Приготовление и контроль иммунопероксидазных конъюгатов для ИФА при ЧМЖЖ

Как известно, наиболее важным фактором, влияющим на чувствительность, специфичность и воспроизводимость ИФА, является качество используемых конъюгатов. В свою очередь качество конъюгатов находится в прямой зависимости от качества (чистоты, активности и специфичности) используемых для конъюгации иммуноглобулинов и антител. В связи с этим, первым этапом исследований в этом направлении была отработка условий выделения и очистки активных и специфичных иммуноглобулинов и антител из специфических и антивидовых сывороток.

Гамма-глобулиновые фракции из вирусоспецифических сывороток мелкого рогатого скота выделяли различными методами:

• — Ступенчатым осаждением альбумина и иммунных глобулинов, различными концентрациями этилового спирта по методу Кона;
• — Трехкратным осаждением общей глобулиновой фракции насыщенным раствором сульфата аммония при 40%, 35% и 33% степени насыщения раствора по общепринятой методике;
• — Осаждением гамма-глобулина из сыворотки крови спиртово-хлороформным методом.

Для оценки качества полученных иммуноглобулинов последние параллельно с исходными сыворотками исследовали на активность и специфичность в РДП и ИФА.

В процессе работы из выделенных специфических иммуноглобулинов наиболее активным и специфичным оказались иммуноглобулины, полученные с помощью спиртового осаждения по Кону. Осаждение иммуноглобулинов спиртово-хлороформным методом и трехкратное переосаждение общей фракции глобулинов с помощью насыщенного раствора (NH₄)2SO₄ позволяли получить иммуноглобулины с достаточно высокой активностью в РДП и ИФА, но приготовленные в дальнейшем на их основе конъюгаты давали значительное неспецифическое фоновое окрашивание, в то время как конъюгаты, приготовленные на основе иммуноглобулинов, выделенных по методу Кона были достаточно специфичными в ИФА.

Следующим этапом исследований для выделения и очистки антивидовых антител были испытаны методы:

• — спиртовое осаждение гаммаглобулина по Кону;
• — аффинная очистка антител по методу S.Avrameas и T.Ternynck.

Методом Кона было выделено 5 серий антивидового гаммаглобулина, преципитирующая активность приготовленных иммуноглобулинов была 1:8−1:16. Иммунопероксидазные конъюгаты, приготовленные на их основе, имели предельные титры в ИФА 1:800−1:1600 и соответственно рабочие 1:200−1:400, однако были неспецифичны до разведения 1:100−1:200, да и в своем рабочем разведении вызывали неспецифическое фоновое окрашивание при исследовании нормальных сывороток. По этому с целью повышения специфичности ИФА в дальнейших наших исследованиях был испытан метод аффинного выделения антивидовых антител на белково-глютаральдегидном иммуносорбенте. Результаты исследования доказывают, что аффинно-очищенные антитела, выделенные указанной методике, имеют высокую иммунологическую активность в РДП. В дальнейшем на основе препаратов аффинно-очищенных антивидовых антител были приготовлены иммунопероксидазные конъюгаты для ИФА. Конъюгаты обладали достаточной специфичностью и позволили выявлять антитела к вирусу ЧМЖЖ, начиная в цельном виде и с разведения сыворотки 1:10.

Таким образом, в результате проведенных исследований были подобраны оптимальные условия выделения и очистки активных и специфичных препаратов вирусоспецифических и антивидовых антител. Это позволило перейти к отработке методов конъюгации приготовленных глобулинов и антител с пероксидазой хрена.

По данным литературы наиболее эффективными методами конъюгации антител с пероксидазой хрена признаны периодатные (P.K. Nakane и A. Kawaoi; M.B. Wilson и P.K. Nakane). Исходя из этого, они были испытаны для приготовления вирусоспецифических и антивидовых конъюгатов, пригодных для ИФА при ЧМЖЖ. С применением метода P.K. Nakane и A. Kawaoi было приготовлено 4 микросерии вирусоспецифического и 3 микросерии антивидового конъюгата, методом M.B.Wilson и P.K. Nakane — 6 микросерий вирусоспецифического и 4 микросерии антивидового конъюгата. Для конъюгации использовали в основном пероксидазу хрена с Rz Степень чистоты препаратов пероксидазы характеризуется величиной RZ (Reinheitszahl), которая соответствует отношению оптических плотностей при л =403 и 275 нм. = 2,6- 3,4 и активностью по белку 650−1400 ЕД/мг. Приготовленные конъюгаты очищали от несвязавшихся реагентов методом гельфильтрации через сефадекс G-200.

Активность и специфичность приготовленных серий вирусоспецифического и антивидового конъюгатов проверяли методом их шахматного титрования в прямом и непрямом вариантах ИФА соответственно.

Таким образом, в результате проведенных исследований по приготовлению активных и специфичных иммунопероксидазных конъюгатов было установлено, что из испытанных двух периодатных методов конъюгации антител с пероксидазой хрена лучшим оказался метод M.B.Wilson и P.K. Nakane. Данный метод конъюгации позволил получить активные и специфичные иммунопероксидазные конъюгаты с титром в ИФА 1:400−1:1600, которые были активнее в 4 раза [4, 9].