Количественное определение белка в биоматериалах рефрактометрическим и спектрофотометрическим методами

Количественное определение белка в биоматериалах рефрактометрическим и спектрофотометрическим методами

Клинико-биохимический анализ обычно начинается с определения содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови, что во многом обусловлено той многообразной и важной физиологической ролью, которую играют белки плазмы в организме. Благодаря им поддерживается вязкость, текучесть крови, формируется ее объем в сосудистом русле. Белки плазмы осуществляют транспорт многочисленных экзои эндогенных веществ, участвуя в связывании гормонов (кортизола и др.), минеральных компонентов (кальция, железа, меди и др.), липидов (неэстерифицированных жирных кислот) и других биологически важных соединений [1].

Содержание общего белка в сыворотке крови можно характеризовать понятиями «нормо-», «гипер-» и «гипопротеинемия», под которым подразумеваются состояния, сопровождающиеся нормальной (не выходящей за пределы физиологических колебаний), повышенной и пониженной его концентрацией в крови [2].

В норме содержания общего белка в сыворотке крови составляет 60−80г/л, на долю альбуминов приходится в среднем 35−55г/л, а на глобулины 30−40г/л. Изменение уровня общего белка, т. е. гипои гиперпротеинемии, могут быть как абсолютными, так и относительными [1].

При подавляющем большинстве заболеваний внутренних органов, сопровождающихся сдвигами в белковом обмене обнаруживается гипопротеинемия.

Абсолютная гипопротеинемия выявляется при патофизиологических синдромах, выражающихся в снижении биосинтеза, усилении катаболизма, аномальных потерях белка. Абсолютную гипопротеинемию, возникшую, как правило, из-за снижения альбумина, обуславливают:

• — недостаточное поступление белка с пищей вследствие голодания, недоедания, сужения пищевода (из-за ожога, опухоли, нарушении целостности и функции желудочно-кишечного тракта).
• — подавление протеинсинтетической функции печени, наблюдаемое при паренхиматозных гепатитах, циррозах печени, а также интоксикациях, обусловленных длительными нагноительными процессами.
• — повышенный распад белка в организме, вызванной потребностью в возмещении больших энергетических затрат, связанных с интенсивной физической нагрузкой.
• — потеря белка организмом с кровью при острых и хронических кровотечениях и др.

Относительная гипопротеинемия может быть обусловлена обильным вливанием раствора глюкозы и других физиологических жидкостей, а также анурией, приводящей к уменьшению концентрации белка вследствие увеличения объема жидкой части крови.

Абсолютная гиперпротеинемия-сравнительно редкое явление. Обычно вызывается усилением биосинтеза гамма-глобулинов в клеточных элементах системы фагоцитирующих мононуклеаров при длительных хронических воспалительных процессах.

Относительная гиперпротеинемия чаще всего расценивается как признак обезвоживания организма (нередко отмечается у больных с хирургическими заболеваниями).

Гипопротеинемия почти всегда связана с гипоальбуминемией, тогда как гиперпротеинемия с гиперглобулинемией [1].

Важное диагностическое значение имеет определение общего белка сыворотки крови. Одним из более простых являются рефрактометрический и колориметрический методы определения общего белка в сыворотке крови, более достоверным — спектрофотометрический.

В связи с этим целью наших исследований явилось определение общего содержания белка в сыворотке крови различных возрастных групп рефрактометрическим и спектрофотометрическим методами.

Материалы и методы исследования. Принцип рефрактометрического метода основан на способности белковых частиц преломлять луч света. Степень рефракции зависит от концентрации веществ в растворе, физического состояния растворенных частиц, природы веществ, длины волны света, температуры (рекомендована C). Оборудование: рефрактометр ИРФ-454 Б2М.

Спектрофотометрический метод основан на выполнении измерений в видимой и ультрафиолетовой области длин волн электромагнитного спектра. Оборудование: спектрофотометр UNICO модель 2802(S)UV/VIS, длина волны 550 нм, кювета 10 мл. Реактивы: биуретовый реактив. Принцип основан на том, что в щелочной среде ионы меди образуют с белками комплексы фиолетового цвета. Интенсивность развивающего окрашивания прямо пропорционально концентрации белка в растворе. Объект исследования: сыворотка крови детей (n=3) в возрасте 9−11 лет и взрослых 16−17 лет. Рефрактометрическое исследование проведено в биохимической лаборатории кафедры химии, спектрофотометрический в лаборатории нутрициологии и экологии НИИ Комплексных проблем АГУ.

Результаты и их обсуждение. Пробы сыворотки крови исследованы рефрактометрическим методом в пяти повторностях. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Табл. 1 Результаты определения белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом (n=5).

Как видно из таблицы, содержание общего белка в пробе № 1 превышает норму на 12, 3%, а в остальных пробах соответствуют нормальным значениям.

Эти же пробы одновременно исследованы спектрофотометрическим методом. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Табл.2 Результаты определения белка в сыворотке крови спектрофотометрическим методом, М±m, при n=3.

Как видно из таблицы, содержание общего белка в пробах сыворотки крови № 2 и № 3, определенное как рефрактометрическим методом, так и спектрофотометрическим методом практически совпали, однако, содержание белка в пробе № 1 определенное спектрофотометрическим методом ниже данных, полученных рефрактометрическим, и оказалась в пределах нормы, а в пробах № 4 и 5, наоборот, содержание белка ниже данных полученных рефрактометрическим методом. Полученные результаты показывают, что наряду с такими достоинствами, как простота, быстрота и дешевизна рефрактометрический метод имеет недостатки, связанные с завышением результатов исследования.

белок плазма кровь биохимический.

• 1. Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т.1. — МН.: Беларусь, 2000. — 495 с.: ил.
• 2. Комов В. П. Биохимия: Учебник для вузовМ.: Дрофа, 2004. — 640 с.: ил. — (Высшее образование: современный учебник).
• 3. Кучеренко Н. Е. Биохимия: Учебник для вузовМ.: Дрофа, 1990. — 433с.: ил.
• 4. Биохимия: Учебник/ Под редакцией чл. — корр. РАН, проф. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР — Медиа, 2008. — 768 с.: ил.
• 5. Специфические белки в клинической лабораторной диагностике: вопросы и ответы. — Тёпфер Г., Тома Р., Цавта Б., М., 2004. — 96с.