Изучение структуры транспортного вирусного рибонуклеопротеида X вируса картофеля и способов трансляционной активации РНК в его составе

Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является одной из наиболее интенсивно изучаемых проблем современной фитовирусологии.

В момент заражения растения вирусом только небольшое количество клеток оказывается инфицированными. Для развития инфекции необходимо перемещение вируса от зараженных клеток в здоровые. Межклеточный транспорт фитовирусов является активным процессом, происходит через плазмодесмы и для него необходимы кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ) (Atabekov & Dorokhov, 1984; Atabekov & Taliansky, 1990).

Объект нашего исследования — X вирус картофеля (ХВК) — типичный представитель рода Potexvirus семейства Flexiviridae, содержащий геномную одноцепочечную «плюс» РНК.

В литературе были предложены две модели транспортной формы при межклеточной транслокации генома потексвирусов: нативные вирионы (Oparka et al., 1996; Santa Cruz et al., 1998) или комплексы невирионного типа, состоящие из вирусной РНК, белка оболочки (БО) и транспортного белка (ТБ1) (Lough et al., 1998; 2000). При изучении транспортной формы вируса Lough et al. (1998) инкубировали вирусную РНК с БО и ТБ1 и использовали смесь для микроинъекций. Однако структура таких комплексов изучена не была.

Независимо от структуры транспортной формы, вирусная РНК в ее составе должна исключается из процессов репликации и трансляции и вновь становится доступной для рибосом в процессе развития инфекции.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что в отличие от ряда вирусов, РНК ХВК в составе вириона недоступна для рибосом. Но она становится доступной в результате: 1) фосфорилирования Nконцевого полипептида БО вируса in situ протеинкиназами серинового типа или 2) при взаимодействи ХВК с ТБ1 (Atabekov et al., 2000; 2001; Rodionova et al., 2003;).

В связи с этим, целью настоящей работы было изучение структуры рибонуклеопротеидов, собранных in vitro из РНК, БО и ТБ1 ХВК (возможной транспортной формы потексвирусов), а также выяснение возможности трансляционной активации РНК ХВК в составе тройных комплексов РНК-БО-ТБ1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Вирусы рода Potexvirus семейства Flexviridae представляют собой нитевидные вирионы длиной 470−580 нм и шириной около 13 нм с однонитевой позитивной геномной РНК размером от 5,8 до 7,0×106 (Atabekov, 1995). Геномная РНК содержит на 5'-конце кэп-структуру, на 3'-конце — полиА-последовательность и, как правило, 5 открытых рамок считывания (ОРС). 5'-проксимальный ген кодирует вирусную репликазу массой 165 кДа, транслирующуюся непосредственно с геномной РНКтри транспортных белка (ТБ1, ТБ2, ТБЗ — продукты «тройного блока генов») и белок оболочки транслируются с субгеномных РНК (Morozov et al., 1991). ОРС 5 на 3'-конце генома кодирует белок оболочки размером от 18 до 27 кДа.

Типовым представителем рода Potexvirus является X вирус картофеля (ХВК). Вирионы ХВК представляют собой гибкие нитевидные частицы длиной 515 нм и диаметром 13.5 нм. Вирион ХВК содержит около 1300 идентичных субъединиц белка оболочки (БО), упакованных в виде спирали, между оборотами которых заключена вирусная РНК (Tollin and Wilson, 1998). 8.9 субъединиц БО (каждая субъединица состоит из 236 аминокислотных остатков) приходится на один шаг спирали длиной 3,4 нм (Varma et al., 1968; Parker et al., 2002). Его геном представлен одноцепочечной «плюс» РНК длиной 6435 нуклеотидов (Skryabin et al., 1988). РНК ХВК кодирует пять белков: вирусную репликазу массой 165 кДа, три транспортных белка (ТБ1, ТБ2, ТБЗ массами 25 кДа, 12 кДа и 8 — кДа, соответсвенно) и БО массой 25 кДа (Morozov et al., 1991).

Для межклеточного транспорта ХВК необходимы все три транспортных белка (Morozov et al., 1991), а также БО (Chapman et al.,. 1992). Наиболее изученным является продукт первой ОРС ТБГ с молекулярной массой 25К (ТБ1). ТБ1 способен увеличивать пропускную способность плазмодесм (Lough et al., 2000) — содержит последовательности, характерные для хеликаз (Gorbalenya et al., 1988) — кроме того 25К обладает активностью ]^2±зависимой НТФазы и слабой РНК-связывающей активностью (Kalinina et al., 1996, 2002). Также ТБ1 является супрессором посттранскрипционного умолкания генов в растениях (Voinnet et al., 2000).

1. Сборка потексвирусов in vitro.

Вирусы обладают уникальной способностью к самосборке in vitro. ХВК является первым нитевидным вирусом растений реконструированным in vitro из РНК и БО (Новиков и др., 1972; Goodman et al., 1975; Kaftanova et al., 1975; Dobrov and Atabekov, 1989; Goodman, 1977). Реконструкция вирусных частиц была наиболее эффективной при рН от 6,5 до 7,0 от 20 до 25 °C и низкой ионной силе инкубационного буфера (0,01 М). В этих условиях выход реконструированных частиц составлял 40−60%. При повышении ионной силы при добавлении в инкубационную смесь NaCl или КС1 до концентрации 0,1 М сборка не происходила. По данным электронной микроскопии, полученные реконструированные частицы отличались от нативного вируса более рыхлой структурой и меньшей длиной частиц по сравнению с вирионами ХВК (Новиков и др., 1972). Однако в работе Kaftanova с соавторами (1975) не были обнаружены различия в структуре вириона и вирусного рибонуклеопротеида (вРНП), реконструированного из РНК и БО ХВК. Инфекционность таких частиц была ниже нативного ХВК (Dobrov and Atabekov., 1989).

Схожие результаты были получены Goodman с соавторами (Goodman et al., 1975, 1976, 1977), который использовал штамм XnR ХВК. Goodman с соавторами показал, что наиболее эффективно реконструкция идет при более низких рН (6,0 — 6,2), а в течение первых минут реконструкции мутность раствора увеличивается более чем на 50% (OD3i0).

Goodman et al., 1975). Было обнаружено, что, несмотря на то, что 0,1 М NaCl ингибирует сборку ХВК (Новиков и др., 1972), сборка не ингибировалась при добавлении в инкубационную смесь цвиттер-ионного буфера (например, бицин или морфолин) до конечной концентрации 0,2 М (Goodman et al., 1975).

Для другого потексвируса, вируса мозаики папайи (ВМП), обнаружено, что наиболее эффективно реконструкция происходит при рН 8.0, 25 °C и низкой ионной силе. Эффективность образования реконструированных частиц в этих условиях достигала 90%, но инфекционность была низкой (всего несколько процентов) (Erickson and Bancroft, 1978), как и в случае реконструированных частиц ХВК. Показано, о что на первом этапе сборки ВМП формируются короткие (около 500А) частицы, независимо от температуры (от 1 °C до 25°С), но элонгация происходит только при 25 °C. При 1 °C (или 25 °C, но с небольшим количеством белка) образуются только короткие частицы. Фрагменты РНК, выделенные из этих частиц, имели длину около 200 нуютеотидов с 5'-конца. Определен нуклеотидный набор этих фрагментов. Было обнаружено, что эти фрагменты РНК богаты аденином (42% против 33% в тотальной РНК) и бедны гуанином (16 против 22%, соответственно) (Abou-Haidar and Bancroft, 1978).

Основные результаты по реконструкции потексвирусов были получены несколько десятилетий назад. С тех пор изменились методы получения чистых препаратов, компонентов вируса, не содержащих примеси клеточных ферментов. Недавние эксперименты показали, что в случае, если в инкубационную смесь добавляли ингибитор РНКаз, уровень специфической инфекционности на растениях Chenopodium amaranticor, зараженных реконструированным ХВК, собранным в 10 мм Трис-HCl, рН 7.0−7.5, был сопоставим с нативным ХВК (Atabekov et al., 2007).

При сборке ХВК, согласно Новикову с соавторами и Kaftanova с соавторами (Новиков и др., 1972; Kaftanova et al., 1975), БО ХВК присутствует в растворе в виде смеси небольших от 2S до 5S и 10−12S агрегатов, а согласно Goodman с соавторами — в форме 2.3S мономерных субъединиц (Goodman et al., 1975).

Было предпринято несколько попыток полимеризации БО ХВК в отсутствие РНК in vitro. Однако, обнаружить полимеры БО со спиральной структурой, идентичной структуре вириона и сопоставимых с ними по размерам не удалось (Новиков и др., 1972; Kaftanova et al., 1975; Goodman et al., 1975). Тем не менее, частичная полимеризация БО ХВК оказалась возможной при добавлении фосфатного буфера в инкубационную смесь, содержащую диализованный белок, до конечной концентрации 0,2 М (рН 7,0 -7,5) и выдерживании раствора в течение 24 ч при 4−20 °С. Образование однои двухслойных белковых дисков можно наблюдать методом электронной микроскопии (Kaftanova et al., 1975). Диаметр дисков и диаметр центрального канала был аналогичен интактным частицам ХВК и составлял около 4 нм. При дальнейшей инкубации раствора, содержащего БО в фосфатном буфере, диски начинали агрегировать в стопки, состоящие из 14−16 дисков. Показано, что образование стопок дисков предпочтительнее коротких спиральных структур (Kaftanova et al., 1975). Для ВМП было показано, что белок оболочки ВМП может реполимеризоваться в длинные вирусоподобные спиральные частицы в отсутствие РНК (Erickson et al. 1976; Tremblay et al. 2006). Вероятно, белки оболочки разных потексвирусов обладают разными свойствами: одни способны к эффективной полимеризации в отсутствии РНК, а другие нет.

На рисунке 1 показано изменение степени полимеризации БО ВМП в зависимости от рН и температуры. Показано, что в различных условиях может быть обнаружен БО в форме стопки дисков с коэффициентом седиментации 14S, представляющие собой результат полимеризации 18 субъединиц БО ВМП, из которыхформируются два витка вирусной спирали (Erickson et al., 1983). При значениях рН от 4,5 до 6,5 весь белок находится в этой форме. При низких и высоких значениях рН, независимо от температуры, обнаруживаются мономеры или димеры БО ВМП с коэффициентами седиментации 2−3S. При рН 4,0 и температуре выше 5 °C в растворе, содержащем БО ВМП, формируются нитевидные палочковидные частицы со спиральной структурой и с коэффициентами седиментации от 100−120S и 230−250S. Другие промежуточные формы БО с коэффициентами седиментации от 14S до 25S можно наблюдать между значениями рН от 6,5 до 9,5 (Erickson et al., 1976, 1981).

3 456 789 10.

РН.

Рис. 1. Влияние температуры и рН на полимеризацию белка оболочки ВМП (Erickson et al., 1981).

Показана зависимость образования полимеров БО ВМП с различным коэффициентом седиментации от концентрации БО ВМП в растворе. При 0,1 мг/мл БО ВМП находится в форме 2−3S (мономеры и димеры), при 0,25 мг/мл появляются 14S агрегаты, и при концентрации более чем 1 мг/мл они преобразуются в агрегаты 27−3OS (Erickson et al., 1976, 1978). Впоследствии было показано, что 14S агрегаты соответствуют двухслойным дискам (18 субъединиц белка) или двойному обороту спирали (Erickson et al, 1981, 1983), Переход из одной формы БО ВМП в другую при изменении концентрации происходит быстро. Мономеры и/или небольшие агрегаты БО ВМП, вероятно, используются в течение элонгации, а форма белка, использующаяся для инициации сборки, пока остается неизвестной.

Показана возможность полимеризации рекомбинантного БО ВМП, экспрессируемого в E. coli, содержащего на С-конце гистидины (Tremblay et al., 2006). Полимеры БО ВМП обладают высокой иммуногенностью и с успехом используются в качестве платформы, несущей гетерологичные эпитопы, с целью получения специфических антител (Denis et al., 2007). Получить мономеры рекомбинантного белка возможно только в случае делеции с N-конца 26 аминокислотных остатков, в результате чего БО ВМП теряет способность полимеризоваться и связывать РНК in vitro (Lecours et al., 2006).

Известно, что N-концевая часть белка оболочки ХВК экспонирована на поверхности вирусных частиц (Baratova et al., 1992) и участвует в образовании высоко иммуногенной антигенной детеминанты (Koenig and Torrance, 1986; Sober et al., 1988), тогда как С-конец БО скрыт внутри вирусной частицы.

Показано, что частицы ХВК формируют вокруг себя гидратную оболочку из связанных молекул воды. Этому способствует высокое содержание окси-аминокислот в расположенном на поверхности вириона N-конце БО и присутствие в нем остатков Сахаров (Baratova et al., 2004). Известно, что присутствие воды в непосредственной близости от поверхности белков существенно для их сворачивания, стабильности, узнавания и активности (Gerken et al., 1989). Вероятно, подобные взаимодействия имеют большое значение для формирования правильной структуры вириона.

Важным вопросом является локализация участка инициации сборки потексвирусов. Детально этот вопрос изучен на примере сборки ВМП. Показано, что первые 138 нуклеотидов на 5'-конце РНК ВМП содержат участок инициации сборки (Lok and AbouHaidar, 1986). Первые 40 нуклеотидов РНК ВМП богаты аденозином, бедны уридином, и содержат 8 следующих друг за другом повторяющихся пентамеров (GCAAA). Эти 8 пентамеров возможно взаимодействуют с субъединицами БО, расположенных на поверхности двухслойных дисков. Также как и в случае ВМП, 5'-концевая последовательность ХВК состоит из С/А-богатых участков и содержит следующие блоки: GAAAAA, АААСС, САССАА, АСАССАА, СААСА, ССААА (Skryabin et al, 1988). Вполне вероятно, что именно этот участок является участком инициации сборки вирусных частиц ХВК. Районы РНК, богатые аденином и цитозином не имеют вторичной структуры, что, вероятно, способствует взаимодействию БО с РНК и сборке дисков БО в спиральную структуру (Erickson et al., 1978; Abouhaidar and Bancroft, 1979; Abouhaidar and Bancroft, 1980; Erickson and Bancroft, 1980; Sit et al, 1994).

В 1996 году было высказано предположение, что 5'-район РНК ХВК участвует в координации вирусной сборки, транспорте и репликации (Kim and Hemenway, 1996). Kwon с соавторами (2005) обнаружили, что в ходе сборки ХВК вирусный БО специфично распознает район, расположенный в 5'-концевом stem-loop 1 (SL1) регионе (51−84 нт) РНК ХВК. Кроме того, регуляторные элементы, необходимые для связывания РНК с БО были локализованы в области 1−107 нт РНК ХВК (Lough et al, 2006). Было показано, что частицы, полученные при сборке полноразмерных транскриптов ХВК, синтезированных in vitro, короче частиц, собранных из вирусной РНК. Авторы предполагают, что есть еще неизвестные факторы, которые могут ограничивать восстановление полной длины частиц (Kwon et al, 2005).

Имеются данные, что в вирион потексвирусов вируса мозаики нарцисса и вируса мозаики бамбука помимо геномной РНК могут упаковываться субгеномные РНК (Annamalai and Rao, 2006; Cjoi and Rao, 2000; Lee et al, 1998; Short and Davies, 1983).

Для потексвирусов показана возможность реконструкции БО с гетерологичными РНК. В случае ВМП, при ионной силе 1=0,01 и рН 8,0,.

БО ВМП формирует вирусоподобные, палочковидные частицы только с гомологичной РНК (РНК ВМП), РНК близкородственного вируса мозаики желтого клевера (ВМЖК), полиаденином и полицитозином. С РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) и вируса мозаики костра (ВМК), а также с полиуридином и полигуанином, БО ВМП с большой скоростью формирует в этих условиях тонкие, чувствительные к РНКазам, частицы, которые авторы называют «растянутыми частицами» (Erickson et al., 1978). При более низких рН (6,0 — 7,5) БО ВМП формирует (с гомологичными и гетерологичными РНК) частицы другого, третьего типа, с таким же диаметром как у ВМП, но большим количеством изломов («kinked particles») (Erickson and Bancroft, 1978; Erickson et al., 1978). Авторы предполагают, что формирование подобных частиц является результатом множественной инициации. Другими словами, при рН<7,5 специфичность инициации сборки ВМП на 5'-конце теряется (Erickson et al., 1978). Показана возможность сборки БО ВМП с ДНК. Подобная сборка была осуществлена в условиях неспецифической сборки, т. е при рН 6,0 (Abouhaidar and Bancroft, 1979; Erickson and Bancroft, 1980).

Для ХВК показано, что в растворах с низкой ионной силой (0,0001−0,001 М трис-HCl), рН 6,8−7,3, при комнатной температуре, инкубация БО ХВК с гетерологичными вирусными РНК (ВТМ, ВМК) приводила к образованию палочковидных нуклеопротеидных частиц. Такие частицы характеризовались типичным для спиральных вирусных нуклеопротеидов спектром поглощения в УФ-свете, имели коэффициенты седиментации в интервале 55−63S (у нативного вируса 110S) и в иммунологическом отношении были сходны с нативным вирусным нуклеопротеидом и отличались от низкомолекулярного белка ХВК. Выход нуклеопротеида в этих условиях составил приблизительно 20−30% и резко снижался при повышении ионной силы (при добавлении хлористого натрия или фосфатного буфера) в инкубационной смеси. При изучении полученных препаратов в электронном микроскопе обнаруживали большое количество палочковидных частиц, различающихся по длине и имеющих диаметр, сходный с диаметром нативного вируса. Все полученные препараты нуклеопротеидов, содержащих БО ХВК и гетерологичные РНК, не обладали инфекционностью (Новиков и др., 1972).

Bancroft с соавторами (1979) изучали сборку другого потексвируса — вируса мозаики желтого клевера (ВМЖК). Было обнаружено, что процесс сборки ВМЖК очень похож на сборку ВМП и ХВК. При ионной силе 1=0,01 и рН 7,5 БО ВМЖК формировал нормальные палочковидные частицы не только с гомологичными РНК, но также с РНК ВМП и РНК сферического вируса мозаики костра (ВМК). Как в случае с ВМП, реконструкция ВМЖК ингибируется при низких температурах и инфекционность реконструированого вируса низка (не более нескольких процентов).

Показано, что скорость элонгации гомологичной сборки строго зависит от концентрации БО. При весовом соотношении РНК: БО 1:20 сборка проходит за 20 минут, а при соотношении 1:80 она занимает всего 5 минут. Но даже при соотношении РНК: БО 1:20 мутность раствора повышается примерно на 40% на первых минутах реакции. Неспецифичная сборка с множественной инициацией (при рН<7,5) происходит еще быстрее. (Erickson and Bancroft, 1978). Аналогичные результаты были получены при исследовании скорости элонгации при гомологичной реконструкции ХВК in vitro (Новиков и др., 1972).

Abou-Haidar с соавторами (1979) показали, что при реконструкции ВМП, в присутствие солей Na+ и Mg2+, происходило ингибирование сборки. Сборку нельзя было обнаружить при добавлении 0,06 М NaCl или 0,001 М MgC^ в инкубационную смесь, содержащую БО ВМП при рН 8.0. При этом, добавление солей существенно стабилизировало вторичную структуру РНК ВМП. С другой стороны, при добавлении катионов в концентрации, необходимой для ингибирования, не происходило изменение структуры субъединиц БО ВМП или их способности реполимеризоваться в отсутствие РНК. В случае ХВК, цвиттерионный буфер (бицин в концентрации 0.2М) не ингибировал сборку (Goodman, 1977). Исходя из этих данных, было предложено, что эффект ингибирования сборки потексвирусов in vitro катионами обусловлен стабилизацией вторичной структуры РНК (Abou-Haidar et al., 1979).

Показано, что БО потексвирусов обладает способностью плавить вторичную структуру РНК. Было высказано предположение, что активность плавления белками определялась их способностью неспецифически связывать РНК вдоль всей ее длины (Erickson and Bancroft, 1980). В результате такого связывания могут образовываться тонкие вытянутые частицы. Авторы предположили, что быстрое формирование вытянутых частиц в результате электростатического «налипания» БО ВМП к РНК является отдельным этапом сборки и предложили схему сборки потексвирусов, состоящую из трех стадий.

Первым этапом этого процесса является быстрое неспецифическое связывание БО со всей молекулой РНК, что приводит к плавлению РНК и формированию тонких длинных частиц. На втором этапе происходит инициация сборки, то есть формирование правильного палочковидного участка в районе 5'-конца РНК. Третьим этапом сборки, согласно этой модели, является элонгация, которая проявляется как волнообразная спиральная перестройка субъединиц БО в комплексе РНК-БО, начиная с 5'-конца РНК. Спиральная перестройка одного сегмента комплекса вызвана спиральной структурой предшествующего (5') сегмента. Такая модель сборки исключает использование больших белковых полимеров во время элонгации. Быстрое повышение мутности от 40 до 50% в конечном объеме, наблюдаемое при сборке ХВК и ВМП, в этом случае, соответствует первой стадии сборки, то есть формированию неспецифических растянутых комплексов РНК-БО.

выводы.

1. Показано, что при инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК in vitro формируются вирусные рибонуклеопротеиды (вРНП), 5'-конец РНК которых инкапсидирован БО в виде «головки» со структурой белковой спирали ХВК, а 3'- конец свободен («однохвостые» частицы).

2. При инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК in vitro не обнаружено структур невирионной природы.

3. Показано, что РНК ХВК в составе вРНП, образованного при различных молярных соотношениях РНК и БО, не способна транслироваться in vitro, но трансляционно активируется при фосфорилировании БО в составе вРНП или образовании комплекса вРНП с ТБ1.

4. Предположительно транспортной формой потексвирусов может являться вирион или вирусная РНК частично одетая белком оболочки («однохвостые» частицы).

5. Показана ключевая роль N-концевого участка БО в регуляции трансляции РНК в составе вирусного рибонуклеопротеида.