Иммунофенотипическая характеристика лейкозных клеток при остром лейкозе

При выявлении в образце неопластических клеток и определении их количества должны быть решены две основные задачи ИФТ гемобластозов:

• 1) идентификация патологических клеток,
• 2) иммунофенотипическая характеристика бластов, в том числе
• * определение линейной принадлежности бластов и уровня их дифференцировки,
• * определение степени гетерогенности клеток патологической популяции за счет выявления различных патологических клонов или наличия клеток на разных стадиях дифференцировки,
• * получение подробной фенотипической характеристики каждой выявленной субпопуляции патологических клеток.

Определение линейной принадлежности лейкозных бластов является обязательной частью обследования пациентов с подозрением на гемобластоз. Для этого может быть достаточной оценка экспрессии маркеров скрининговой панели:

Ї линейную принадлежность клеток определяют:

• (а) миелоидные маркеры: МПО, СD13, СDЗЗ;
• (б) лимфоидные маркеры:

маркеры Т-лимфоцитов СD2, СD7, суСDЗ и sСDЗ;

маркеры В-лимфоцитов СD10, СD19, суСD22 и sСD22;

— незрелость клетки характеризуют ТdТ, СD34, НLА-DR.

Определение линейной коммитированности опухолевых клеток тем проще, чем больше дифференцировочных маркеров выявляется на их мембране. Трудности в определении линейной принадлежности бластов чаще всего связаны с отсутствием экспрессии линейных маркеров на поверхностной мембране клеток и с существованием перекрестной экспрессии линейных антигенов. Поверхностные линейно-ассоциированные маркеры не выявляются при опухолевой трансформации самых ранних клеток — предшественников гемопоэза или (в отдельных случаях) утрачиваются при опухолевой прогрессии и/или после химиотерапии. При отсутствии экспрессии линейных маркеров на поверхностной мембране клеток необходимо выявлять маркеры линейной принадлежности (миелопероксидаза — МПО, СDЗ, СD79б, СD22) в цитоплазме, что требует введения дополнительных шагов в протокол пробоподготовки. Чтобы избежать необходимости последовательного проведения дополнительных окрашиваний, логичнее с самого начала включить в диагностическую панель несколько сочетаний маркеров для выявления внутриклеточных антигенов. Это требует минимального увеличения времени пробоподготовки за счет фиксации и пермеабилизации, но компенсируется получением абсолютно достоверной информации о линейной принадлежности бластов.

В некоторых случаях острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) на бластах могут быть выявлены антигены, в норме (на зрелых клетках) ассоциирован-ные с лимфоцитами (СD2, СD7, СD19), а при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) — ассоциированные миелоидными клетками (СD13, СD14, СD15, СDЗЗ, wСD65) или реже с натуральными киллерами (СD56, СD57). Поэтому для безошибочного определения линейной принадлежности бластов необходимо использовать не один, а несколько линейно-ассоциированных маркеров. Наиболее специфичными маркерами В-линейности являются суСD79б и поверхностные или цитоплазматические иммуноглобулины. Для ОЛЛ заинтересованность В-линии подтверждается экспрессией по крайней мере двух из трех линейных маркеров (суСD22, СD19, суСD79б). Для установления варианта В-клеточного ОЛЛ необходимо оценить экспрессию ТdТ, СD34, СD19, СD79б, суСD22, cyIgм, sIg, kи л-цепей иммуноглобулина.

Наиболее специфичными маркерами Т-ряда являются поверхностный и/или цитоплазматический СDЗ и Т-клеточный рецептор (ТСR). Предшественники Т-клеток ОЛЛ обычно положительны по СD7 и отрицательны по СD19. Для установления варианта Т-ОЛЛ необходимо оценить экспрессию СD1а, СD2, сyСDЗ, СD4, СD5, СD8, СD16, СD56, варианта ТСR.

Одновременное отсутствие или аномальная реактивность с маркерами СD7 и СD19 при наличии позитивной реакции с миелоидными маркерами является доказательством нелимфоидного происхождения лейкоза даже при отсутствии МПО. Для миелоидных клеток наиболее высокоспецифичными маркерами являются МПО и лизоцим. До настоящего времени иммунологическая классификация миелолейкозов разработана недостаточно, но требует оценки экспрессии значительного числа маркеров.

Исключением являются мегакариоцитарные маркеры СD61, СD41, СD42 и эритроидный антиген гликофорин А, с помощью которых можно верифицировать мегакариобластный лейкоз (ОМЛ, вариант М7) и острый эритромиелоз (ОМЛ, вариант М6), но именно эти формы максимально узнаваемы клинически и морфологически и редко требуют проведения ИФТ с диагностической целью.

При обнаружении на бластных клетках одновременной яркой экспрессии антигенов различных гемопоэтических линий, т. е. при подозрении на бифенотипический лейкоз (БФЛ) дополнительным шагом интерпретации данных ИФТ является балльная оценка экспрессии маркеров. Она проводится, согласно рекомендациям Европейской группы по изучению лейкозов, если в популяции лейкозных бластов не менее 10— 20% клеток одновременно несут миелоидные и лимфоидные маркеры. Каждый маркер оценивается определенным баллом. Диагноз БФЛ ставится при оценке больше двух баллов для миелоидной и одного — для лимфоидной линии. Предполагая БФЛ, надо обращать внимание на внутриклеточную экспрессию не одного, а как минимум двух маркеров миелоряда, чтобы избежать ошибочной гипердиагностики.

Практически у всех пациентов с ОЛ фенотип патологических клеток является аберрантным, т. е. не полностью соответствующим какому-то определенному уровню дифференцировки нормальной клетки крови. Эта аномальная экспрессия отражает генетические изменения, лежащие в основе опухолевого перерождения лейкозной клетки. Таким образом, именно аберрации антигенной экспрессии позволяют отделять/дискриминировать здоровые клетки от патологических при анализе биологического материала пациентов с подозрением на онкогематологическое заболевание.

Достаточно большое количество диагностических маркеров и соответственно большой объем получаемой при ИФТ информации обусловливают необходимость применения алгоритма ее интерпретации. В основе его лежит привычный двухшаговый подход: последовательно оценивается антигенная экспрессия маркеров, необходимых для первичной диагностики заболевания и полноценного описания патологической популяции при мониторинге заболевания, в том числе при резидуальной болезни.

ИФТ-характеристика опухолевых клеток во многом определяется тем, какие МКА и в каких комбинациях выбраны лабораторией. Различные сочетания антител могут давать сходную информацию, но ни один не является оптимальным для всех диагностических ситуаций. Некоторые комбинации могут показаться повторяющимися или лишними, однако надо помнить, что опухолевые клетки часто демонстрируют патологическую экспрессию антигенов, т. е. такую характеристику, которая может быть пропущена при использовании неадекватного числа маркеров. Необходимо, чтобы лаборатория была хорошо знакома с особенностями каждой комбинации антител и с особенностями ее связывания с нормальными и патологическими клетками. Рестрицированная, сокращенная панель может ограничивать возможность выявления минимальной остаточной болезни и даже приводить к ошибочной диагностике первичного заболевания. Данные ИФТ являются обязательной составной частью исследований, так же как и демографическое описание пациента, характеристика течения заболевания, морфология и цитохимия клеток крови и костного мозга, цитогенетика. Полноценный развернутый диагноз ОЛ может и должен быть получен с помощью всего арсенала клинико-лабораторной информации [8].

Заключение

Иммунофенотипирование является современным и одним из важнейших методов лабораторной диагностики заболеваний крови. Благодаря внедрению в медицинскую практику МАТ, стало возможным исследовать фенотипы как нормальных клеток крови (лейкоцитов) и костного мозга, так и генетически измененных, лейкозных клеток, и, как следствие, осуществлять с их помощью дифференциальную диагностику гемобластозов.

Для проведения иммунофенотипической диагностики специально подбираются панели антител, включающих минимум маркеров (CD), позволяющих идентифицировать определенный тип лейкоза. Однако в некоторых ситуациях — БФЛ, лейкозы с коэкспрессией миелоидных/лимфоидных антигенов — для безошибочного определения линейной принадлежности бластов необходимо дополнять панель соответствующими маркерами.

Особенно незаменимым метод иммунофенотипирования признан в диагностике острых лейкозов. Он активно применяется для выявления таких вариантов ОМЛ как острый миелобластный лейкоз с минимальной дифференцировкой (М₀), острый эритромиелоз (М₆) и острый мегакариобластный лейкоз (М₇), а также абсолютно необходим в дифференциации всех трех вариантов ОЛЛ.

Важно отметить роль ИФТ в установлении нозологической формы заболевания для назначения оптимального лечения конкретного пациента, определении изменения иммунофенотипа опухоли на фоне лечения, а также выявлении прогностических рисков, хотя с учетом растущих возможностей современной полихимиотерапии последняя задача представляется весьма неоднозначной [3].