Исследование фибриллогенеза коллагена типа I in vitro

Фибриллогенез коллагена in vivo представляет собой сложный, многоэтапный процесс. Сначала синтезируется предшественник коллагенапроколлаген. После отщепления ферментами пропептидов проколлаген превращается в коллаген и секретируется из клеток. Самосборка молекул коллагена в фибриллы происходит на поверхности клеток. Коллагеновые фибриллы собираются в волокна во внеклеточном пространстве.

Коллаген является основным структурным элементом внеклеточного матрикса. В настоящее время известно 26 генетически различных типов коллагена. Коллаген типа I входит в состав фибрилл и волокон большинства соединительных тканей. Нарушения в упаковке молекул коллагена типа I приводят к таким заболеваниям соединительных тканей, как остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др. Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл, что является следствием пониженного синтеза молекул коллагена типа III и протеогликанов, регулирующих упаковку и размеры коллагеновых волокон. При мышечной дистрофии степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой.

Упорядоченная структура коллагеновых фибрилл типа I формируется в процессе эмбриогенеза на начальных стадиях морфогенеза. В процессе тканеобразования клетки передвигаются вдоль коллагеновых фибрилл. Коллагеновые фибриллы типа I интенсивно образуются после ожогов и при заживлении ран.

Для фибрилл коллагена типа I установлена высокая степень упорядоченности в продольном направлении и найдено, что характерная периодичность структуры фибрилл по их длине определяется линейным типом упаковки молекул. До настоящего времени слабо изучена упаковка коллагеновых молекул в поперечном направлении фибрилл, а следовательно, не установлена структура фибрилл в трехмерном пространстве.

Упаковка молекул коллагена в фибриллы in vivo определяется достаточно большим числом участвующих в этом процессе компонентов, а также большим числом регулирующих факторов. Поиск условий образования фибрилл, адекватных фибриллогенезу коллагена in vivo, проводится уже в течение ~ 50 лет. Одним из подходов к изучению фибриллогенеза коллагена может быть создание систем фибриллогенеза in vitro в условиях, близких к условиям in vivo. Согласно литературным данным систем самосборки in vitro, параметры которых близки к параметрам in vivo, создано мало (Holmes, 2001; Christiansen, 2000). Выявление параметров образования фибрилл, определяющих функциональное состояние и упаковку фибрилл, позволит приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза in vivo.

Нахождение условий фибриллогенеза, влияющих на плотность упаковки фибрилл, дает возможность получать нативные коллагеновые фибриллы in vitro с регулируемыми свойствами. При создании биоматериалов требуется высокая степень упорядоченности и стабильности коллагеновых фибрилл, чтобы в течение длительного времени сохранялась их устойчивость к действию протеолитических ферментов. Образование коллагеновых фибрилл в комплексе с другими молекулами соединительных тканей представляет важную задачу биотехнологического направления.

Цель и задачи исследования

Фибриллогенез коллагена сложно исследовать, так как нативная структура фибрилл формируется при физиологических температурах, близких к температуре денатурации молекул. In vitro определен ряд параметров самосборки коллагеновых молекул и найдено небольшое число макромолекул внеклеточного матрикса, влияющих на фибриллогенез коллагена. Однако размеры фибрилл in vitro значительно превышают размеры фибрилл in vivo, что вызвано более низкой плотностью упаковки молекул по сравнению с упаковкой молекул in vivo. Целью данной работы является исследование фибриллогенеза коллагена типа I в условиях, приближенных к физиологическим условиям. Для поиска параметров, характеризующих фибриллогенез коллагена in vitro, использованы принципы построения фазовой диаграммы. Решались следующие задачи:

1. Выяснить влияние температуры на кинетику образования коллагеновых фибрилл.

2. Определить термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл при разных значениях температуры и концентрации молекул.

3. Установить вклад гликозаминогликанов в формирование термостабильных и устойчивых к протеолизу фибрилл.

4. Оценить возможности метода калориметрии для изучения структуры коллагеновых фибрилл, образованных in vitro.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. Оптимизация методов получения высокоочищенного коллагена типа I и оптимизация условий фибриллогенеза коллагена позволяет формировать фибриллы с плотной упаковкой молекул.

2. Выявлена степень влияния температуры на фибриллогенез коллагена типа I с целыми и удаленными телопептидами. Установлено, что при физиологической температуре 35 °C значительно увеличивается скорость образования фибрилл. Для коллагена с телопептидами величины энтропии, энтальпии перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное при температуре 30 °C максимальны, а при физиологической температуре 35 °C минимальны.

3. Определено, что варьированием температуры и концентрации коллагеновых молекул можно регулировать процесс фибриллогенеза in vitro: скорость образования фибрилл и плотность упаковки фибрилл. В условиях, приближенных к физиологическим, возрастает степень упорядоченной упаковки молекул в фибриллах и увеличивается длина кооперативных участков в фибриллах.

4. Подобраны условия для связывания коллагена с хондроитин-4-сульфатом в трехмерную структуру коллагенового геля. Установлено, что образование комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом в геле приводит к повышению термостабильности фибрилл и их устойчивости к действию коллагеназы.

5. Показано, что метод калориметрии достаточно адекватен, чтобы следить за формированием структуры фибрилл с повышенной плотностью упаковки молекул в трехмерном геле при создании биоматериалов с целью применения их в практической медицине.

Благодарности:

Ю.А. Рочеву — научному руководителю Н. Н. Хечинашвили — научному консультанту Б. К. Гаврилюку — заведующему лабораторией.

Е.И. Тиктопуло, Н. Г. Есиповой, Р. В. Полозову, Ю. А. Лазареву — за обсуждение работы и ценные замечания.

А.И. Писаченко, И. И. Селезнёвой, С. В. Кузьмину, Ю. Ю. Скарге,.

А.Г. Погорелову, М. Д. Шпагиной — сотрудникам лаборатории и института, принимавших участие в проведении экспериментов Л. П. Долгачевой, В. А. Печатникову, Л. Ф. Куньевой, A.M. Аксирову, Ф. Э. Ильясову — за техническую помощь в работе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Николаева Т. И., Ееипова Н. Г. Связь ростовых свойств коллагенов с их физико-химическими характеристиками. Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции «Культивирование клеток животных и человека», 1985, Пущино, с. 55.

2. Файзутдинова Р. Н., Николаева Т. И. Роль коллагенового геля в адгезии и росте клеток. Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции «Культивирование клеток животных и человека», 1985, Пущино, с. 54.

3. Рочев Ю. А., Николаева Т. И., Кузьмин С. В. Агрегация клеток на коллагеновых подложках. Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции «Культивирование клеток животных и человека», 1985, Пущино, с.52−53.

4. Гаврилюк Б. К., Рочев Ю. А., Николаева Т. И. «Культура клеток и реконструкция ткани (на примере кожи)». 1988, ОНТИ НЦБИ, Пущино, 123с.

5. Гаврилюк Б. К., Рочев Ю. А., Николаева Т. И. Культура клеток в реконструкции ткани. Материалы III Всесоюзной конференции «Культивирование клеток животных и человека», 1992, Пущино, с.24−31.

6. Николаева Т. И., Рочев Ю. А., Гаврилюк Б. К. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл в процессе их образования. Биофизика, 1995, т.40, с.478−479.

7. Гаврилюк Б. К., Николаева Т. И., Рочев Ю. А., Рябоконь П. П., Селезнева И. И. Коллагеновые гели, хондроитин-4-сульфат, устойчивость к протеолизу. Биофизика, 1995, т.40, с.1356−1357.

8. Селезнева И. И., Кузьмин С. В., Николаева Т. И., Рочев Ю. А. Применение поляризационной термомикроскопии для регистрации процессов формирования и деградации коллагеновых фибрилл. Биофизика, 1996, т.41, с.541−542.

9. Николаева Т. И., Писаченко А. И., Рочев Ю. А., Гаврилюк Б. К. Анализ самосборки молекул коллагена типа I в фибриллы. Тезисы докладов II съезда биофизиков России, 1999, с.66−67.

10. Николаева Т. И., Писаченко А. И., Селезнева И. И., Рочев Ю. А., Гаврилюк Б. К. Изучение самосборки молекул коллагена типа I с удаленными телопептидами. Биофизика, 2000, т.45, № 6, с. 1146−1149.

11. Николаева Т. И., Писаченко А. И., Полозов Р. В., Рочев Ю. А., Гаврилюк Б. К. Исследование образования фибрилл коллагена типа I in vitro. Биофизика,.

2001, т.46, № 4, с.612−618.

12. Николаева Т. И. Изучение упаковки фибрилл коллагена типа I. Тезисы докладов на конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям», 2001, Пущино, с. 84.

13. Николаева Т. И., Полозов Р. В., Рочев Ю. А. Исследование упаковки фибрилл коллагена типа I. Тезисы докладов III съезда биохимического общества,.

2002, СанктПетербург, с. 505−506.

14. Селезнева И. И., Николаева Т. И., Давыдова Г. А., Ковалева М. А., Чайлахян Т. А., Чайлахян JI.M., Гаврилюк Б. К. Матрикс на основе коллагена типа I и хондроитин-4-сульфата: устойчивость к протеолизу, взаимодействие с культурами эмбриональных стволовых клеток. Тезисы докладов семинара-презентации научно-технических проектов «Биотехнология-2003», Пущино, 24−25 ноября, с. 32.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Одним из направлений в изучении фибриллогенеза in vitro может быть поиск условий образования фибрилл, содержащих возможно меньшее число параметров самосборки молекул и в то же время правильно отражающих основные свойства фибриллогенеза in vivo. В настоящей работе показано, что при физиологических значениях температуры, рН и ионной силы формируются фибриллы с плотной упаковкой молекул. До нашей работы существовало представление о структуре фибрилл с низкой плотностью упаковки молекул, которые были образованы при физиологических температурах и низких концентрациях коллагена.

Главным результатом выполненной работы следует считать то, что температурой и концентрацией коллагеновых молекул можно регулировать как скорость процесса фибриллогенеза, так и плотность упаковки фибрилл.

Трудность в исследованиях фибриллогенеза коллагена связана с быстрым процессом самосборки молекул в условиях, близких к физиологическим. С помощью метода калориметрии можно исследовать структурное состояние фибрилл на начальных этапах их образования и можно проводить поиск существенных параметров фибриллогенеза. Выбор таких факторов образования фибрилл, как температура, концентрация и время, позволит формировать структуру фибрилл in vitro более близкой по структуре к биологической.