Лабораторная работа № 9. Индукция органогенеза в каллусной ткани картофеля

Фитогормоны — это биологические регуляторы роста и развития растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов, стимулирующие и ингибирующие морфогенетические и физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток растяжением, состояние покоя, созревание, старение, формирование пола, устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную последовательность фаз индивидуального развития.

Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением и их деление, а в сочетании с цитокининами — органогенез. В биотехнологии применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические — ИМК (индолил-3-масляная кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК (нафтилуксусная кислота).

Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролиферацию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся: зеатин, кинетин (6-фурфуриламинопурин); к синтетическим — БАП (6-бензиламинопурин). Следовательно, изменяя соотношение гормонов в питательных средах, можно в какой-то степени изменять и генетические программы клеток и тканей. Эти процессы известны как дифференциация клеток и тканей, дедифференциация и редифференциация.

В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило Скуга-Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги.

Таким образом, для индукции органогенеза каллусы пересаживают на среду с высоким содержанием цитокининов, а для укоренения образовавшихся побегов используют среду с повышенным содержанием ауксинов.

Индукция морфогенеза и регенерация растений — сложный многостадийный процесс. У каллусной культуры картофеля можно выделить несколько стадий:

• — индукцию зеленых меристематических зон;
• — появление почек de novo;
• — формирование микропобегов с последующим их укоренением.

Цель работы: провести индукцию органогенеза в каллусной ткани картофеля.

Оборудование и материалы: колбы на 50 мл со стерильном питательной средой (МС без гормонов), колбы со средами для органогенеза и ризогенеза, флаконы с 96% спиртом, стерильные пинцеты, препаровальные иглы, спиртовка, ламинар-бокс.

Объект исследования: пробирки с каллусами табака.

Ход работы: стерильным пинцетом переложить каллусы на стерильную поверхность, разделить на кусочки 5×5 мм и поместить в колбы с питательными средами: МС без гормонов и МС + 2 мг/л 6-БАП + + 1 мг/л НУК. Колбы перенести в культуральную комнату с температурой 25 °C, влажностью воздуха 70% и интенсивностью освещения 3 кЛк.

Через 1 неделю отметить появление структурированных очагов, через 3—5 недель — меристематических зон ярко-зеленого цвета. Еще через 1—2 недели отметить появление апексов.

При дальнейшем культивировании апексы превращаются в микропобеги.

На одном экспланте может дифференцироваться до нескольких десятков побегов. Когда они достигнут высоты 10 мм, отделить их от каллусной ткани в стерильных условиях. Перенести побеги на среды для индукции корнеобразования: МС без гормонов и МС + 2 мг/л ИМК + 1мг/л ГК, и поместить на 20 дней в темноту. Через 7—14 дней отметить появление корней.

Задание: записать количество апексов, появившихся на каждом каллусе. Результаты эксперимента зарисовать через 2, 4, 6 и 8 недель. Сделать выводы о влиянии различных гормонов на органогенез каллусной ткани.