РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА «in vivo»

РЕПАРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ОБЛАСТИ ЗАЖИВАЮЩЕЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАНЫ, ПО ДАННЫМ МАКРОСКОПИЧЕСКОГО, ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО И ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЙ.

Воспалительная реакция тканей в зоне зашитых ран была слабо выражена, ни в одной из серии животных такого осложнения как некроз краев раны не отмечено, в единичных случаях при иссечении рубца наблюдалось выделение серозного, реже гнойного отделяемого.

За время проведения эксперимента в раннем послеоперационном периоде (в течение первых суток после вмешательства) погибли 2 крысы по причине дефектов анестезиологического пособия: одна из серии «ПГН», другая из серии «ПГН с доксициклином». Остальные животные наркоз и ранний послеоперационный период перенесли стандартно.

На протяжении первых суток крысы вели себя спокойно, через некоторое время после выхода из наркоза охотно принимали пищу. По истечении 6 часов после операции полностью восстанавливалась их мобильная активность. Лишь при взятии отпечатков с поверхности послеоперационной раны животные вели себя беспокойно, уклонялись от предметного стекла. Через трое суток крысы вели себя менее активно, чем в первые сутки, в движении было заметно щажение области нанесенного дефекта. Аппетит не изменялся, пищу животные принимали охотно.

Визуально при макроскопическом исследовании животных всех трех серий в первые сутки наблюдения существенных отличий в течении раневого процесса не отмечалось. Спустя 6 и 12 часов после операции рана представляла собой линейный дефект кожи, имелись небольшой отек краев, скудное количество серозного отделяемого. Спустя сутки после ушивания ран, края их полностью смыкались, раневой дефект был покрыт серозным, а в некоторых случаях серозно-геморрагическим струпом. При использовании нитей, содержащих сангвиритрин или доксициклин, отмечалось раннее смыкание краев раны с появлением на ее поверхности плотно прикрепленного струпа, препятствующего получению мазков-отпечатков для цитологического исследования.

На третьи сутки после операции отличия во внешнем виде ран в сравниваемых сериях животных были слабо выражены. Отмечалась умеренная гиперемия краев раны, окружающие ткани на расстоянии около 0,5 см от раны были отечны и инфильтрированы, отделяемого практически не наблюдалось (рис. 6).

Рис. 6. Внешний вид раны, зашитой: А — ПГН; Б — ПГН с сангвиритрином;

В — ПГН с доксициклином через 3 суток после операции.

На пятые-седьмые сутки у отдельных животных наметились существенные отличия в течении послеоперационного периода. Эти крысы были неактивны, лежали на здоровом боку, принимали пищу в меньшем количестве в сравнении с другими животными. Как правило, именно у них выявлялись наиболее выраженные воспалительные изменения тканей в области раны.

В контрольной серии (ПГН) у большей части животных признаки раневого воспаления оказались более выраженными, чем в предыдущий срок наблюдения. У трех животных увеличился отек, усилилась гиперемия кожи; в области раны под кожей были обнаружены полости, при ревизии которых получен жидкий гнойный экссудат в умеренном количестве (рис. 7 А).

В серии «ПГН с сангвиритрином» лишь у одного животного отмечались симптомы раневого воспаления (отек и гиперемия краев раны, наличие полости с жидким гнойным отделяемым). У остальных крыс этой серии отек распространялся до 0,2−0,3 см от краев раны, которые плотно смыкались между собой; струп начинал отторгаться, под ним обнаруживалась новообразованная эпителиальная ткань; раневого отделяемого не наблюдалось (рис 7 Б).

В этот же период наблюдения у животных, раны которых ушивались полигликолидными нитями с доксициклином, слабая болезненность при пальпации, гиперемия кожи вокруг раны выявлялись лишь в редких случаях. Флюктуирующих полостей не встречалось. Раны остальных животных указанной серии не имели явных признаков воспаления (рис. 7 В).

На протяжении всего периода наблюдений у крыс ни в одной из серий не наблюдалось таких осложнений как расхождение краев раны, лигатурные свищи, некроз краев раны.

А.

Б В.

Рис. 7. Внешний вид раны, зашитой: А — ПГН; Б — ПГН с сангвиритрином; В — ПГН с доксициклином через 5 суток после операции.

Таким образом, отмечена положительная динамика течения раневого процесса у всех животных. Наименее выраженная клиническая картина воспаления была выявлена у крыс серий «ПГН с сангвиритрином» и «ПГН с доксициклином».

Обнаруженная при макроскопическом анализе тенденция нашла подтверждение при исследовании ранней фазы репаративного процесса (воспалительной реакции) с помощью цитологического метода. Он широко используется и является весьма эффективным при изучении различных средств, применяющихся для лечения ран, в том числе в условиях эксперимента.

Изучение мазков-отпечатков с поверхности раны дало возможность выявить у животных всех экспериментальных серий количественный и качественный состав клеточных элементов раневого экссудата. Динамическое наблюдение цитологической картины позволяет оценить скорость заживления, прогнозировать его течение, своевременно распознавать возникающие осложнения и корригировать проводимое лечение.

В цитограммах животных контрольной серии (ПГН) через 6 часов после операции наблюдалась характерная реакция выселения клеточных элементов, среди которых преобладали нейтрофильные лейкоциты, их количество составило 124,63±6,4 в 10 полях зрения (табл.4). Нейтрофилы имели четкие контуры и хорошо сегментированное ядро, состоящее из 3−6 фрагментов. Клетки в поле зрения располагались неравномерно, группами. Обнаруживались единичные лимфоциты с большим округлым ядром и узким ободком цитоплазмы, макрофаги не определялись (рис. 8А).

АБ В Рис. 8. Клетки раневого экссудата через 6 часов после нанесения повреждения: А — контрольная серия (ПГН); Б — вторая серия (ПГН с сангвиритрином); В — третья серия (ПГН с доксициклином). х1100. Окраска по Романовскому-Гимзе.

Уже в этот срок исследования выявлялись отличия цитологического состава экссудата животных двух других серий в сравнении с контролем.

В отпечатках с поверхности ран животных второй серии (ПГН с сангвиритрином) количество нейтрофильных лейкоцитов составило 136,25±4,8 а в контроле оно было ощутимо меньшим — 124,63±6,4 (табл. 4), хотя выявленное различие и не оказалось значимым (р0,05). Клетки, как правило, формировали отдельные скопления, четкая сегментация ядер отсутствовала, что может свидетельствовать о наличии в них дегенеративных изменений. В этот период отмечено появление макрофагов (11,9±3,14 в 10 полях зрения), имеющих в цитоплазме большое количество пищеварительных вакуолей (рис. 8 Б).

В третьей серии (ПГН с доксициклином) в цитограммах животных количество нейтрофильных лейкоцитов составляло 168,5±10,11 в 10 полях зрения и было значимо больше значений в контрольной серии (р0,05) того же срока наблюдения (табл. 4). Ядра нейтрофилов были увеличены в диаметре и утрачивали четкую сегментацию. Макрофаги функционально характеризовались высокой фагоцитарной активностью, в их цитоплазме определялись пищеварительные вакуоли с микробными телами на разных стадиях переваривания (рис. 8 В).

В следующий срок исследования, через 12 часов после нанесения травмы, выявились некоторые качественные и количественные цитологические отличия у животных во всех трех сериях по сравнению с предыдущим сроком наблюдения.

В цитограммах животных контрольной серии (ПГН) количество выселившихся нейтрофильных лейкоцитов значительно возросло и составило 256,38±7,12 в 10 полях зрения (табл. 4). В отпечатках нейтрофилы располагались достаточно равномерно. Диаметр их ядер имел бьльшие значения (11,91±0,7 мкм) по сравнению с предыдущим сроком наблюдения у крыс той же серии. Наблюдалось явление физиологической дегенерации нейтрофилов (рис. 9А), выражающееся в гомогенизации, фрагментации и пикнозе их ядер. Отмечалась типичная реакция фазы воспаления раневого процесса — появление относительно небольших (диаметр 13,0±0,1 мкм) отдельно расположенных макрофагов. Клетки обнаруживали активную фагоцитарную деятельность, микроорганизмы в их пищеварительных вакуолях имели нечеткие контуры.

Рис. 9. Микроскопическая картина цитограмм животных через 12 часов после травмы: А — контрольная серия (ПГН); Б — вторая серия (ПГН с сангвиритрином); В — третья серия (ПГН с доксициклином). Окраска по Романовскому-Гимзе. х1100.

В реакции выселения клеток у животных второй (ПГН с сангвиритрином) и третьей (ПГН с доксициклином) серий в тот же период наблюдения выявлены отличия по сравнению с контролем. Наблюдалось нарастание миграции клеточных элементов, которые располагались большими скоплениями. В цитограммах крыс этих серий обнаруживался активный диапедез клеток крови, что проявлялось количественным превалированием нейтрофилов по сравнению с аналогичным сроком контрольной серии (271,7±6,9 и 332,4±7,8 против 256,38±7,1 в 10 полях зрения соответственно). Количество нейтрофильных лейкоцитов в цитограммах животных третьей (ПГН с доксициклином) серии было значимо больше (р0,05) в сравнении с контрольной серией данного срока наблюдения (табл. 4).

Подавляющее большинство клеток было увеличено в размерах, их структура характеризовалась нарушением ядерной сегментации, в результате ядро становилось рыхлым, гомогенным. В этот период проявлялась выраженная функциональная активность макрофагов, заключающаяся в увеличении их количества в экссудате по сравнению с контрольной серией (рис. 9Б и 9В). Диаметр ядер макрофагов был увеличен почти в два раза по сравнению с предыдущим сроком наблюдения у животных этой же серии (табл. 4).

Через 24 часа после операции получить мазки-отпечатки удалось только у животных контрольной серии (ПГН), поскольку к этому сроку поверхность ран у крыс других серий была покрыта плотным струпом. В цитограммах животных контрольной серии количество нейтрофилов сократилось по сравнению с предшествующим сроком и составило 73,1±8,07 в 10 полях зрения (табл. 4). Макрофагальная реакция еще более усиливалась: размеры ядер макрофагов имели бьльшие значения (15,19±0,5 мкм) по сравнению с предыдущим сроком наблюдения; возрастало количество вакуолей и фагоцитированных частиц в их цитоплазме (рис.10).

Рис. 10. Крупные макрофаги с множественными пищеварительными вакуолями в цитоплазме крыс контрольной серии через 24 часа после нанесения повреждения. Окраска по Романовскому-Гимзе. х 1100.

Таким образом, ушивание ран биорезорбируемыми нитями, импрегнированными антибактериальными препаратами, привело к раннему выселению клеточных элементов из кровеносного русла, появлению макрофагов и повышению их функциональной активности, что свидетельствует об ускоренном течении фазы воспаления. Причем, наиболее отчетливо эти явления выражены у животных третьей серии (ПГН с доксициклином).

Таблица 4.

Количество и диаметр клеток раневого экссудата (в 10 полях зрения) в послеоперационном периоде (M±m).

Примечание: *- р 0,05 (по сравнению с контролем).

**- р 0,01 (по сравнению с контролем) Течение следующей фазы процесса заживления ран в зависимости от используемых нитей изучалось с помощью микроскопического анализа гистологических срезов биоптатов тканей области ран.

На микропрепаратах ран, зашитых интактным биорезорбируемым шовным материалом (серия «ПГН»), на третьи сутки после нанесения дефекта еще обнаруживались массивный струп, лейкоцитарная инфильтрация тканей области повреждения (рис. 11). Под рыхлым струпом располагался массивный лейкоцитарный вал, в основном состоящий из нейтрофильных гранулоцитов. Область повреждения была выполнена тканью, обильно инфильтрированной форменными элементами крови (рис. 12).

Рис. 11. Область повреждения у животного контрольной серии через

3 суток после операции. Гематоксилин-эозин. х 100.

Рис. 12. Лейкоцитарная инфильтрация регенерирующих тканей через

3 суток после операции. Контрольная серия. Гематоксилин-эозин. х 280.

Эпителиальный регенерат в центре дефекта был гипертрофирован; толщина его в центре раны составляла 67,7±7,53 мкм, а протяженность — 598±12,48 мкм. Базальная мембрана в отдельных участках формировала выросты в подлежащую ткань.

Менее выраженные проявления воспалительной реакции в этот срок наблюдались у животных серий «ПГН с сангвиритрином» и «ПГН с доксициклином». Струп у животных этих серий более плотно прилегал к поверхности раневого канала, который был заполнен экссудатом (рис. 13А, Б). Под струпом наблюдался рост новообразованного эпителия, толщина которого составляла соответственно 75,75±6,29 и 82,1±4,33 мкм (табл. 5). Базальная мембрана была неровной, формировала выросты в подлежащую ткань с образованием единичных дериватов дермы в виде волосяных фолликулов и сальных желез.

А.

Б Рис. 13. Регенерирующие ткани раны. 3 суток после операции: А — вторая серия (ПГН с сангвиритрином); Б — третья серия (ПГН с доксициклином). Гематоксилин-эозин. х 70.

Таблица 5

Биометрические показатели раны через 3 суток после операции (M±m).

Примечание: * - р 0,05 (по сравнению с контролем) Через 5 суток после нанесения ран у крыс всех экспериментальных серий при анализе микропрепаратов отмечено снижение высоты лейкоцитарного вала по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. Одновременно с этим наблюдалась активная пролиферация эпителиального пласта, состоящего из 3−4 рядов клеток (рис. 14). У крыс серии «ПГН с доксициклином» протяженность его была наибольшей и составила 622,85±11,75 мкм, причем базальная мембрана эпителиального регенерата образовывала выросты в толщу дермы с формированием из них фолликулов и сальных желез.

А Б.

В Рис. 14. Область повреждения через 5 суток после операции: А — контрольная серия (ПГН); Б — вторая серия (ПГН с сангвиритрином); В — третья серия (ПГН с доксициклином). Гематоксилин-эозин. х 70.

Седьмые сутки послеоперационного периода характеризовались формированием новообразованной соединительной ткани. Струп, покрывающий область бывшего повреждения кожи крыс, на препаратах либо отсутствовал, либо определялся в виде небольших фрагментов. На микропрепаратах животных контрольной серии (ПГН) новообразованный эпителий был еще утолщен (52±8,94 мкм), протяженность его поверхности составляла 647,75±26,53 мкм, что превышало показатели предыдущего срока наблюдения в этой же серии (табл. 6). Очертания базальной мембраны были относительно ровными, образование коротких выростов в подлежащую ткань наблюдалось только на периферии регенерата (рис. 15 А).

Исследование гистологических препаратов биоптатов регенерирующих тканей животных второй и третьей серий выявило следующие отличия. Новообразованный эпителий был утолщен (табл. 6). Базальная мембрана эпителия формировала немногочисленные выросты в толщу дермы, в центре регенерата дериваты дермы не обнаруживались (рис. 15 Б).

При анализе микропрепаратов новообразованных тканей крыс серии «ПГН с доксициклином» было выявлено более интенсивное по сравнению с другими сериями течение формообразовательных процессов (рис. 15 В). Новообразованный многослойный эпителий на большинстве препаратов полностью покрывал раневой канал, его толщина составляла 67,5±12,64 мкм. Коллагеновые волокна в толще дермы уплотнялись, располагались параллельно друг другу, реже образовывали пучки. Соединительная ткань имела более зрелый вид, приближаясь по структуре к фиброзной. Область повреждения приобретала признаки строения неповрежденной кожи с характерными многочисленными выростами в подлежащую ткань базальной мембраны эпителия. Количество производных кожи было больше по сравнению с животными этой же серии в предыдущий срок наблюдения (13,3±1,52 и 11,15±1,66 в поле зрения соответственно).

А Б.

В Рис. 15. Область повреждения через 7 суток после операции: А — контрольная серия (ПГН); Б — вторая серия (ПГН с сангвиритрином); В — третья серия (ПГН с доксициклином). Гематоксилин-эозин. х 70.

Таблица 6.

Биометрические показатели раны через 7 суток после операции (M±m).

Примечание: * - р 0,05 (по сравнению с контролем).

Результаты проведенных морфологических исследований свидетельствуют о положительном влиянии на течение фазы пролиферации раневого процесса новых видов биорезорбируемых антимикробных шовных материалов, созданных на основе полигликолидной нити путем введения в ее состав сангвиритрина или доксициклина, и использованных для ушивания экспериментальной раны. Следствием применения указанных видов нитей явилось ускорение и более совершенное течение репаративных процессов с оптимальным заживлением ран первичным натяжением. Полученные результаты показывают целесообразность применения новых видов биорезорбируемых нитей в клинической практике.