Исследование биологической активности почвы, загрязненной солями цинка

Размещена

КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Исследование биологической активности почвы, загрязненной солями цинка по специальности 20 803.65 — Биоэкология Калининград

Реферат Тема: Исследование биологической активности почвы, загрязненной солями цинка.

Объем работы 47 стр., количество иллюстраций 9, таблиц 1, приложений 1, количество использованных источников 46.

Ключевые слова: сульфат цинка, цинк сернокислый, загрязнение почвогрунтов, почвенные поллютанты, тяжелые металлы, суперэкотоксиканты, микрофлора, урбанизированная экосистема.

Исследовано влияние загрязнения солями цинка микробный компонент биологической активности почвы — различные группы почвенной микрофлоры. Воздействие цинкового загрязнителя на группы почвенных микроорганизмов носит разностороннюю направленность и комплексный характер. Наиболее устойчивые к загрязнению почвы цинком — спорообразующие и аммонифицирующие микроорганизмы. Наиболее чувствительные к загрязнению солями цинка — целлюлозоразлагающие микроорганизмы и актиномицеты.

Оглавление Введение Глава 1. Литературный обзор

1.1 Специфика почвы как среды обитания микроорганизмов

1.2. Понятие биологической активности почвы

1.3 Характеристика основных групп почвенных микроорганизмов

1.4 Цинк как поллютант почв Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

2.2 Ход эксперимента Глава 3. Экспериментальные данные и обсуждение Выводы Библиографический список Приложение Размещена

Введение

В течение достаточно длительного периода времени человеческая нация знакома с загрязнением природной среды опасными токсикантами — тяжелыми металлами. По мере поступления в различные компоненты биосферы, они способны оказывать комплексное негативное воздействие, приводя частичному или общему угнетению природных систем, а так же их полной деградации. Даже при низких концентрациях и следовых количествах тяжелые металлы обладают высокой токсичностью; они имеют тенденцию концентрироваться и накапливаться в живых организмах (биоаккумулирование) и способны наносить значительный вред здоровью населения и сельскому хозяйству (Теплая, 2013).

Почва является основой и обязательным компонентом любой наземной экосистемы и, как следствие, это своеобразное депо для всевозможных загрязняющих веществ. Накопление токсикантов, в т. ч. различных соединений цинка, влечёт за собой последствия в качестве угнетения почвенного покрова и создания неблагоприятной экологической обстановки. Ввиду активной способности тяжелых металлов мигрировать из почвы в иные природные среды, почва становится источником опасности для живых организмов, и человек не является исключением (Лобачева и др., 2011).

Важнейшим показателем «здоровья» почвы считается ее биологическая активность. Важнейшим же компонентом биологической активности является микробиологический показатель её активности — весьма чувствительный к загрязнителям различного рода. Одним из широко распространенных почвенных поллютантов, относящихся к категории природных загрязнителей, является цинк — тяжелый металл первого класса опасности (Мосина, 2013). Большая его природная часть содержится в виде изоморфных соединений в слюдах, обманках и других минералах. Обладая относительно низкой константой устойчивости, цинковые соединения проявляют высокие свойства подвижности и биодоступности. Так же существуют данные о том, что цинк эффективнее растворяется в почвах, чем остальные металлы, приписываемые к ряду «тяжелых». Источники цинка антропогенного происхождения — предприятия цветной металлургии (в первую очередь), агротехническая деятельность человека и сфера автомобильного транспорта. Наблюдения и результаты последних научных исследований показывают, что продолжающееся в нынешнее время загрязнение почв цинком и цинковыми соединениями приводит к необычайно высокому его накоплению в верхнем слое почвы. При поступлении в организм все цинковые соли способны вызывать тяжелые отравления ввиду токсичности ионов цинка. В частности, отравление сульфатом цинка приводит к малокровию, задержкам в росте, бесплодию. Одного грамма сульфата цинка достаточно, чтобы вызвать тяжелое отравление (Майстренко и др., 1996).

Поэтому, в настоящее время одной из задач современной экологии является изучение воздействия цинкового загрязнения на биологическую активность почвы, как одного из важнейших и функционально подвижных компонентов почвенного комплекса. Это позволит лучше понять некоторые аспекты воздействия поллютанта и эффективнее диагностировать критические нарушения биологической активности почвы, что может поспособствовать раннему выявлению техногенных неблагоприятных воздействий на природные и урбанизированные экосистемы.

Цель — изучить биологическую активность почвы (микробиологический показатель биологической активности), загрязненной солями цинка.

Для достижения поставленной цели было выделено несколько задач:

— определить влияние различных концентраций цинка на количественные характеристики почвенной микрофлоры;

— изучить влияние различных концентраций цинка на качественные характеристики почвенной микрофлоры;

— выявить наиболее резистентные к загрязнению солями цинка и наиболее чувствительные к нему группы микроорганизмов.

почва цинк микроорганизм Глава 1. Литературный обзор

1.1 Почва как специфическая среда обитания микроорганизмов Почва является гетерогенной полифункциональной многофазной органоминеральная система, возникшая на поверхности земли в результате длительного воздействия биотических, абиотических и антропогенных факторов. Важнейшее свойство почвы — плодородие, что лишь подчеркивает ее ценность для нормального функционирования наземных экосистем, как в для всей биосферы в целом, так и для сельскохозяйственной сферы деятельности человека.

Почва — среда трехфазная. Она представлена твёрдыми, жидкими и газообразными компонентами. Все компоненты активно взаимодействуют между собой. Однако жизнедеятельность микроорганизмов представлена в основном на микрозонах — местах скопления микробных метаболитов и определённых условий, которые способствуют жизнедеятельности. В различных почвенных горизонтах, имеющих различные плотность, цвет, уровень инсоляции, температуру, влажность, концентрацию кислорода и других газов, различных веществ наблюдается большая гетерогенность. Поэтому условия жизнедеятельности микроорганизмов в разных горизонтах и почвах существенно отличаются. Почва также и гетерохронная среда, в которой условия изменяются во времени. Наиболее значительно это проявляется в различных процессах разложения и иных процессах, при которых активность групп микроорганизмов сменяется активностью других. Таким образом, условия для существования микробоценозов достаточно непостоянны и могут меняться в зависимости от ряда факторов, таких как климат, поступления различных неорганических и органических соединений и техногенных веществ, в том числе тяжёлых металлов (Нетрусов и др., 2004).

1.2. Понятие биологической активности почвы В своем обобщенном понятии биологической активностью почвы принято считать совокупность процессов в почве — биологических и биохимических — прочно связанных с жизнедеятельностью обитающей в ней фауны, микробиологической составляющей и корней растительности.

О почвенной биологической активности можно судить по многим критериям. Насколько интенсивно в ней протекают процессы газообмена с атмосферой, какой эквивалент тепловой энергии производится микроорганизмами почвы. К этому также можно отнести интенсивность процесса деструкции органических веществ (процессов разложения клетчатки, нитрифицирования и аммонифицирования в почве) и общее количество почвенных микроорганизмов на 1 г сухой почвы, то есть биогенному показателю.

Нормальная биологическая активность отражает важнейшее свойство почвы — плодородие. В свою очередь, главным компонентом биологической активности считается микробиологическая активность, которую обуславливает численность населяющих почву микроорганизмов (Мосина, 2013).

В настоящее время в почвах повсеместно отмечается снижение биологической активности как основного показателя ее плодородия и «здоровья». Это объясняется колоссальным загрязнением естественной и трансформированной природной среды. При таких изменениях значительную часть нагрузки терпит именно почва, превращаясь в настоящее «депо» для токсикантов различного рода. Главными загрязнителями приоритетного ряда выступают тяжелые металлы, которые по масштабам загрязнения и силе воздействия на биологические системы занимают по праву лидирующую позицию. Это придает проблеме загрязнения почвогрунтов тяжелыми металлами глобальный экологический масштаб (Мосина, 2013).

1.3 Характеристика основных групп почвенных микроорганизмов Обитающие в почве микроорганизмы представляют собой не просто компонент почвенной биоты, они также являются ключевым фактором процесса почвообразования и миграции биогенных элементов, что обеспечивает разложение растительных останков — опада, образование и разложение гумуса, деструкцию минералов материнской породы и обеспечение процессов минерализации.

Микробиотическое сообщество представлено сложным комплексом тесно взаимодействующих друг с другом микроорганизмов из различных функциональных и систематических групп. Они связаны широким спектром связей, но главную роль играют связи трофического характера. Например, объединение в кооперации для совместной эксплуатации субстратов; в процессе конкуренции за питательные вещества могут иметь место антагонистические взаимоотношения (Гусев, Минеева, 2003). В сообществе микроорганизмов жизненно важными являются именно взаимодействия кооперативного характера. Пути взаимодействий как правило разветвлены и соединены различными типами связей: прямые и обратные связи, отрицательные и положительные, связи топического и трофического характера. В результате микробное сообщество выступает единой кооперацией, что позволяет взаимодействовать с окружающей средой как единое целое (Нетрусов и др., 2004). Среди широкого разнообразия почвенных микроорганизмов обычно выделяют несколько основных групп, представленных ниже:

Азотфиксирующие бактерии — одна из важнейших групп почвенных микроорганизмов. Они способны усваивать молекулярный азот непосредственно из воздуха, переводя его в доступные формы для других живых организмов, таким образом, играя ключевую роль в биосферном круговороте азота. Микроорганизмы этой группы могут быть аэробными и анаэробными, как свободноживущими, так и симбиотическими. (Нетрусов, Котова, 2006).

Аммонифицирующие бактерии — группа бактериальных микроорганизмов, обеспечивающих процесс минерализации азотсодержащих веществ органического происхождения под реакцией протеолитических ферментов. Благодаря процессу аммонифицирования продуктов жизнедеятельности растений и животных почва постепенно обогащается азотом. Одновременно с этим данные бактерии выполняют функцию санитаров — они обеспечивают естественную очистку почвы от разлагающихся остатков органического происхождения (Куркина, Дедков, Уманский, 2013).

Актиномицеты — организмы с прокариотным типом клеточной организации. Имеют грамположительный тип строения клеточных стенок, а также обладают способностью к формированию ветвящегося мицелия. В почве актиномицеты представлены достаточно широко. Представители почти всех известных родов актиномицетов выделены из почв. На субстрате формируют мицелий, появляющийся в результате врастания в питательную среду, и воздушный мицелий, растущий на ее поверхности. Экологическая роль актиномицетов заключается в разложении сложных субстратов, недоступных другим микроорганизмам, тем самым обеспечивая ввод малодоступных соединений в биологический круговорот. Выявлена зависимость количества обнаруживаемых в почвенных пробах актиномицетов от сезона, pH среды и типа почвы (Куркина, Родимова, Дедков, 2011).

Микромицеты — широко распространенная и достаточно разнообразная группа микроскопических грибов. По признаку размера плодовых тел представлены двумя основными группами: макрофиты, имеющие крупные плодовые тела, образующиеся на поверхности почвы или непосредственно в почве; микрофиты, имеющие плодовые тела малых размеров. Микромицеты преимущественно распространены в лесных почвах, нередко являются микоризообразователями или естественными деструкторами древесных пород. Также являются одними из регуляторов почвообразовательных процессов (Нетрусов, Котова, 2006).

Целлюлозоразлагающие бактерии — способны разлагать целлюлозу в анаэробных и аэробных условиях. Относятся к различным таксономическим группам. Все обладают способностью синтезировать ферменты, расщепляющие целлюлозу (Куркина и др., 2013).

1.4 Цинк как поллютант почв В современной научной литературе довольно часто встречается специфический термин «супертоксикант». Его используют, чтобы обозначать загрязняющие вещества, обладающие мощными мутагенными и канцерогенными эффектами. Эти вещества отличаются высокой способностью к накоплению и сильной токсичностью в малых дозировках. Все супертоксиканты без исключений располагают широчайшим диапазоном ингибирующих и индуцирующих свойств. Они также могут вызывать повышение восприимчивости к некоторым веществам природного происхождения или ксенобиотикам у живых организмов. Необходимо отметить стойкость супертоксикантов к деструкции, а так же наличие способности сверхаккумулироваться, что объясняется отсутствием у них верхнего предела токсичности. (Майстренко и др., 1996).

Тяжелые металлы имеют прямое отношения к супертоксикантам, т.к. многие из них (ртуть, свинец, кадмий, цинк, медь и др.) обладают всеми вышеперечисленными характеристиками и проявляют высокие токсикологические свойства даже в следовых количествах, концентрируясь в живых организмах (Майстренко и др., 1996).

Почвы урбанизированных экосистем дополнительно подвергаются негативным физическим воздействиям — активное давление на поверхность почвы (вытаптывание и транспорт), агротехнические мероприятия и особенно процессы связанные с перемещением большого количества почвы. Данные процессы в корне изменяют почвенные параметры, её структуру, водный режим, уровень аэрации (Куркина и др., 2009).

Цинк — является приоритетным поллютантом из числа супертоксикантов. Соединения цинка обладают высокотоксичными свойствами даже в следовых количествах. Кларк Zn в земной коре — 10 мгкг почвы. В природе этот металл распространен преимущественно в виде различных минералов: цинкит, сфалерит, виллемит, каламин, смитсонит, франклинит и других. Цинк также является крайне энергичным водным мигрантом. В сумме с его металлическими свойствами, он играет роль микроэлемента. В почве также может содержаться в следующих формах: водорастворимой, ионообменной и непрочно адсорбированной. Водорастворимые формы включают в себя: хлориды, соли, сульфаты и нитраты. Так же в почве присутствуют комплексные органические цинковые соединения. Такие свойства этого металла-токсиканта, как растворимость и доступность, в почве сводятся к отрицательной корреляции с насыщенностью кальцием и фосфором. Данные свойства могут изменяться под влиянием адсорбции, взаимодействия между вышеуказанными элементами, процесса осаждения. В областях высоких показателей кислотности среды нельзя игнорировать влияние растворимых цинк-органических комплексных соединений и анионных форм цинка на способность хорошо растворяться и оставаться доступным. Цинк так же легко мобилизуется продуктами аэробного разложения клетчатки из основных карбонатов и оксидов (Майстренко и др., 1996).

Содержание цинка в почве снижается достаточно быстро. Период его полуудаления из почвы, где он содержится в соотношении 2210 мг металла на 1 кг почвы, его концентрация понизится наполовину 10−11 лет. Однако подобные результаты применимы только к образцам с длительной промывкой (Силков, 2010).

Загрязнение почвы цинком имеет иное воздействие, нежели различные физические воздействия на почвы, а также часто значительно превосходит его в качественном и количественном отношении. Изменения почвенных параметров происходят спустя короткий или длительный промежуток времени в зависимости от условий, концентрации и формы, в которой содержится металл (Силков, 2010).

В зависимости от химического состояния поллютантов их можно разделить на соли, пыль, газы, агрохимикаты, радиоактивные осадки, органические жидкости, органические газы. В атмосферном воздухе цинк может содержаться в составе пыли и аэрозолей, накапливаясь в верхнем слое почве путем осаждения. Следует также отметить, что цинк обладает высокой способностью накапливаться в организме, увеличивая свою концентрацию по мере восхождения по пищевой цепочке, т. е. биоаккумулироваться (Майстренко и др., 1996).

Комплексное воздействие поллютанта на почвогрунты способно создать источник опасности для живых организмов. Одним из проявлений цинкового загрязнения является значительное повышение в почве количества микотоксинов, выделяемых некоторыми микроскопическими грибами, оказывающих крайне негативное воздействие на микробоценоз почвы. При этом возможно частичное подавление или даже полное ингибирование роста и жизнедеятельности ключевых групп почвенных микроорганизмов (Дедков, Куркина, 2009).

Сочетание всех перечисленных негативных факторов, способно значительно подорвать способность почвы к самоочищению, дать толчок к упадку плодородия. Данные свойства почвы обеспечиваются микроорганизмами, обладающими большим разнообразием ферментных систем и высокой функциональной мобильностью метаболизма. Чем активнее почвенные микроорганизмы, тем быстрее протекает круговорот веществ в экосистеме. Это повышает экологическую устойчивость живой системы. При этом нарушение микробоценоза почвы может служить причиной негативных изменений или даже разрушения экосистемы. Поэтому необходимо своевременно обнаруживать критические изменения в биологической активности почвы, являющиеся в некоторых случаях показателем высокого загрязнения соединениями цинка или другими поллютантами.

Микроорганизмы чутко реагируют на изменения условий. Ответные реакции протекают быстро и проявляются в изменении роста, активности метаболических процессов, морфологического строения, накопления или выделения различных веществ и элементов. При этом изменения отражаются на популяционном и экосистемном уровнях. Это может быть качественное и/или количественное изменение состава сообщества, вплоть до изменения состояния доминантных групп микроорганизмов. Реакции микроорганизмов на популяционном уровне выражаются в изменении интенсивности их роста и развития в зависимости от конкретных условий (Дедков, Куркина, 2009).

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования Объектом исследования являлись почвогрунты, расположенные на ключевом участке в зеленой зоне поселка Прибрежный, в городской черте Калининграда — сад на пришкольной территории. Приблизительная локализация ключевого участка обозначена на рисунке (рис. 1).

Рис. 1 Схема расположения ключевого участка.

Согласно литературным источникам, вся территория города и прилегающих к нему земель разделена с учетом комплекса факторов воздействия на шесть зон: относительно чистая, слабо загрязненная, умеренно загрязненная, загрязненная, грязная и очень грязная. К факторам воздействия условно относят: акустический режим, уровни и интенсивность загрязнения почвы, воды, атмосферного воздуха, состояние растительности и т. д. Ключевой участок в поселке Прибрежный относят к слабо загрязненной зоне (Ващейкин, Садовников и др. 2014).

Координаты участка определяли с помощью технологий GPS-навигации (N 54° 64.879' E 020° 33.206'). Размер тестовой площадки — 20 м². Ключевой участок представляет собой пришкольный сад — небольшую зеленую зону на антропогенно трансформированном участке почвы с полукультурными насаждениями (посадки яблони, вишни и сливы) и разнотравьем (крапива, тысячелистник, полынь, одуванчик). Сомкнутость крон в древесном ярусе небольшая и составляет около 20%. Общее проективное покрытие в травяно-кустарничковом ярусе составляет 80%. Листовой опад практически отсутствует. Почва супесчаная (Анциферова, Мурачева, 2009), дерново-слабоподзолистая, окультуренная (Куркина, Дедков, 2012). Площадка ровная.

Отбор почвенных образцов осуществляли традиционным для взятия почвенных проб методом конверта: по периметру и в центре ключевого участка (рис. 2), с соблюдением стерильности.

Рис. 2 Точки взятия почвенных образцов на ключевом участке методом конверта в пос. Прибрежный (черными точками указаны места отбора проб).

Непосредственный сбор образцов осуществляли стерильной лопаткой, предварительно стерилизуемой в пламени спиртовки. Сбор почвенных образцов проводили из разреза почвы глубиной 10 см.

Собранная почва перемешивалась и складировалась в предварительно простерилизованные бумажные пакеты. Одновременно осуществляли сбор почвенных образцов в металлические бюксы (50−60г) с теневой стороны почвенного разреза, для дальнейшего определения её влажности и полной влагоёмкости в лабораторных условиях. Бумажные пакеты с собранной почвой снабжались этикетками с соответствующей пометкой — датой и местом сбора.

Попутно с помощью портативного pH-метра, оснащенного температурным датчиком, измерялось значение pH и температура почвы на уровне взятия проб с каждой точки конверта. Средняя температура почвы составила 7,3 градуса по шкале Цельсия, среднее значение pH — 6,29.

Естественная влажность почвы определялась термостатно-весовым методом (Козлова, 2009). Отобранные образцы с бюксами взвешивались, затем помещались в сушильный шкаф для высушивания при температуре 105−110 °С в течение 6 часов. Затем проводилось контрольное взвешивание. Определение полной влагоемкости почвы осуществлялся методом цилиндра (Чупахина, 2000).

2.2 Ход эксперимента Исследования проводили в ходе эксперимента на базе лаборатории микробиологии и биотехнологии Химико-биологического института БФУ им. И. Канта в апреле 2015 года.

Перед проведением эксперимента предварительно определили уровень загрязнения цинком собранных почвенных образов с помощью волнодисперсионного рентгенофлуоресцентного спектрометра «Спектроскан Макс-G» (Спектрон, 2012). Предварительно высушенные образцы почвы измельчали с помощью дискового истирателя ЛДИ-65 до размера частиц 71 мкм. Полученные таким образом пробы спрессовывали в виде таблеток диаметром 1 см и помещали в прибор «Спектроскан Макс-G» для определения валового содержания цинка. Содержание цинка в пробах составило 35 мгкг почвы, тогда как значение ПДК для почвенного цинка не должно превышать 55 мгкг абсолютно сухой почвы. Таким образом, загрязнение цинком почвы на ключевом участке «Ж1» не превышает предельно допустимой концентрации.

Доставленные в лабораторию почвенные образцы освобождались от камней, корней и прочих включений, тщательно просеивались и помещали в семь пластиковых сосудов: по 50 г очищенной и просеянной почвы в каждый сосуд. Затем добавляли в каждый сосуд кроме контрольного образца различную добавочную дозу цинка в виде сульфата (ZnSO4) (таблица 1). Затем почва выдерживалась в течение 2 недель при комнатной температуре. Влажность почвы поддерживали на уровне 60% от полной влагоемкости почвы — однократно в день, в течение трех недель образцы почвы в сосудах увлажнялись из расчета 60% от полной влагоемкости почвы). Таким образом почва в сосудах «загрязнялась» цинком сверх контрольного значения. Для эксперимента были взяты шесть значений (таблица 1). Поскольку результаты предыдущих экспериментов, базирующихся на всего трех концентрациях с более узким диапазоном — 100 ПДК, 500 ПДК, 1000 ПДК в первом эксперименте (2013) и 100 ПДК, 500 ПДК, 750 ПДК во втором (2014) — не позволили выявить четкую зависимость численности определенных групп микроорганизмов от концентрации поллютанта, было принято решение расширить эксперимент. Большее количество экспериментальных концентраций позволило увеличить границы исследуемого «интервала», в пределах которого ингибировалась или стимулировалась активность тех или иных групп почвенных микроорганизмов с увеличением содержания металла-загрязнителя. Подобное решение так же поспособствовало не только нахождению точек ингибирования, но и более успешному выводу какой-либо общей зависимости при отображении результатов исследования в виде графиков.

Экспериментальные значения ПДК вычислялись пропорциональным методом: ПДК металла, умноженная на молекулярную массу соединения (сульфат цинка) и разделенное на молекулярную массу тяжелого металла (Мосина, 2013). Полученные значения умножались соответственно на 100, 500 750, 1000, 1250 и 1500. Используемый спектр концентраций обусловлен слабыми реакциями групп почвенных микроорганизмов на более низкие концентрации цинка, используемые в предыдущих исследованиях, а узкий диапазон ПДК не позволит эффективно выявить точки ингибирования и стимуляции активности. Важно, что значения ПДК для экспериментальных подсчетов переводились в соотношения 1 мг на 100 г почвы.

Таблица 1

Добавочная доза цинка в сосудах с исследуемой почвой

Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний использовался метод разведений (рис. 3) (Егоров, 1995). В ходе опыта был использован коэффициент разведения равный 10. Для приготовления более качественных разведений исследуемые почвенные суспензии предварительно перемешивались с помощью лабораторного орбитального шейкера в течение 20 минут. Для приготовления разведений заранее подготовленную стерильную водопроводную воду разливали по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносили в пробирку с 9 мл стерильной воды, таким образом подготавливалось первое разведение.

Рис. 3 Схематическое изображение метода разведений

Полученное разведение тщательно перемешивали новой стерильной пипеткой, осуществляя забор в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию. Затем той же пипеткой отбирали 1 мл суспензии и переносили во вторую пробирку, получая второе разведение. Остальные разведение были получены идентичным образом. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно чем больше степень разведения суспензии, тем больше плотность потенциальной популяции.

По истечении времени выдержки почвенных образцов, загрязненных добавочной дозой цинка, осуществлялась процедура глубинного микробиологического посева. Для культивирования каждой ключевой группы микроорганизмов использовались твердые селективные питательные среды: крахмало-аммиачный агар (КАА) для микроорганизмов использующих минеральные формы азота, среду Чапека для микроскопических грибов, среду Гетчинсона для целлюлозоразлагающих микроорганизмов, сусло-агар с мясопептонным агаром (СА+МПА) для спорообразующих бактерий, среду Эшби для азотфиксирующих микоорганизмов, мясо-пептонный агар (МПА) для аммонифицирующих микроорганизмов. При приготовлении питательных сред использовалась стандартная рецептура (Тихонович, 2005).

Эксперимент проводился в трех повторностях для каждой добавочной концентрации и контрольного значения на всех средах с последующей выдержкой в биологических термостатах на срок до 14 дней. После термостатной выдержки производился подсчет колоний визуальным методом с внесением данных в заготовленные таблицы и последующим пересчетом в колониеобразующие единицы. Параллельно с этим производилось идентификация родового состава доминирующих групп (использовался практикум Теппера) микроорганизмов, если это представлялось возможным. Определение доминантных групп осуществлялось путем оптической микроскопии и приготовлением постоянных препаратов. При определении учитывались характер колоний и морфология отдельных клеток.

Полученные данные были обработаны статистически с помощью программы Microsoft Excel 2013. Для построения диаграмм, отражающих изменение количественных показателей и динамики численности групп различных микроорганизмов, использованы средние значения, полученные в результате обработки и обобщения полученных данных.

Глава 3. Результаты и обсуждение Проведенный эксперимент позволил исследовать влияние загрязнения цинком на различные группы почвенной микрофлоры. По результатам эксперимента можно судить, что дополнительные дозы цинка (в виде сульфата), внесенные в исследуемые почвенные образцы в количестве 100, 500, 750, 1000, 1250 и 1500 ПДК с ключевого участка приводят к различным изменениям у исследуемых групп микроорганизмов, как в качественном, так и в количественном составе.

По результатам эксперимента было установлено, что целлюлозоразлагающие микроорганизмы являются наиболее чувствительными к загрязнению почвы цинком. На грамм абсолютно сухой почвы их содержание в колониеобразующих единицах (КОЕ) сводится к практически абсолютному отсутствию уже при первой добавочной дозе цинка (рис. 4).

Рис. 4 Зависимость количественного содержания микроорганизмов (КОЕ/г) от концентрации цинка на среде Гетчинсона (здесь и далее вертикальным интервалом отображено стандартное отклонение от средней величины).

Повышенное содержание цинка в почве приводит к полному ингибированию активности этой группы почвенных микроорганизмов. С возрастанием добавочной дозы этого поллютанта динамика численности целлюлозоразлагающих микроорганизмов не изменяется. Становится ясно, что данная группа является неустойчивой к цинковому загрязнению — количество этих микроорганизмов резко снижается с 48 КОЕ/г в контрольном значении до полного отсутствия в экспериментальных концентрациях.

На контрольных образцах почвы содержание данных микроорганизмов относительно невелико, что может объясняться высокой их чувствительностью к содержанию цинка в почве в целом. На территории ключевого участка содержание цинка не превышает предельно допустимой концентрации, но приближается к ней.

Общая тенденция сводится к постепенному снижению количества микроорганизмов на грамм почвы к концентрации 500 ПДК — с 77 КОЕ/г в контрольной пробе до 10 КОЕ/г, затем численность микроорганизмов начинает медленно восстанавливаться, достигая 42 КОЕ/г на концентрации в 1250 ПДК и 32 КОЕ/Г на 1500 ПДК.

Группы организмов, использующих минеральные формы азота, демонстрируют большую (в сравнении с целлюлозодеструкторами) устойчивость к воздействию добавочных доз цинка (рис. 5). Значительные концентрации не оказывают сильное угнетающее действие на эту группу микроорганизмов, и их активность не ингибируется. При концентрации 100 ПДК, 500 ПДК и максимальной — 1500 ПДК — наблюдается значительное увеличение численности микроорганизмов (до 14,7· 106 КОЕ/г), превышая значения таковой в контрольных пробах (8,9· 105 КОЕ/г). Наименьшее количество обнаружено при уровне загрязнения цинком 1000 ПДК и 1250 ПДК — 5,1· 105 КОЕ/г и 4,9· 105 КОЕ/г соответственно. При повышении концентрации поллютанта прослеживалось незначительные колебания численности микроскопических грибов. Однако, их доля в общем количестве исследуемой группы микроорганизмов не слишком велика, она достигает максимальных значений только при угнетении других микроорганизмов, использующих минеральные формы азота в пробах с концентрациями цинка 1000 и 1250 ПДК.

Вероятно, это может объясняться конкуренцией разных групп за питательные вещества на одном субстрате. Актиномицеты на исследованных образцах с данной питательной средой (КАА) не были обнаружены, тогда как присутствует большое количество микроорганизмов, систематическую принадлежность которых трудно определить.

Рис. 5 Зависимость количественного содержания микроорганизмов (КОЕ/г), от концентрации цинка на среде КАА.

Микроорганизмы из группы аммонификаторов не проявили особой чувствительности в повышению концентрации цинка (рис. 6). Но на диаграмме можно проследить зависимость от концентрации, напоминающую таковую в группе микроорганизмов, фиксирующих минеральные формы азота. В общей тенденции наблюдаются похожие колебания численности с минимальным значением при концентрации поллютанта в 1000 ПДК — 2· 105 КОЕ/г. При остальных уровнях концентрации цинка уровень численности аммонификаторов остается сравнительно стабильным (3,4 — 4,2· 105 КОЕ/г), что практически соответствует значению в контрольной пробе — 4,3· 105 КОЕ/г (в сравнении с пробами, несущими добавочную дозу цинка). Подобная стабильность численности может быть связана с частными изменениями микробного состава исследуемой почвенной пробы, где угнетение одних аммонифицирующих микроорганизмов создает благоприятные условия для развития других, более устойчивых.

Рис. 6 Зависимость количественного содержания микроорганизмов (КОЕ/г) от концентрации цинка на среде МПА.

Численность микроскопических грибов на среде МПА в общем количестве незначительная — 15 000−20 000 КОЕ/г, таким образом не превышая контрольного значения в 30 000 КОЕ/г. Пигментные бактерии регистрируются на пробах при всех добавочных концентрациях цинка, но их численность также незначительна — от 17 000 до 80 000 КОЕ/г в загрязненных пробах и 90 000 КОЕ/г в контрольном значении. Это может объясняться тем, что более многочисленные аммонифицирующие микроорганизмы легче переносят высокие концентрации цинка, что позволяет им занять более выгодную нишу и увеличить численность. Нельзя не заметить, что аммонификация — широко распространенный процесс в почве, обеспечиваемый широкой группой микроорганизмов. Он является важнейшим процессом деструкции органических веществ в почве, обуславливая её плодородие. Таким образом, снижение общего числа аммонифицирующих микроорганизмов может повлечь за собой упадок и обеднение почвы.

Численность спорообразующих бактерий на среде МПА наблюдается стабильной. Они являются доминирующей группой в общем количестве микроорганизмов на среде МПА. Среди спорообразующих бактерий в исследуемой пробе с максимальной добавочной концентрацией цинка преобладает род Bacillus. Его представители легко идентифицируются с помощью микроскопа при исследовании фиксированного препарата, приготовленного из исследуемой культуры. Определить видовой состав не представилось возможным — абсолютное большинство исследуемых клеток обладает схожими характеристиками, что затрудняет дальнейшее определение.

Минимальная численность спорообразующих бактерий обнаруживается в пробе с добавочной дозой в 1000 ПДК — 109 000 КОЕ/г, тогда как в контрольном значении их численность достигает 350 000 КОЕ/г. На других экспериментальных концентрациях численность спорообразующих бактерий не отличается от контрольной пробы в значительной мере. Это уже третий случай угнетения активности при данной концентрации в 1000 ПДК. Возможно, что наибольшее токсическое действие на некоторые группы почвенной микрофлоры цинк проявляет на концентрации в 1000 ПДК или близких к ней.

Спорообразующие бактерии на среде МПА+СА слабо реагируют на повышение концентрации цинка в исследуемых образцах почвы (рис. 7). На диаграмме наблюдаются слабые флуктуации численности. Не прослеживается прямой или косвенной зависимости между концентрацией цинка и количеством спорообразующих бактерий — их количество остается сравнительно стабильным в общем числе микроорганизмов. Минимальная их численность обнаруживается в пробе с добавочной дозой в 100 ПДК — 1500 КОЕ/г, причем на данной концентрации цинка наблюдается небольшой упадок численности как спорообразующих бактерий, так и самой общей численности микроорганизмов — 4300 КОЕ/г. Максимальная численность спорообразующих бактерий устанавливается на концентрации 1000 ПДК, достигая значения в 3200 КОЕ/г и далее оставаясь стабильной.

Рис. 7 Зависимость количественного содержания микроорганизмов (КОЕ/г) от концентрации цинка на среде МПА+СА.

Доля актиномицетов чрезвычайна мала и они обнаруживаются лишь в половине исследуемых образцов. Активность актиномицетов полностью ингибируется на концентрациях поллютанта 500 ПДК и 1000 ПДК. В остальных пробах актиномицеты обнаруживаются в двух третях от всех повторностей. Видимо, эта группа почвенных микроорганизмов также обладает высокой чувствительностью к цинковому загрязнению почв наряду с целлюлозодеструкторами.

Следует отметить, что эти данные идут в разрез с имеющимися в литературных источниках. Актиномицеты — одна из наиболее многочисленных групп, в то же время она является самой распространенной. Ранее её представители обнаруживались в городских почвах в изобилии и достаточно большом количестве. По некоторым данным их число достигало значения в 45· 106 КОЕ/г в почвах слабозагрязненной зоны (Куркина, Родимова, 2011).

В исследуемом образце с дополнительной дозой цинка в 1500 ПДК с помощью осмотра фиксированного препарата был идентифицирован представитель рода Micrococcus — единственного присутствующего представителя актиномицетов в исследуемых пробах с добавочным цинковым загрязнением. Это еще одно расхождения с данными литературных источников. Ранее обнаруживались актиномицеты рода Streptomyces с преобладанием секций Cinereus, Albus и Roseus (Куркина, Родимова, 2011). В настоящем же эксперименте данный род не обнаружился вовсе, а общее число актиномицетов чрезвычайно мало. Более подробный анализ состава этой группы микроорганизмов в исследуемых загрязненных образцах не представляется возможным именно из-за их сверхмалой численности.

Общее содержание микроскопических грибов в почве, загрязненной цинком, невелико (рис. 8).

Рис. 8 Зависимость количественного содержания микроорганизмов (КОЕ/г) от концентрации цинка на среде Чапека.

Их небольшая численность, регистрируемая на контрольных образцах (2900 КОЕ/г), уменьшается наполовину при первой же добавочной дозе цинка 100 ПДК и продолжает незначительно изменяться, создавая слабые флуктуации численности.

При этом возрастание общей численности микроорганизмов на данной среде наблюдается при добавочной концентрации 1000 ПДК — до 8200 КОЕ/г, что некое подобие обратной зависимости (в отличие от вышеописанных случаев) и превышает контрольное значение как минимум в 2,5 раза. В исследуемых пробах с микромицетами присутствует большое число микроорганизмов, принадлежность которых к определенной группе трудно определить.

Значительное повышение содержания данной группы микроорганизмов в почве нежелательно, так как вырабатываемые ими микотоксины способствуют неблагоприятным изменениям в микробоценозе почвы, оказывая губительное воздействие на отдельные компоненты почвенной микрофлоры. Это может повлечь за собой смену доминантных групп почвенных микроорганизмов, что вызовет нарушения в микробном балансе почвы и снизит общий показатель ее биологической активности.

Активность азотофиксирующих микроорганизмов на загрязненной цинком почве значительно снижена (рис. 9). Азотфиксаторы наблюдаются в присутствии всех добавочных концентраций цинка. Их численность не слишком сильно отличается от контрольного значения (150 000 КОЕ/г), за исключением одного случая — на максимальной концентрации поллютанта (1500 ПДК). В этом случае количество азотофиксаторов резко возрастает почти в 4 раза — до 600 000 КОЕ/г. Однако их доля в общем числе почвенных микроорганизмов остается не слишком значительной. На исследуемой среде Эшби так же обнаружилось большое число микроорганизмов, принадлежность которых к определенной группе трудно определить — многочисленные колонии представителей разных групп, не являющихся ключевыми на данной среде.

Рис. 9 Зависимость количественного содержания микроорганизмов (КОЕ/г) от концентрации цинка на среде Эшби.

Низкая численность азотфиксаторов в почве может привести к негативным изменениям не только в почвенной микрофлоре, но и в масштабах всей экосистемы. Это обосновывается тем, что данная группа микроорганизмов является неотъемлемым участником в круговороте азота в живой природе, а также важной симбиотической группой для высших растений. Полное ингибирование активности азотофиксирующих микроорганизмов может грозить упадком плодородного потенциала почвы и снижению ее способности к самоочищению.

Воздействие цинка в качестве поллютанта почвы на различные группы микроорганизмов представилось достаточно разносторонним. Наибольшую устойчивость к нему показали аммонифицирующие и спорообразующие группы микроорганизмов, а так же микроорганизмы, использующие минеральные формы азота. Численность вышеупомянутых групп оставалась относительно стабильной. Наибольшую чувствительность к цинковому загрязнению демонстрировали целлюлозоразлагающие микроорганизмы, исчезнувшие из исследованных образцов при первой добавочной концентрации цинка в 100 ПДК. Чуть меньшую чувствительность продемонстрировали актиномицеты и азотфиксирующие микроорганизмы. Актиномицеты являются самой малочисленной группой в исследованных пробах с высокими добавочными дозами цинка.

Отдельного внимания явно заслуживает фиксированная концентрация поллютанта в 1000 ПДК, так как именно в данной концентрации происходит угнетение групп почвенных микроорганизмов, признанных обладателями повышенной устойчивости к загрязнителю.

Таким образом, комплексное влияние загрязнения цинком в виде сульфата на микробный компонент биологической активности почв имеет достаточно разносторонний характер и проявляется в количественном и качественном изменении различных показателей почвенных микроорганизмов. Повышение уровня концентрации поллютанта может приводить к слабым колебаниям численности одних групп почвенных микроорганизмов, устойчивых к загрязнителю, тогда как доля других остается невысокой.

При сравнении активности разных групп почвенных микроорганизмов было установлено, что в разные группы характеризуются разнонаправленным изменением под влиянием воздействия высоких концентраций солей цинка.

Значительные изменения в составе почвенных групп микроорганизмов способны привести к деградации микробного комплекса почвы, что немедленно повлечет за собой изменения среди других компонентов биологической активности почв, с последующим накоплением поллютанта, утратой плодородия и способности к самоочищению. Данные изменения также могут привести к формированию вредной или патогенной микрофлоры — замещению доминантных групп микроорганизмов в присутствии загрязнителя.

Выводы

1) Влияние солей цинка на микробиологический компонент биологической активности почв имеет разносторонний характер, оказывая неоднозначное воздействие на качественные и количественные показатели различных групп почвенных микроорганизмов.

2) Чувствительными к повышенной концентрации сульфата цинка группами почвенной микрофлоры являются целлюлозоразлагающие микроорганизмы и актиномицеты, активность которых полностью ингибировалась при первой добавочной дозе поллютанта в 100 ПДК.

3) Устойчивыми группами микроорганизмов к загрязнению сульфатом цинка являются спорообразующие бактерии (3200−3400 КОЕ/г), в частности бактерии рода Bacillus, а так же группа аммонифицирующих микроорганизмов — их численность колебалась в достаточно узких пределах от 3,4 до 4,2· 105 КОЕ/г.

4) Максимальное угнетающее действие на активность микроорганизмов оказывают следующие концентрации поллютанта: 1000 ПДК и 1250 ПДК.

Библиографический список

1) Аванесян Н. М. Методические указания к практическим занятиям по «Основам токсикологии». — Ульяновск: Изд-во УлГТУ, Биохимия — 2006. — С. 7−10.

2) Анциферова О. А., Мурачёва Л. С. К характеристике почв городских парков Калининграда // Вестник БФУ им. И.Канта, Естественные науки — 2009. — № 07. — С. 83−90.

3) Буракаева А. Д., Русанов А. М., Лантух В. П. Роль микроорганизмов в очистке сточных вод от тяжелых металлов: методическое пособие. — Оренбург: Изд-во ОГУ, Биология — 1999. — С. 20−24.

4) Вайнерт Э. Биоиндикация загрязнений наземных экосистем. — М.: 1988. — С. 231 — 248.

5) Ващейкин А. С., Садовников П. В., Куркина М. В., Дедков В. П. О содержании тяжелых металлов в почвогрунтах урбанизированных экосистем Калининграда // Вестник БФУ им. И. Канта, Естественные науки — 2014. — С. 82 — 96.

6) Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов — 4-е изд., стер. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. -464 с.

7) Дедков В. П., Куркина М. В. Актуальные проблемы изучения микрофлоры почв города Калининграда // Вестник БФУ им. И.Канта, Естественные науки — 2009. — № 07. — С. 77−83.

8) Добровольский Г. В. Место и роль почвоведения в изучении и решении современных экологических проблем // Вестник МГУ. Сер. 17. Почвоведение. — 20 061. — № 2. — С. 3- 7.

9) Добровольский В. В. География микроэлементов: глобальное рассеяние. — М.: Мысль — 1983. — С. 65- 71, 110.

10) Добровольский В. В. Основы биогеохимии. Изд-во АCADEMIA — 2003. — С. 90−98.

11) Евдокимова Г. А., Мозгова Н. П. Биоразнообразие почвенной биоты, как фактор устойчивости почв к загрязнению // Тезисы Всероссийского совещания «Антропогенной воздействие на природу Севера и его экологические последствия». — Мурманская обл., 1998 — С. 1 — 2.

12) Егоров Н. С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб. пособие — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Изд-во МГУ, 1995. — 224 с.

13) Зайцева Т. А., Рудакова Л. В., Уланова Т. С. Оценка влияния выбросов автотранспорта на микрофлору экосистемы почвы // Фундаментальные исследования, Технические науки — 2014. — № 05. — С. 23−28.

14) Зигель Х., Зигель А. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов. — М.: Мир, 1993. — С. 233−245.

15) Иванова Е. Ю. Основы микробиологии и экологии бактерий. Методические указания. — Воронеж: Изд-во ВГУ, Геоэкология — 2000. — С. 12 — 13.

16) Казеев К. Ш., Колесников С. И. Вальков В.Ф. Биологическая диагностика и индикация почв: методология и методы исследований. Изд-во РГУ — 2003. — 216 с.

17) Калюжин В. А., Калюжина О. В. Влияние концентрированных растворов солей тяжелых металлов на физиологические и кинетические показатели микроорганизмов. — Томск: Биологические науки — 2006. — С. 218 — 221.

18) Ковда В. А. Почвенный покров, его улучшение, использование и охрана. — М.: Наука — 1981. — С. 69 — 182.

19) Козлова А. А. Учебная практика по физике почв: учеб.-метод. пособие. — Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2009. — 81 с.

20) Колесников О. В. Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему «микроорганизм-растение». Автореферат. — Москва: РГАУ-МСХА. — 2012. — С. 5 — 22.

21) Колосова И. И. Влияние ацетата свинца, солей тяжёлых металлов на репродуктивную функцию // Вестник проблем биологии и медицины — 2013. — Вып. 3, Том 2. — С. 13−18.

22) Костина Л. В., Куюкина М. С., Ившина И. Б. Методы очистки загрязненных тяжелыми металлами почв с использованием биосурфактантов // Вестник Пермского Университета. Вып. 10 (36). — Пермь: Биология, 2009. — С. 96 — 105.

23) Куркина М. В., Ващейкин А. С., Дедков В. П., Краснопёров А. Г. Сравнительный анализ групп микроорганизмов в естественных и антропогенно измененных бурых лесных почвах Калининградского полуострова // Вестник БФУ им. И. Канта, Естественные науки — 2013. — № 07. — С. 8−14.

24) Куркина М. В., Дедков В. П., Климова Н. Б., Лукина А. И., Крупнова М. А., Кусаинова Ж. Т. Новые данные о некоторых группах микроорганизмов в почвах города Калининграда // Вестник БФУ им. И.Канта, Естественные науки — 2009. — № 07. — С. 90−98.

25) Куркина М. В., Дедков В. П., Уманский А. С. Характеристика почвенно-растительного покрова экосистем Калининградского полуострова // Вестник БФУ им. И.Канта, Естественные науки — 2013. — № 01. — С. 114−119.

26) Куркина М. В., Дедков В. П., Уманский А. С., Титович А. С., Никитина С. М. Экологическая характеристика тестовых участков для микробиологического мониторинга почвогрунтов Калининграда // Вестник БФУ им. И.Канта, Естественные науки — 2012. — № 07. — С. 8−16.

27) Куркина М. В., Родимова А. А., Дедков В. П. Сезонная динамика актиномицетов почв зеленых зон Калининграда // Вестник БФУ им. И.Канта, Естественные науки — 2011. — № 07. — С. 8−16.

28) Лобачева Г. К., Колодницкая Н. В., Желтобрюхов В. Ф., Осипов В. М., Гучанова И. Ж., Гучанова А. И. Применение биотехнологии для очистки загрязнённых почв // Вестник ВолГУ, Технические инновации — 2011. — Серия 10. — Вып. 5. — С. 134−140.

29) Майстренко В. Н., Хамитов Р. З., Будников Г. К. Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов. — М.: Химия — 1996. — С. 10 — 111.

30) Мирошкина С. М., Вербенко В. Н. Микроорганизмы — индикаторы тяжелых металлов. — Гатчина. — 2008. — С 231 — 237.

31) Мосина Л. В. Основы экотоксикологии: Учебное пособие. — М.: Изд-во РГАУ — МСХА, 2013. 100с

32) Нетрусов А. И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко и др. Экология микроорганизмов: Учеб. Для студ. Вузов — М.: Издательский центр «Академия», 2004. — 272 с.

33) Нетрусов А. И., Котова И. Б., Микробиология: учебник для студ. высш. учеб. заведений — М.: Издательский центр «Академия», 2006. — 352 с.

34) Орлов Д. С. Химия почв. — М.: Изд-во МГУ — 1992. — 400 с.

35) Роева Н. Н., Ровинский Ф. Л., Кононов Э. Я. Журнал аналитической химии. — 1996. — Т. 51, № 4. — С. 384 — 397.

36) Садовников П. В., Куркина М. В. Актуальность изучения микрофлоры почвогрунтов вблизи полигонов ТБО (на примере Калининграда) // Вестник БФУ им. И.Канта, Естественные науки — 2013. — № 07. — С. 21−26.

37) Силков С. И. Биологическая активность почв // Вестник ЧГАА. Том 56. — 2010. — С. 79.

38) Спектрон рентгеновские спектрометры и анализаторы [электронный ресурс] Аппараты рентгеновские для спектрального анализа спектроскан макс-G, -GF1E, -GF2E // Паспорт PA7.000.000 ПС с изменениями № 1 URL: http://spectronxray.ru/upload/iblock/0c4/pasport_g_2012.pdf (Дата обращения: 06.03.2015)

39) Станченко Л. Ю. Распределение тяжелых металлов в почвах и растительности городских экосистем Калининградской области // Вестник БФУ им. И.Канта, Естественные науки — 2009. — № 01. — С. 81−85.

40) Теппер Е. З., Шильникова В. К., Переверзева Г. И. Практикум по микробиологии. — Москва — 2004. — 340 с.

41) Тёплая Г. А. Тяжёлые металлы как фактор загрязнения окружающей среды (обзор литературы) // Астраханский вестник экологического образования — 2013. — № 1. — С. 182−192.

42) Уманский А. С., Куркина М. В., Дедков В. П. Характеристика почвенного покрова Калининграда // Вестник БФУ им. И.Канта, Естественные науки — 2012. — № 07. — С. 134−138.

43) Чупахина Г. Н. Физиологические и биохимические методы анализа растений: Практикум / Калинингр. ун-т; - Калининград, 2000. — 59 с.

44) Юшков В. В., Юшкова Т. А., Стрелков В. В. Химия и экология 3d-элементов. — Екатеринбург: Изд-во УрО РАН — 2004. — 171 с.

45) White C. Microbial solubilization and immobilization of toxic metals: key biogeochemical processes for treatment of contamination // FEMS Microbiol. Rev. — 1997. — Vol.20. — P. 503- 516.

46) White C. An integrated microbial process for the bioremediation of soil contaminated with toxic metals // Nat. Biotechnol. — 1998. — Vol. 16. — P. 572- 575.

Размещена

Приложение Таблица 1

Количественный учет микроорганизмов (КОЕг) на среде Гетчинсона

Размещена