой активности данных клеток, так и следствием этого процесса.

Следует отметить, что в наших, экспериментах увеличение продукции ИЛ-1 фагоцитирующими макрофагами под влиянием ИК НИЛИ (890 им). значительно коррелировало с увеличением продукции ФНО-а. Этот факт может быть объяснен темчто ФНО-а является — сильным стимулирующим агентом для продукции ИЛ-1 (Хаитов и др., 2000). Так, повышение содержания ФНО-а в среде культивирования фагоцитов могло привести к, увеличег нию продукции ИЛ-1.

Также показано, что ИК НИЛИ (890 нм) при действии всеми испытуемыми дозами на, фагоцитирующие макрофаги приводило к значительному увеличению продукции. ИФН-у как к 3, так и-к 6 ч фагоцитоза: При. изучении образования ИЛ-4 под влиянием НИЛИ впроцессе фагоцитоза было установлено, что в среде культивирования перитонеальных макрофаговего содержание не изменялось. Показано достоверное.увеличение ИЛ-8 только че- ¦ рез 3 ч фагоцитоза, к 6 же часам значения его продукциибыли на уровне контроля. Мы полагаемчто к: 6 ч инкубации клеток происходит связываниеИЛ-8: с соответствующими рецепторами на поверхностинейтрофилов., .

Следует отметить, что-определение цитокиновой продукции являетсяочень информативным показателем при оценке функциональной активности макрофаговна фоне действияНИЛИ:. Так, уровень секреторнойактивности этих клеток отражается на уровне их фагоцитарной активности, течении самого процесса фагоцитоза и его завершенности. В связи с этим изучение и ' понимание процессов, связанных с цитокиновойактивностью фагоцитирующих клеток должнолежать в основе грамотного применения НИЛИс различными дозами в медицинской практике при использованиинизкоинтенсивной лазерной терапии. Особенно это важно при лечении-воспалительных' и инфекционных заболеваний.

На. следующем этапе работыбыли проведены, исследованиявлияния ИК НИЛИ с длиной волны 890 нм на функциональную активность фагоцитов, заключающиеся в оценке механизмов кислородзависимого'1 и кислород-' ' независимого, киллинга бактерий. Показано стимулирующее действие данного: вида НИЛИ в испытуемом диапазоне доз облучения на функциональное состояние неактивных и активированных бактериями фагоцитов. Установлено, что при действии-, НИЛИ на макрофаги происходило достоверное увеличение активности кислой фосфатазы в различные сроки фагоцитоза S.anreus. Различные дозы излучения приводили либо к увеличениюлибо снижению активности щелочной фосфотазы в фагоцитах. Это может быть связано с тем, чточасть ЩФрегистрируется вместе с КФ, так как она обладает широким диапазоном рН активности., '.

При определении катионных белков в цитоплазме фагоцитов установлены достоверные изменения в их содержании в зависимости от дозы, излучения и этапа фагоцитоза. Показаночто облучение макрофагов ИК. НИЛИ (890 нм) способствовало увеличению содержания КБ в цитоплазме неактивных клеток до начала фагоцитоза и через 6 ч фагоцитоза, к 1 и 3 ч процесса, напротивотмечено увеличение количества данных белков.

Для оценкикислородзависимого киллинга определяли активность мие-лопероксидазы и уровень образования АФК по показателям спонтанного и индуцированного НСТ-теста в макрофагах и нейтрофилах в процессе фагоцитоза in vitro бактериальных клеток. Показано, что при воздействии ИК НИЛИ (890 нм) происходило увеличение: активности миелопероксидазыв фагоцитирующих макрофагах во все сроки фагоцитоза, однако на. неактивные фагоциты достоверного влияния данное излучение не оказывало.

В наших исследованиях отмечено значительноеувеличение образования АФК при «респираторном взрыве» у макрофагов на фоне действия ИК НИЛИ, по сравнениюс контрольными значениямиПричем. наиболее выраженное влияние данное излучение оказывало на показатели индуцированного НСТ-теста по. сравнению' с показателями спонтанного НСТ-теста. Следует отметить, что установленная закономерность носила дозозависимый характер. *.

Таким образом, достоверно установлено стимулирующие действиеИК НИЛИ (890 нм) на интенсивность «респираторного взрыва» и активацию миелопероксидазозависимого киллинга бактерий в макрофагах при фагоцитозе ВВБИ. Следовательно, можно сделать заключение о стимулирующем характере действия ИК НИЛИ с длиной волны 890 нм на. функциональную активность макрофаговчто в свою очередь способствует более активному уничтожению и разрушению поглощенных бактерий иобеспечивает успешное завершение фагоцитоза. Важно, что интенсификация: всех перечисленных, процессов в: комплексе положительно сказываетсяна эффективностипротекания остройвоспалительной реакции в организме локально ¡-в. месте внедренияинфекционного агента. Этонаходит свое, отражение в эффективности использования? И К НИЛИпри лечении и профилактике острых и хронических инфекционных заболеваний.

Исследования действия. НИЛИ' на функциональнуюР активность' фагоцитов былипроведены на субклеточном и клеточном уровнях. Однако это не означает, что обнаруженные эффекты фотоактивации фагоцитов неприводят: ¦ к изменениям на других уровнях организациибиосисистемы: тканевом, системном. и организменном. Очевидно, что активация лазерным светом, фагоцитов, помимо того, что приводит к более эффективному фагоцитозу, она по- -вышает секреторную активность данных клеток. Это подтверждается в усилении продукции основных провоспалйтельных цитокинов, которые облада-. ют рядом системных эффектов, таких как усиление воспалительнойреакции-., улучшение кровоснабжения тканей' и снижение гипоксии, повышение про-коагулянтнош активности, проницаемости капилляров, и активации-: других клеток. Кроме того, усиливаетсяобразование других биологически активных веществ — медиатороввоспалениябелков острой фазы, компонентов комплемента. Усиление эффекторных функций фагоцитирующих’клеток и успешный киллинг поглощенных бактерий способствуют более активному формированию адаптивного иммунитета. В связис этим, полученные результаты обосновывают перспективы для< дальнейшего изучения биологической эффективности низкоинтенсивного лазерного излучения: на уровне всего организма. .

Известно, что-результаты, полученные при, моделировании реакций ш vitro, не всегда соответствуют таковым in vivo, поскольку внутри организма огромное значение имеет взаимное влияние клеток (эффект микроокружения) и механизмы системного нейро-гормонального контроля. В этой связи представляло интерес оценить цитокиновый статус opraHH3Ma экспериментальных животных при моделировании инфекционного процесса клиническими штаммами бактерий на фоне действия ИК НИЛИ in vivo.

В серии предварительных экспериментов былаизучена динамика содержания цитокинов в сыворотке крови, мышей-после заражения различными1 ВВБИ. Показано, что введение внутрибрюшинно мышам клинического штамма S. aureus сопровождалось одновременным увеличением содержания в сыворотке крови И J1−1 и ФЫО-а, превышающим контрольные значения в 5−7 раз к 24 ч, что отражало динамику инфекционного процесса, Такая гиперпродукция основных провоспалительных цитокинов приводила к развитию у этих животных: клинической картины эндотоксического> шока: Концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови достоверно увеличивалась в к 6 ч и снижалась к 24 ч, оставаясь при этом выше исходных значенийПривведении S. haemolyticus содержание ИЛ-1' было достоверно вышеконтрольных^значений через 1, 6 и 24 ч, ИЛ-6 — через 6 и 24 ч, а ФНО-ачерез 1 ч, после чего оставалось без изменений в последующие часы наблюдения.

При моделированииинфекционного процесса внутрибрюшинное введение мышам взвеси, суточных культур энтеробактерий сопровождалось резкой индукцией синтеза ИЛ-la и ФНО-а, содержание которых в 3−5 раз превышало контрольные значения в сыворотке крови, через 12 и 24 ч. Концентрация ИЛ-6 была достоверно выше контрольных значений через! 6 и 12 ч, а ИФН-а — через 6 и 24 ч. Выявлен также незавершенный-характер фагоцитоза ВВБИ перитонеальными макрофагами в организме инфицированных животных, исодержание в перитонеальном экссудате значительного числа разрушенных и апоптотичных фагоцитов.

Применение транскутанного облучения инфицированных животных аппаратом АЛТ «Узор» через 3 и 6 ч после заражения ¿-изменяло цитокиновый статус животных в динамике модельного инфекционного процесса. Отмечено снижение гиперпродукции ИЛ-1 и ФНО-а, наиболее выраженное при стафилококковойинфекции. При эшерихиозной и цитробактерной инфекциях через 6 и 24 ч после заражения отмечена разная степень снижения содержания цитокинов в, зависимости от действия ИК НИЛИПоказано увеличение содержания' ФНО-а при1 действии-.НИЛИ 'через 3 ч после инфицирования Citrobacter sp. При эшерихиозной инфекции увеличение содержания ФНО-а в сыворотке крови животных по сравнению с контролем происходило через 3 и 6 ч после облучения. Интересен факт определенияв. сыворотке кровиинфицированных мышей через 6 и 12 ч после транскутанного облучения ИФН-у и ИЛ-8 в небольших концентрациях (в сыворотке крови животных контрольных групп ИЛ-8 не' обнаруживался). Макрофаги, выделенные из пери-тонеального экссудата мышей через 3' и 6 ч после облучениябыли гипертрофированы и деформированы. Процессы адгезии и внутриклеточного киллин-га ими бактерий проходили активно.

Таким образом, результаты-исследования, свидетельствуют овыраженном модулирующем действии: ИК НИЛИ- (Х-890 нм) на цитокиновый баланс в организме экспериментальных животных при фагоцитозе ВВБИ. Это дает основание предполагать возможность, коррекции с помощью ИК НИЛИ иммунного статуса инфицированных животных на фоне развития патологического, процесса, вызванного ВВБИ;

В ¡-результате проведенных исследований были отобраны наиболее, информативные показатели эффективности: действия ИК НИЛИ на фагоциты: ИЗФ, содержание провоспалительных цитокинов — ИЛ-1 а, ФНО-а и ИФН-ууровень образования-АФК в индуцированном НСТ-тесте и активность мие-лопероксидазы. Комплекс этих показателейпозволяет судить о. характере и, иммунобиологической значимости изменений в процессе фагоцитоза бактерий и может быть использован для оценки эффективности действия ИК НИЛИ при лазеротерапии инфекционных заболеваний;

Полученные результаты конкретизируют существующие, представления о биологической активности лазерного излучения: в отношении активации факторов естественной резистентности организма.