Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику, Клеггорну, Грофу)

Принцип. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая, реагируя со связанным билирубином сыворотки, дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива несвязанный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он также вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности последнего фотоколориметрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между общим и связанным билирубином находят содержание несвязанного билирубина, дающего непрямую реакцию.

Средние величины содержания различных фракций билирубина: общий билирубин — 11,12 мкмоль/л (0,65 мг/100 мл) связанный билирубин — 2,57 мкмоль/л (0,15 мг/100 мл) свободный билирубин — 8,56 мкмоль/л (0,50 мг/100 мл) [5].

Определение билирубина в малом объеме сыворотки крови

При выявлении гипербилирубинемии у новорожденных в роддомах, в детских учреждениях можно применять микрометод в модификации Т. Б. Доброседовой и А. С. Циркиной.

Количество сыворотки, необходимое для исследования общего, связанного и свободного билирубина, составляет 0,4 мл. Сыворотку разводят равным объемом физиологического раствора. Дальнейшее определение проводят согласно схеме (табл. 1).

Таблица 1. Данные для определения билирубина в малом объеме сыворотки крови.

Колориметрию и расчет производят так же, как это рекомендуется в унифицированном методе; поскольку сыворотки взято в опыт 0,125 мл, полученный результат умножают на 4 (при учете разведения) .

Норма—до. 20,52 мкмоль/л (1,2 мг/100 мл) общего билирубина, из которого до 25% может составлять связанный билирубин.

Примечание. Реактивы готовят так же, как и в унифицированном методе Йендрашика, Клеггорна, Грофа.

В связи с тем что билирубин сыворотки крови обладает характерной зоной светопоглощения в области 450 нм, в последние годы были предложены прямые фотометрические методы его определения. Их использование особенно важно в практике экспресс-анализа гипербилирубинемии. Л. Г. Чеховской и А. С. Циркиной был предложен колориметрический экспреcc-метод без применения каких-либо реактивов, состоящий в установлении содержания билирубина путем фотометрии проб на ФЭКе с синим светофильтром (длина волны 450 им является оптимальной). Этот способ может быть эффективен для быстрой ориентировочной оценки уровня билирубина в сыворотке крови при массовых обследованиях населения.

Hefe (1978), исследовав визуально 1691 сыворотку, нашел, что вначале необходимо провести тщательную визуальную оценку сыворотки и что количественно билирубин следует определять только в иктеричных сыворотках.

Для полуколичественного установления билирубина в сыворотке крови Schyfz разработал «Bilur Test» (ФРГ). В основе его лежит цветная реакция взаимодействия билирубина с диазониевой солью 2,6-дихлор-бензол-флюоборатдиазония. Через 1 мин после пропитывания полоски сывороткой появляющуюся окраску сравнивают с приданной цветной шкалой. С помощью этих полосок можно быстро ориентироваться в степени гипербилирубинемии.