Факторы, влияющие на эффективность секреции рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей

Прогресс в исследованиях молекулярных механизмов функционирования эукариотической клетки в последние десятилетия был в существенной степени обеспечен использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма. Это обусловлено легкостью проведения генетических и геипо-инженерных манипуляций с этим организмом. Многие клеточные процессы являются консервативными, что делает знания, полученные в исследованиях дрожжевой клетки, приложимыми к описанию аналогичных процессов в клетках высших эукариот.

Схожесть процессов синтеза и созревания белков делает дрожжи хорошим организмом-хозяином для экспрессии гетерологичных эукариотических генов. Путем экспрессии в дрожжах можно получать различные белки, используемые в промышленности, медицине и научных исследованиях. Стоит отметить, что многие процессы, происходящие в клетках различных эукариот, существенно дивергировали в ходе эволюции. Изучение процесса секреции белков высших эукариот в клетках дрожжей позволяет выявить особенности организации секреторного пути дрожжевой клетки. Однако результаты, полученные на одном модельном объекте, например на S. cerevisiae, часто оказываются не приложимыми к описанию процессов происходящих в клетках других организмов. Поэтому использование альтернативных модельных объектов позволяет понять, какие процессы в клетке эволюционно консервативны, а какие отражают особенности данного организма. Более того, та или иная особенность нового модельного объекта может быть использована как эффективный инструмент исследования, который в большей степени подходит для решения конкретной экспериментальной задачи.

В данной работе мы изучали особенности прохождения по дрожжевому пути секреции человеческого белка — активатора плазминогена урокиназного типа (иРА). Оказалось, что метилотрофпые дрожжи Hansenula polymorpha имеют ряд преимуществ перед более традиционным модельным объектом — S. cerevisiae для решения поставленных экспериментальных задач. Именно использование Н. polymorpha позволило подробно изучить многие закономерности, связанные с секрецией иРА клетками дрожжей.

Метилотрофные дрожжи Н. polymorpha уже более 15 лет используются в качестве организма-хозяина для экспрессии рекомбинантпых белков. Этот организм также давно привлекает исследователей, изучающих метаболизм метанола и функционирование пероксисом, а в последнее время все шире используется и в работах по изучению других процессов, например, гликозилирования белков, ассимиляции нитрата и нитрита, регуляции генной экспрессии и др. Недавно при финансировании фирмой Rhein Biotech была определена последовательность нуклеотидов более 90% генома Н. ро1утогрка, что в существенной степени облегчает проведение молекулярно-генетических исследований на этом объекте.

В лаборатории молекулярной генетики ИЭК РКНПК МЗ РФ на протяжении ряда лет проводятся исследования по изучению факторов, влияющих на секрецию различных чужеродных белков клетками дрожжей & сегех’тае и Н. ро1утогрка. Одни из этих белков, иРА, неспособен эффективно секретироваться, что позволило получить мутации, увеличивающие эффективность секреции этого белка. Был клонирован ряд генов, в которых произошли эти мутации. Однако, оставалось невыясненным, какие именно механизмы препятствуют секреции иРА. Данная работа посвящена изучению факторов, определяющих низкую эффективность секреции иРА клетками дрожжей и механизмов, приводящих к ее увеличению в результате геномных мутаций.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

СЕКРЕТОРНЫЙ ПУТЬ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ И.

Человеческая клетка, в среднем, содержит 10 ООО различных белков, клетка дрожжей около 5000. Дчя нормального функционирования клетки каждый из этих белков должен оказаться в нужном компартменте или мембране ком парт мент л Направление новоси итерированных полипептпдных цепей к «месту назначения», так называемая сортировка белков («prolein sorting») — необходимый процесс для компартментацим и функционирования эукариотической клетки. При этом некоторые белки, кодируемые ДНК. находящейся в митохондриях и хлоропластах. синтезируются на рибосомах в этих органеллах и остаются там же. Однако большинство митохондриатьных белков и белков хлоропласт, а также все белки других органелл. кодируются ядерной ДНК. Они синтезируются на рибосомах в цитозоле и распределяются по орган ел лам при помощи систем узнавания с Игнатов сортировки.

Для прохождения секреторного пуш также используются сигналы сортировки новое и итерированная полипептидная цепь направляется в полость эндоплазматического ретикулума (ЭР), датее попадает в аппарат Гольджи, направляется к плазматической мембране и секретпруется (рисунок i).

МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Рисунок 1. Секреторный путь в эукариотических клетках.

1) Все ядерные мРНК транслируются на цитозольных рибосомах.

2} Рибосомы, синтезирующие секреторные белки направляются к шероховатому ЭР, благодаря наличию сигнальной последовательности.

3) После трансляции в полость ЭР секреторные белки попадают в аппарат Гольджи при помощи везикулярного транспорта.

4а, 4Ь, 4с) Секреторные белки направляются далее: либо секретируются, либо попадают в лизосомы (вакуоль), либо остаются в плазматической мембране.

Стоит отметить, что белками секреторного пути являются не только те, которые в конечном итоге секретируются, но и ферменты и белки, которые постоянно присутствуют в полости ЭР, аппарате Гольджи, лизосомах, а также белки, «интегрированные» в мембраны этих органелл или плазматическую мембрану.

Данный обзор будет посвящен описанию организации секреторного пути и механизмов, при помощи которых секреторные белки клеток дрожжей и млекопитающих сортируются по клеточным компартментам. Особое внимание будет уделено «созреванию» (модифицированию) белка и прохождению им системы «контроля качества».

117 ВЫВОДЫ.

1. Человеческий активатор плазминогена урокиназного типа (иРА) плохо секретируется клетками дрожжей по причине неэффективного сворачивания в эндоплазматическом ретикулуме.

2. Дефект укладки иРА в дрожжевом эндоплазматическом ретикулуме в существенной степени определяется М-концевыми доменами этого белка.

3. При высоком уровне синтеза иРА происходит его внутриклеточное накопление в виде высокомолекулярных агрегатов. Агрегаты формируются в эндоплазматическом ретикулуме. Количество белка в агрегированной форме зависит от эффективности его укладки в эндоплазматическом ретикулуме.

4. Мутации ори24, ге11−27 и рти, увеличивающие эффективность секреции иРА, снижают степень агрегации этого белка в эндоплазматическом ретикулуме, что свидетельствует об улучшении условий для правильного сворачивания этого белка.

5. Улучшение укладки иРА у мутанта ге//-27 связано с нарушением баланса кальция в секреторном пути.

6. Нарушение транспортировки белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в вакуоль не увеличивает эффективность секреции иРА, но увеличивает протеолитический процессинг этого белка.

7. Протеолитический процессинг иРА в существенной степени не зависит от вакуолярных протеаз, активируемых продуктом гена РЕР4, протеиназой А.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Разработка методов генной инженерии позволила получать многие белки путем их экспрессии в клетках бактерий. Казалось, что проблема получения белков высших эукариот для фармакологического использования решена. Однако, многие важные белки не приобретают правильную конформацию и посттрансляционные модификации, необходимые для их активности, в результате прохождения через компартменты эукариотического пути секреции. Для решения этой проблемы было предложено использовать одноклеточный эукариотический организм — дрожжи. Однако, многие процессы в секреторном пути проходят по-разному у разных эукариот и многие животные белки не способны преодолеть секреторный путь дрожжей или их модификация ферментными системами чужеродного организма также не обеспечивает им необходимых свойств. В этом случае теоретически можно пойти по пути генетической модификации оргапизма-хозяипа, которые изменили бы устройство его секторного пути, сделав его более подходящим для экспрессии белков высших эукариот. Эта задача требует понимания того, почему белки высших эукариот часто не секретируются клетками дрожжей. В нашей работе мы предприняли попытку разобраться в причинах плохой секреции человеческого uPA и изучить, какие изменения в секреторном пути дрожжевой клетки могут улучшать секрецию этого белка.

В анализе зависимости уровня секреции от уровня экспрессии uPA в дрожжах Я. polymorpha было обнаружено, что одна копия экспрессионной кассеты, содержащей промотор МОХ, обеспечивает максимальный уровень секреции. Увеличение уровня экспрессии при введении в геном большего числа копий экспрессионной кассеты или его снижение при использовании более «слабого» промотора приводило к снижению скорости секреции. Однако даже при «оптимальном» уровне экспрессии количество секретированного белка оставалось ничтожным.

Оказалось, что при высоких уровнях экспрессии uPA накапливается впутриклеточно в виде высокомолекулярных агрегатов. Увеличение уровня экспрессии сопровождалось увеличением внутриклеточного агрегированного белка и снижением секреции. Полученные в данной работе результаты исключают предположение о том, что агрегация является причиной низкого уровня секреции uPA клетками дрожжей, а является следствием неспособности этого белка эффективно приобретать правильную конформацию в дрожжевом ЭР. Что и является причиной низкого уровня секреции uPA клетками дрожжей.

Мы обнаружили, что низкая эффективность секреции uPA определяется его доменной организацией. А именно: без N-концевых доменов белок секретировался намного эффективнее, чем полпоразмерпый вариант, и практически не обнаруживался в клетках в виде высокомолекулярных агрегатов. Очевидно, что И-копцевые домены определяют неспособность иРА эффективно приобретать правильную укладку в ЭР клеток дрожжей.

В данной работе мы продемонстрировали, что неспособность иРА эффективно приобретать правильную конформацию в дрожжевом ЭР является основной причиной низкого уровня секреции этого белка клетками дрожжей. В существенной степени к такому заключению удалось прийти благодаря использованию разработанного нами подхода по оценке эффективности укладки белка в ЭР по степени его агрегации. Этот метод оказался применим только для анализа штаммов с высоким уровнем экспрессии иРА. Такой уровень экспрессии можно было достичь у трансформантов Н. ро1утогрка, несущих только одну копию экспрессиоппой кассеты стабильно интегрированную в геном, а в аналогичных трансформантах & сегеу’шае необходимого уровня экспрессии достичь не удавалось.

Анализ степени агрегации иРА у мутантов Н. ро1утогрка с увеличенной эффективность секреции этого белка показал, что в этих штаммах улучшены условия для правильной укладки молекулы иРА в ЭР. Мутации ори24 и рт11 нарушали гликозилирование белков в секреторном пути, при этом мы предполагаем, что их влияние на секрецию иРА обусловлено не нарушением гликозилирования самого иРА, а связано с ответом клетки на общий дефект гликозилирования белков. Анализ взаимодействия мутации геИ-27 со сверхэкспрессией гена РМЯ1 позволил получить данные, указывающие на важную роль баланса ионов кальция в секреторном пути и в эффективности укладки молекулы иРА.

Мы также рассматривали возможность влияния вакуолярной деградации на эффективность секреции иРА, однако обнаружили, что ни нарушение транспортировки молекул из поздних компартментов аппарата Гольджи в вакуоль при помощи рецептора вакуолярной сортировки УрэЮр, ни отсутствие протеиназы А, активирующей протеолитический комплекс вакуоли, не изменило уровень секреции иРА клетками дрожжей.