Обзор литературы. 
Основные характеристики, проблемы и перспективы генной инженерии

Генетическая инженерия — раздел молекулярной генетики, исследующий возможности и способы создания лабораторным путем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т. е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм (А.А. Баев). Обычно употребляются два названия данного научного направления — генетическая инженерия и генная инженерия, являющиеся как бы синонимами. Однако их смысловое содержание неодинаково: генетическую инженерию связывают с генетикой, а генная имеет отношение только к генам. Кроме того, генетическая инженерия точнее раскрывает содержание дисциплины — создание генетических программ, основная задача которых — создание in vitro молекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях чаще не сочетаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы. Согласно определению национальных институтов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке». Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П. Бергом с сотр.) и была составлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бактериофага л dvgal с галактозным опероном E. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами — рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4−6 нуклеотидов (сайт узнавания). Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод амплификации фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно достаточно быстро (в течение нескольких часов) получить миллионы копий определенных нуклеотидных последовательностей (генов). Метод был предложен в 1985 г. К. Мюллисом (биотехнологическая корпорация «Cetus», США) и получил широкое распространение в 1988 г., когда Р. Сайки с соавт. была опубликована основополагающая работа по теории ПЦР и её оптимизации. Метод ПЦР, названный «изобретением века» и очень скоро, в 1993 г., отмеченный Нобелевской премией, ускорил реализацию программы «Геном человека», а также способствовал внедрению в практику клинической диагностики многих заболеваний высокоэффективных диагностических наборов нового поколения.

В методе ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимеразу), которая в присутствии всех 4 видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и коротких 20−30-членных затравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностей ДНК. ПЦР имеет циклический, включающих нагревание и охлаждение проб, и цепной характер, так как синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Повторяя циклы амплификации 30−40 раз, за 1,5 — 3 ч получают миллионы копий фрагментов ДНК.

Лигазная цепная реакция проводится по принципу, аналогичному ПЦР, но вместо Taq-полимеразы и dNTP используется термостабильная ДНК-лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к амплифицируемому фрагменту ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу; одновременно они комплементарны и другой паре олигонуклеотидов.