Динамическое исследование тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов

Актуальность исследования.

С 1960;х годов в России внедряется трансфузионная доктрина использования не столько цельной консервированной донорской крови, сколько ее дериватов, т. е. компонентов и препаратов крови, дефицитных при заболеваниях человека: эритроцитной, тромбоцитной, лейкоцитной масс, плазмы или белковых фракций [12, 33, 40]. Нередко для лечения одного пациента нужны трансфузионные среды от нескольких доноров. Поэтому донорство крови и ее компонентов — вопрос национальной безопасности и сохранения здоровья общества.

Уровень участия населения в донорском движении — это универсальный социальный индикатор развития общества и значимости в нем человеческих ценностей. Необходимо помнить о том, что развитие идей донорства будет способствовать укреплению гуманизма и взаимопонимания в нашем обществе [18]. Главным остается донорство, а в нем — добрая воля человека, готового поделиться своей кровью. Вопрос сохранения и увеличения донорских кадров является ключевым.

Взятие от донора крови и ее компонентов допустимо только при условии, если здоровью донора не будет причинен вред" [14]. Особенно актуальным это требование становится при заготовке компонентов с малым сроком хранения, в частности, тромбоцитных концентратов (ТК). Получить монодорский ТК, — высококачественный продукт, с максимальной концентрацией тромбоцитов и с минимальной контаминацией лейкоцитами и эритроцитами — можно или на рефрижераторных центрифугах 3-х кратным тромбоцитафезом (ТЦА) в строенные пластикатные закрытые контейнеры или посредством аппаратного афереза, когда при помощи сепаратора крови от одного донора заготавливается в среднем 8 доз ТК. Оптимизация режимов донорского ТЦА с получением высокодозных ТК с одной стороны способствует улучшению трансфузиологического обеспечения больных, с 6 другой — создает условия для воплощения принципа «один донор — один реципиент», т. е. становится основой уменьшения риска аллосенсибилизации и передачи гемотрансмиссивных инфекций [6]. Поэтому приоритетным становится использование методов автоматического (аппаратного) афереза, которые позволяют получать терапевтические дозы компонента в закрытой (замкнутой) системе от одного донора [16, 47]. Вместе с тем, данные о влиянии процедур ТЦА, особенно с использованием сепараторов клеток крови, на здоровье доноров продолжают быть противоречивыми. Эффекты ТЦА на тромбоцитопоэз в костном мозге доноров не изучены. Даже при убедительном доказательстве отсутствия отрицательного влияния интенсивного ТЦА на основные показатели гемограммы, гемостаза, белкового состава, иммуноглобулинов и обмена железа [4], детальная оценка эффективности тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов все еще остается необходимой. Самое первостепенное, это определение исходного уровня и морфофункциональных параметров тромбоцитов в крови донора перед донацией. Обычный набор лабораторных параметров в этом отношении недостаточен.

Тромбоциты периферической крови являются производными полиплоидных мегакариоцитов костного мозга. Они, как и эритроциты, -уникальный пример предельной специализации клетки, функционирующей в отсутствии ядра [36]. Тромбоциты выполняют ангиотрофическую и адгезивно-агрегационную функции, участвуют в процессах свертывания и фибринолиза, обеспечивают ретракцию кровяного сгустка, способны переносить на своей мембране циркулирующие иммунные комплексы и поддерживать спазм сосудов. Дисковидные по форме эти клетки имеют диаметр от 2 до 5 мкм, а их толщина колеблется от 0,5 до 0,75 мкм. Разнообразие циркулирующих в периферической крови тромбоцитов определяется скоростью продукции, оборота, активации и удаления этих клеток [85]. Среди них принято выделять пять морфологических групп [19]: юные с диаметром 5−5,5 мкм (3,2%), зрелые — 1,5−3 мкм (87%), старые — 0,515 мкм (4,5%), макроформы — > 5 мкм (2,8%) и формы раздражения (2,5%). Интересно, что юные, незрелые тромбоциты гемостатически более активны, инициируют образование тромба, уменьшаясь в числе на дальнейших стадиях его формирования [120].

Связь активации костномозгового тромбоцитопоэза с увеличением количества незрелых тромбоцитов в периферической крови подтверждается и в клинике, и в эксперименте [80, 104, 101, 113−114, 116, 124]. Считается, что, отражая реакцию костного мозга на запрос организма, увеличение объема фракции незрелых тромбоцитов является ранним индикатором потребления кровяных пластинок [60]. Можно предположить, что реализация резервов тромбоцитопоэза за счет незрелых тромбоцитов представляет своего рода адаптацию, которая в случае необходимости компенсирует потребленные или разрушенные тромбоциты. Поэтому большинство исследователей в настоящее время к тромбопоэтическим индексам, наряду с концентрацией тромбопоэтина, относят параметр «Фракция незрелых тромбоцитов», по которому можно судить о состоянии тромбоцитопоэза [61, 63].

Современные гематологические анализаторы, обеспечивая воспроизводимость всех известных тромбоцитарных параметров, на базе избирательной окраски РНК и проточной цитофлуориметрии оценивают еще и фракцию незрелых тромбоцитов. Эти клетки содержат РНК и окрашиваются флуорохромами. В частности, фракция незрелых тромбоцитов (IPF, %) на анализаторе «Sysmex ХЕ-2100» (Sysmex, Kobe, Japan) определяется по специальной программе «IPF Master». Параметр выражается как % от общего количества тромбоцитов (IPF,%), так и в абсолютных л значениях (IPFxlO /л). На основании анализа фракции незрелых тромбоцитов при относительной тромбоцитопении после ТЦА Stohlawetz et al. (1998) пришли к выводу о возможности мониторинга тромбопоэтической активности костного мозга у кадровых доноров тромбоцитов [118].

Следует учесть также, что незрелые тромбоциты — крупные клетки. Интересно, что крупные тромбоциты отличаются от остальных большим содержанием полисахаридов [111]. В этой связи тест на гликоген, то есть результаты микроскопии продукта Periodic Acid-Schiff (PAS) цитохимической реакции может дополнить параметр IPF при оценке степени зрелости тромбоцитов.

Таким образом, современная оценка морфофункциональных характеристик тромбоцитов периферической крови доноров актуальна и позволяет получить адекватную информацию о влиянии тромбоцитафереза на тромбоцитопоэз.

Цель исследования.

Оценить содержание незрелых тромбоцитов как индикаторов активности тромбоцитопоэза в периферической крови доноров до и после процедур тромбоцитафереза.

Задачи исследования.

1. Определить влияние процедур тромбоцитафереза на количество тромбоцитов, циркулирующих в крови доноров.

2. Провести анализ содержания незрелых тромбоцитов в периферической крови первичных и кадровых доноров до и после проведения процедур Зх-кратного и аппаратного тромбоцитафереза.

3. Определить эффективность идентификации незрелых тромбоцитов с помощью проточной цитофлуориметрии и посредством PAS-цитохимической реакции на полисахариды.

4. Уточнить характер взаимосвязи между количеством незрелых тромбоцитов в периферической крови первичных и кадровых доноров и показателями индуцированной агрегации тромбоцитов до и после процедур тромбоцитафереза. 9

Научная новизна

Впервые по совокупности морфоцитохимических характеристик тромбоцитов периферической крови практически здоровых людей (доноров тромбоцитов), изучены реакции организма на процедуры тромбоцитафереза. На основании чего дана оценка влияний тромбоцитафереза и определена эффективность использования параметра «фракция незрелых тромбоцитов» при анализе тромбоцитопоэза у доноров.

Практическая и научная ценность.

Установленный в диссертации факт того, что происходящая у первичных доноров адаптация тромбоцитопоэза, закрепляется у кадровых доноров и в течение двух недель «отдыха донора» надежно компенсирует потребности организма в тромбоцитах, служит базой оптимизации режимов донорского тромбоцитафереза с получением тромбоцитных концентратов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Относительная тромбоцитопения после тромбоцитафереза как у первичных, так и у кадровых доноров функционально компенсируется незрелыми тромбоцитами.

2. Повышенные значения параметра «Фракция незрелых тромбоцитов» можно рассматривать как результат регенераторного ответа организма доноров на процедуру тромбоцитафереза.

3. Как цитофлуорометрия, так и анализ микроскопических изображений незрелых тромбоцитов (РАБ-реакция) демонстрируют адаптированность доноров к донации тромбоцитов по установленным в России нормативам.

Апробация диссертации.

Диссертация апробирована на заседании проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ «Клинические исследования в гематологии (гемобластозы,

10 депрессии кроветворенияТКМмиелои лимфопролиферативные заболеванияопухоли лимфатической системыпатология красной кровиИТПпорфирии)" 21.05.2012 г.

Материалы работы представлены на IV научно-практической конференции с международным участием «Лабораторное обеспечение стандартов медицинской помощи» (Москва, 29−30 марта 2010 г.), III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 13−14 мая 2010 г.), научно-практической конференции «Проблемы заместительной терапии концентратами тромбоцитов» (Москва, 19 октября 2010 г.), конгрессе гематологов России (Москва, 2−4- июля 2012 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 1 в зарубежном издании, из них 10 в рецензируемых ВАК.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 114 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 22 рисунка и 12 таблиц. Список цитируемой литературы включает 128 источников, 54 из них — отечественных авторов и 74- зарубежных.

выводы

1. Оценка параметра «Фракция незрелых тромбоцитов» у доноров, проходящих процедуры тромбоцитафереза по установленным в России нормативам (1 раз в 14 дней, при отсутствии противопоказаний, но не более 10 процедур в год) демонстрирует адаптацию кроветворения к дотациям, которая функционально компенсирует изъятые тромбоциты.

2. Как у первичных, так и у кадровых доноров, при проведении процедур тромбоцитафереза, количество циркулирующих тромбоцитов снижается, причем наиболее выражено после аппаратного афереза.

3. Статистически значимое (р =0,05) по сравнению с собственным контролем увеличение объема фракции незрелых тромбоцитов у первичных доноров возникает в динамике выполнения тромбоцитаферезау кадровых повышенные значения параметра сохраняются в течения 14 дней отдыха между дотациями тромбоцитов, снижаясь после процедуры афереза.

4. Анализ микроскопических изображений тромбоцитов, окрашенных на полисахариды (PAS-реакция), дополняя более дорогой метод проточной цитофлуориметрии, является эффективным методом исследования незрелых форм этих клеток.

5. Повышение агрегационной способности тромбоцитов кадровых доноров с агонистами in vitro объясняется повышенным содержанием в их крови функционально активных незрелых клеток.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С 1960;х годов в России внедряется трансфузионная доктрина использования не столько цельной консервированной донорской крови, сколько ее дериватов, т. е. компонентов и препаратов крови, дефицитных при заболеваниях человека: эритроцитной, тромбоцитной, лейкоцитной масс, плазмы или белковых фракций [12−33−40].

Взятие от донора крови и ее компонентов допустимо только при условии, если здоровью донора не будет причинен вред" [14]. Это требование стало неукоснительным при заготовке компонентов с малым сроком хранения, в частности, тромбоцитных концентратов. Получить монодонорский ТК, — высококачественный продукт, с максимальной концентрацией тромбоцитов и с минимальной примесью лейкоцитов — можно из крови одного донора с помощью 3-х кратного ТЦА или посредством аппаратного афереза при помощи сепараторов крови [39]. Последнее считается приоритетным [14,49]. Потребности в ТК постоянно растут. В свете чего, актуальна этическая проблема здоровья доноров, регулярно проходящих процедуру тромбоцитафереза. Даже при доказательстве отсутствия отрицательного влияния интенсивного ТЦА на основные показатели гемограммы, гемостаза, белкового состава, иммуноглобулинов и обмена железа [4], оценка эффективности тромбоцитопоэза у доноров тромбоцитов все еще необходима. Обычный набор лабораторных параметров в этом отношении недостаточен.

Большинство исследователей в настоящее время к тромбопоэтическим индексам, наряду с концентрацией тромбопоэтина, относят ретикулярные (только в 2009 году так они названы в 168 статьях РиЬМес!) или незрелые тромбоциты (в 51 статье РиЬМес!), по которым можно судить о состоянии тромбоцитопоэза, как и по ретикулоцитам — о состоянии эритроцитопоэза [61,63].

Жизненный цикл мегакариоцита, костномозгового предшественника тромбоцитов, в среднем занимает 10 суток [26]. Период созревания тромбоцита длится около 8 суток, ежедневная продукция составляет приблизительно 40×103/мл крови, а средняя продолжительность пребывания в кровотоке — 9−11 суток. В циркуляции, занимая центральное или пристеночное положение, находится около 67% клеток (2/3 пула, тогда как 1/3 — в депо), причем ежедневно разрушается 30−40% (7×109/л), из них 5% вследствие старения. Фракцию незрелых тромбоцитов (IPF) современные гематологические анализаторы, среди которых «Sysmex ХЕ-2100» (Sysmex, Kobe, Japan), обеспечивая воспроизводимость всех известных, тромбоцитарных параметров, оценивают на базе избирательной окраски РНК и проточной цитофлуориметрии. Эти клетки содержат РНК и окрашиваются флуорохромами [84]. Параметр выражается как % от общего количества л тромбоцитов (IPF,%), так и в абсолютных значениях (IPFxlO /мкл) и является индексом скорости продукции тромбоцитов костным мозгом [85].

Конечно, анализируются и другие параметры, но среди них средний объем тромбоцитов (MPV) хотя и считается адекватным для контроля появления в крови крупных тромбоцитов, но не нашел применения: масса тромбоцитов варьирует в пределах широкого интервала значений общего количества этих клеток и референсные значения показателя должны быть выражены функцией от концентрации тромбоцитов. В свою очередь параметр P-LCR (доля клеток с объемом больше 12 fl) диагностически ценен только в случае иммунной тромбоцитопении [87]. Кроме того, соли ЭДТА быстро переводят дисковидные тромбоциты в сфероиды, поэтому при кондуктометрии значения параметра в пределах 30 мин увеличиваются на 7,9%, а после 24 ч. — на 13,4%- при оптической флуоресценции они уменьшаются на 10% [61]. Агрегация тромбоцитов может исказить значения индекса P-LCR,%.

Считается, что незрелые тромбоциты — достаточно крупные клетки. Интересно, что крупные тромбоциты отличаются от остальных большим содержанием полисахаридов [73]. В этой связи тест на гликоген, то есть PeriodicAcid-Schiff (PAS) цитохимическая реакция, может дополнить параметр IPF. Интересно также и то, что незрелые тромбоциты, выполняя ангиотрофическую и адгезивно-агрегационную функции, участвуя в процессах свертывания и фибринолиза, и обеспечивая ретракцию кровяного сгустка, гемостатически более активны [120].

В настоящей работе мы сравнили количество тромбоцитов и значения IPF (%) в контроле и у доноров, при получении ТК из цельной крови путем поэтапного фракционирования и посредством процедур аппаратного афереза. Сравниваемые параметры проанализированы у первичных доноров и у доноров, сдающих тромбоциты каждые две недели в течение от 2 до 5 лет. Исходя из полученных данных, можно предположить, что за счет фракции незрелых тромбоцитов происходит реализация резервов тромбоцитопоэза и в промежутках между донациями у доноров компенсирует изъятые тромбоциты.

Действительно, в начале процедур ни первичные, ни кадровые доноры не отличались от контроля по количеству циркулирующих тромбоцитов. В динамике ТЦА как у тех, так и у других количество тромбоцитов снизилось, клинически незначимо, но наиболее выражено по окончанию аппаратного афереза. При этом, если во время Зх-кратного ТЦА у первичных доноров подъем значений параметра IPF был выявлен, начиная с забора второго контейнера, то у кадровых, не взирая на способ получения ТК, его высокие по сравнению с контролем значения сохранялись на момент последующей процедуры, в среднем через две недели после донации.

Мало что известно о влиянии долгосрочных процедур тромбоцитафереза на здоровье доноров. Lazarus et al. (2001) на основании материала обследования 939 доноров в течение 4 лет первыми сообщили о том, что регулярные ТЦА могут привести к снижению количества тромбоцитов, циркулирующих в их крови [93]. Другие авторы [77] отметили, что процедура деплеции тромбоцитов может способствовать активации тромбоцитопоэза и восстановлению тромбокрита в течение буквально нескольких дней. Попытавшись в качестве индикатора тромбоцитопоэза подсчитать ретикулярные тромбоциты в сравнительном исследовании эффектов тромбоцитафереза у первичных доноров и доноров, проходящих процедуры ТЦА каждые две недели в течение 18 месяцев, Stohlawetz et al. (1998) [118] пришли к выводу о возможности мониторинга тромбопоэтической активности костного мозга с помощью этого показателя. У первичных доноров медиана показателя начинала увеличиваться с третьего дня после афереза, а ее возврат к исходному значению происходил на четвертый день. Напротив, у кадровых доноров устойчивый, но менее выраженный прирост ретикулярных тромбоцитов наблюдался с первого по четвертый день, а средние значения показателя были достоверно ниже, чем у первичных доноров. Статистически значимых различий по общему числу циркулирующих в периферической крови тромбоцитов в сравниваемых группах обнаружено не было. По мнению авторов, многократные и частые донации тромбоцитов могут привести к относительному истощению тромбоцитопоэза.

Интересно, что средняя величина IPF в группе наших кадровых доноров, которым проводился аппаратный ТЦА, превышая контроль на 14 день после очередного афереза, сразу же после проведения процедуры значимо снижалась.

Ответ тромбоцитопоэза на современные возможности извлечения тромбоцитов был также исследован Gyongyossy-Issa (2001) [76]. Оценка количества ретикулярных тромбоцитов в периферической крови доноров до и после проведения ТЦА позволила авторам предположить, что пик значений показателя на второй день после процедуры и последующая циркуляция незрелых клеток в течение семи дней, скорее всего, связаны с их выходом из селезеночного депо.

В этой связи, стойкое увеличение фракции незрелых тромбоцитов в периферической крови наших кадровых доноров, подвергающихся регулярным ТЦА, не исключая возможности выхода незрелых клеток из депо, мы склонны объяснить адаптацией кроветворения к частым донациям.

Измененная морфология тромбоцитов позволила Bessis (1972) [59] в свое время связать появление в периферической крови крупных незрелых кровяных пластинок с регенеративным ответом костного мозга и форсированным тромбоцитопоэзом. Интересно, что сравнение полученных в нашей работе данных оценки IPF у доноров с литературными сведениями о концентрации тромбопоэтина в динамике ТЦА показало аналогичную тенденцию изменений указанных параметров (Табл.12).

При повышенном потреблении тромбоцитов Kern et al. (2000) допускают возможность реализации резервов тромбоцитопоэза путем отшнуровки их незрелых форм непосредственно от мегакариоцитов, минуя стадию протромбоцитов (левый адаптационный сдвиг) [91]. Сейчас известно, что физическая нагрузка, связанная с эмоциональными напряжениями, вызывает значительные сдвиги в составе крови: в процессе активной двигательной деятельности возможны травмы с последующим кровотечением. Программируя «с опережением» такую ситуацию, организм повышает защитную функцию системы свертывания крови. Показано, что у спортсменов 16−18 лет после напряженной мышечной работы в