Реакции с участием меченых антигенов или антител

Реакции основаны на использовании меченых иммунореагентов. Помечены могут быть антигены, антитела или антиглобулиновая сыворотка. В качестве метки используют флюоресцентные красители (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные соединения (ИЭМ).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция Кунса. Это метод экспресс-диагностики. Для постановки РИФ применяются иммунные сыворотки, меченные флюорохромными красителями, например, изоти-оцианатом флюоресцеина. Флюорохромы вступают в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их специфичности.

Прямой метод РИФ. Из исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена (например, холерного вибриона), готовят препарат-мазок и обрабатывают его флюоресцирующей сывороткой, содержащей антитела к данному антигену (в нашем случае — противохолерной сывороткой). При микроскопии в люминесцентном микроскопе наблюдают светящиеся микробы.

Недостатком прямого метода РИФ является необходимость иметь большой набор флюоресцирующих сывороток против каждого антигена.

Непрямой метод РИФ. Препарат-мазок обрабатывают иммунной кроличьей антисывороткой к антигену (противохолерной кроличьей сывороткой), а затем — флюоресцирующей антиглобулиновой сывороткой, содержащей антитела против глобулинов кролика. Затем наблюдают в люминесцентном микроскопе светящиеся микробы.

При использовании этого метода можно иметь одну флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Как и другие реакции иммунитета, ИФА используется 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена (рис. 20). Первый этап — адсорбция специфических антител на твердой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей.

Второй этап — добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого луночки промывают.

Третий этап — добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. В качестве фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антнген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилдиамин в смеси с Н₂О₂ в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, интенсивность которой позволяет количественно определить результаты опыта фотометрированием.

2) Обнаружение антител (рис. 21). Первый этап — адсорбция специфических антигенов на стенках лунки. Обычно в коммерческих системах антигены уже адсорбированы на поверхности твердой фазы — в лунках или на пластиковых шариках.

Второй этап — добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.

Третий этап — после отмывания лунок добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.

Результаты реакции учитывают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Разрабатываются «безреагентные» системы для ИФА, в которых все компоненты реакции соединены с поверхностью полимера. Для проведения анализа необходимо внести исследуемый материал и наблюдать изменение окраски.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

Иммуноблоттинг — это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА. Методом электрофореза в геле, содержащем ферменты, разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека.

Лечебные и профилактические препараты Вакцины Иммунобиологические медицинские лечебные и профилактические препараты служат для профилактики и лечения больных инфекционными заболеваниями путем создания искусственного иммунитета.

Вакцины — препараты, содержащие антигены и предназначенные для создания в организме искусственного активного иммунитета.

Введение

вакцины в организм называют вакцинацией. Вакцины применяют чаще для профилактики, реже — для лечения.

В зависимости от природы антигена, который они содержат, вакцины разделяют на живые, убитые, химические, анатоксины, ассоциированные.

Вакцины и анатоксины с уменьшенной дозировкой антигена (БЦЖ-м, АД-м и другие) применяют для вакцинации и ревакцинации при наличии противопоказаний к прививкам полной дозой антигена.

Вакцины против одной инфекции называют моновакцинами, против двух, трех, нескольких — соответственно дивакцинами, тривакцинами, поливакцинами.

Поливалентными называют вакцины, содержащие несколько серологических вариантов возбудителей одного вида, например, противогриппозные вакцины типов, А и В.

Живые вакцины готовят из живых микроорганизмов, вирулентность которых ослаблена, а иммуногенные свойства сохранены. Научные основы получения вакцинных штаммов разработал Л. Пастер, установив возможность искусственного ослабления вирулентности патогенных микробов.

Для получения вакцинных штаммов применялись разные способы.

• 1) Выращивание на питательных средах, неблагоприятных для роста и размножения возбудителя. Так, французские микробиологи А. Кальметт и Г. Герен получили вакцинный штамм микобактерий туберкулеза (БЦЖ) путем культивирования возбудителей на питательной среде, содержащей желчь.
• 2) Пассажи возбудителя через организм животных Таким способом Л. Пастер получил вакцину против бешенства. Многократные пассажи привели к тому, что вирус адаптировался к организму кролика, возросла его вирулентность для кроликов и снизилась вирулентность для человека.
• 3) Отбор естественных культур микроорганизмов, маловирулентных для человека. Так были получены вакцины против чумы, бруцеллеза, туляремии, полиомиелита и др.

Живые вакцины имеют ряд преимуществ по сравнению с убитыми вакцинами. Размножение в организме человека вакцинного штамма микробов приводит к развитию вакцинальной инфекции — доброкачественно протекающего процесса, приводящего к формированию специфического иммунитета. Живые вакцины вводятся более простыми способами (перорально, интраназально, накожно, внутрикожно) и, как правило, однократно. Благодаря способности вакцинного штамма размножаться в организме и оказывать длительное антигенное воздействие создается напряженный, стойкий иммунитет.

Для сохранения стабильности живые вакцины выпускают в виде лиофилизированных препаратов. Хранить их следует в холодильнике, при температуре 4°-8°С в течение всего срока хранения, а также при транспортировке вакцин. В противном случае жизнеспособность вакцинного штамма может быть утеряна, и прививки не дадут нужного эффекта.

При проведении прививок живыми вакцинами соблюдаются определенные правила. За один-два дня до введения вакцины и в течение недели после вакцинации не следует применять антимикробные препараты, иммунные сыворотки, иммуноглобулины. Для введения вакцины нельзя употреблять горячие инстументы. Вскрытую ампулу употреблять немедленно или в течение 2−3 часов; защищать от солнечных лучей и нагревания. Кожу обрабатывать летучими веществами, например, спиртом, и вакцину вводить после его испарения; не применять с этой целью йод, карболовую кислоту и другие соединения, которые задерживаются на коже. Оставшуюся неиспользованной или забракованную вакцину не выливать, а предварительно убить. Местную реакцию на введение вакцины не лечить антибактериальными средствами.

Живые вакцины не рекомендуется применять при иммунодефицит-ных состояниях (например, при лучевой болезни), на фоне которых вакцинные штаммы могут вызвать инфекционные осложнения.

Живые вакцины применяются для профилактики следующих заболеваний: туберкулез, чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, корь, оспа, паротит, полиомиелит, желтая лихорадка.

Убитые (инактивированные) вакцины содержат бактерии, вирусы, инактивированные прогреванием, УФ-лучами, формалином, фенолом, спиртом. Для получения убитых вакцин используют штаммы, полноценные по иммуногенности. Инактивацию проводят так, чтобы надежно убить микробы, не повредив антигенных свойств.

Заболевания, для профилактики которых применяют убитые вакцины: лептоспироз, коклюш, грипп, бешенство, клещевой энцефалит.

Прививки убитыми вакцинами проводятся двукратно или троекратно; иммунитет менее продолжительный.

Вакцинотерапия. Вакцины из убитых микробов применяются для лечения больных хроническими вялотекущими инфекционными заболеваниями, такими, как бруцеллез, хроническая дизентерия, хроническая гонорея, хронический рецидивирующий герпес, хронические стафилококковые инфекции. Лечебный эффект при этом связан со стимуляцией фагоцитоза и иммунного ответа.

Лечение вакцинами проводится индивидуально, под врачебным наблюдением, так как вакцинотерапия нередко вызывает обострение инфекционного процесса.

В некоторых случаях для лечения применяют аутовакцины, которые приготавливают из бактерий, выделенных от самого пациента.

Химические вакцины содержат извлеченные из микробных клеток и из вирусов антигены, обладающие протективным (защитным) действием. Таким образом, в отличие от живых и убитых вакцин, являющихся корпускулярными, химические вакцины не содержат микробных клеток или цельных вирионов. Их можно назвать молекулярнодисперсными.

Преимуществом химических вакцин является то, что они не содержат балластных веществ, они менее реактогенны, то есть вызывают меньше побочных реакций.

Примеры химических вакцин: брюшнотифозная — содержит О-антиген; холерная (О-антиген); менингококковая — содержит полисахаридный антиген; сыпнотифозная — содержит поверхностный растворимый антиген из риккетсий Провацека. Вирусные субъединичные (расщепленные) вакцины содержат наиболее иммуноленные антшены вирусов. Например, гриппозная вакцина (АГХ) содержит гемагглютинин и нейраминидазу.

Химические вакцины для повышения иммуногенности адсорбируют на адъюванте (гидроксиде алюминия). Адъювант укрупняет антп-генные частицы, замедляет резорбцию антигена, удлиняя ею действие. Кроме того, адъювант является неспецифическим стимулятором иммунного ответа.

Анатоксины — препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, лишенных ядовитых свойств, но сохранившие иммуногеные свойства. Метод получения анатоксинов предложил в 1923 г. французский ученый Г. Рамон. Для приготовления анатоксина к экзотоксину прибавляют 0,3−0,4% формалина и выдерживают при температуре 37−40°С в течение 3−4 недель до полного исчезновения токсических свойств.

Анатоксины выпускают в виде нагивных препаратов или в виде очищенных адсорбированных на адъювантах концентрированных препаратов.

Анатоксины применяют для создания искусственного активного антитоксического иммунитета. Применяются анатоксины, стафилококковый нативный и очищенный адсорбированный, холероген-анатоксин; адсорбированный дифтерийный (АД, АД-м), дйфтерийно-столбнячный (АДС, АДС-м), трианатоксин (ботулинический типов А, В, Е), тетра-анатоксин (ботулинический типов А, В, Е и столбнячный).

Ассоциированные вакцины содержат антигены, разные по своей природе. Адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС) содержит инактивированную коклюшную вакцину, дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидроксиде алюминия.

Вакцины новых поколений. Это вакцины будущего, некоторые из них уже применяются.

• 1) Искусственные вакцины, составленные из детерминантных групп антигенов, соединенных с белком-носителем.
• 2) Генноинженерные вакцины. Методами генетической инженерии гены, ответственные за синтез антигена, встраиваются в геном бактерий, дрожжей, вирусов. Создана вакцина, содержащая антигены вируса гепатита В, продуцируемые рекомбинантными клетками дрожжей; готовится генноинженерная вакцина против ВИЧ-инфекции из антигенов вируса, продуцируемых рекомбинантными штаммами Е. coli; вакцина из антигенов ВИЧ в составе вируса осповакцины.
• 3) Разрабатывается метод получения вакцин на основе антиидиотипических антител, то есть антител, специфичных к иммуноглобулину. Например, антитела против антитоксина могут иммунизировать животное или человека подобно токсину (или анатоксину).

Вакцины вводят накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, интраназально, перорально, ингаляционно. Для массовых прививок применяют безыгольную инъекцию с помощью автоматов пистолетного типа, а также пероральное введение вакцины и ингаляционный способ.

Система вакцинации для профилактики инфекционных болезней среди населения регламентируется календарем прививок, в котором определено проведение обязательных прививок для каждого возраста и прививок по показаниям.

При введении вакцин могут возникать местные и общие реакции. Общая реакция: повышение температуры до 38°-39°С, недомогание, головная боль. Эти симптомы обычно проходят через 1−3 дня после прививки. Местно через 1−2 дня на месте инъекции могут появиться покраснение и инфильтрация. Некоторые живые вакцины — оспенная, туляремийная, БЦЖ при внутрикожном введении вызывают характерные кожные реакции, что свидетельствует о положительном результате прививки.

Основные противопоказания к применению вакцин: острые инфекционные заболевания, активная форма туберкулеза, нарушение сердечной деятельности, функции печени, почек, эндокринные расстройства, аллергия, заболевания центральной нервной системы. Для каждой вакцины существует подробный перечень противопоказаний, приведенный в инструкции. В случае эпидемии или при угрожающих жизни показаниях (укус бешеным животным, случаи чумы) необходимо прививать и лиц с противопоказаниями, но под специальным медицинским наблюдением.