Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами

Актуальность темы

Яды змей семейства Elapidae — сложная смесь биологически активных полипептидов, которая включает нейротоксины, цитотоксины, фосфолипазы и другие биологически активные компоненты. Нейротоксины взаимодействуют с ацетилхолиновыми рецепторами, блокируя передачу нервного импульса. Цитотоксины гомологичны ней-ротоксинам по аминокислотной последовательности и пространственной структуре, но отличаются широким спектром биологической активности.

Различные представители семейства цитотоксинов способны усиливать сердцебиение при низких концентрациях и вызывать остановку сердца при высоких концентрациях (за что они получили другое название кардиотоксины), вызывать деполяризацию мышечных клеток. В больших концентрациях цитотоксины вызывают лизис фосфолипид-ных везикул и клеточных мембран, дестабилизируют структуру липид-ного бислоя, вызывают межмембранное смешивание липидов. Цитотоксины способны связываться с гепарином, который способствует проникновению цитотоксинов в мембрану. Цитотоксины обладают повышенной токсичностью по отношению к раковым клеткам. Большинство исследованных цитотоксинов вызывают гибель клеток по механизму цитолиза, за исключением цитотоксина III Naja atra, для которого показана апоптотическая активность по отношению к клеткам лейкемии человека К562, клеткам рака кишечника Со1о205, а так же CD8+ лимфоцитам человека. Считается перспективным создание противораковых средств на основе природных или модифицированных цитотоксинов.

Цитотоксины представляют собой /^-структурные амфифильные од-ноцепочечные белки длиной 59−62 аминокислотных остатка и массой 6−7 кДа. В настоящий момент известны аминокислотные последовательности 81 цитотоксина из яда змей рода Naja, из них только для 11 цитотоксинов проводились структурные исследования и получена пространственная структура методом ЯМР или рентгеноструктурного анализа. Все известные цитотоксины имеют высокую степень гомологии по аминокислотной последовательности и пространственной структуре. Пространственная структура цитотоксинов включает два /?-слоя по два и три ß—тяжа в каждом, а так же три функционально важных «петли» цитотокси-на. Структура стабилизирована четырьмя консервативными дисульфид-ными связями. Небольшие различия в аминокислотной последовательности и пространственном строении трех петель цитотоксинов определяют различие в спектре их биологической активности.

В настоящий момент не представляет сомнений, что биологическое действие цитотоксинов на клетку включает взаимодействие с липидной мембраной, в частности, с плазматической мембраной клетки. Изучение структуры и функции мембранных белков наталкивается на целый ряд методических трудностей. Мембраносвязанный белок не дает спектра ЯМР высокого разрешения и не может быть закристаллизован, что затрудняет использование стандартных методик определения пространственной структуры белка. Один из путей преодоления данной трудности — использование детергентных мицелл, как систем моделирующих мембранное окружение. Вследствие меньшей молекулярной массы детергент-ные мицеллы позволяют наблюдать спектр ЯМР высокого разрешения и во многих случаях делают возможным расчет пространственной структуры белка.

Несмотря на наличие соответствующих методик, в настоящий момент детали взаимодействия цитотоксинов с липидными мембранами недостаточно изучены и вызывают разногласия между различными группами исследователей. Пространственная структура в комплексе с мицеллой получена только для одного цитотоксина, это структура цитотокси-на II из яда Naja oxiatia, все остальные структуры получены в водном растворе (методом ЯМР) или в кристалле (методом рентгеноструктур-ного анализа). За исключением того же цитотоксина II не изучено влияние липидного окружения на пространственную структуру цитотоксинов, недостает прямых данных об участках цитотоксинов, вовлеченных в непосредственное взаимодействие с мембраной/мицеллой. Различные исследователи предполагают существование функционально важных комплексов из нескольких молекул цитотоксина на поверхности мембраны, однако прямых подтверждений существования таких комплексов в мем-бранах/детергентных мицеллах в настоящий момент не получено.

Цель исследования. Данная работа ставит целью комплексное изучение двух цитотоксинов из яда кобры Naja oxiana: цитотоксинов I и II методами ЯМР и ЭПР спектроскопии. Данная цель подразумевает:

1. Получение пространственной структуры цитотоксина I из яда Naja oxiana в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ методом ЯМР высокого разрешения.

2. Измерение рКа боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков, анализ влияния липидного окружения на структуру и свойства заряженных аминокислотных остатков цитотоксина I.

3. Изучение взаимодействия цитотоксинов с мицеллой/липидной мембраной. Мониторинг связывания цитотоксинов с мицеллой методом ЯМР и с липидной мембраной методом ЭПР с использованием спин-меченого аналога цитотоксина II.

Методы исследования. В работе применяются методы гомоядерной одномерной и двумерной ]Н ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Для моделирования мембранного окружения при расчете структуры цитотоксина I использованы дейтерированные мицеллы додецилфосфа-тидилхолина (ДФХ). Отнесение сигналов белка производится методом последовательного отнесения сигналов, водородные связи выделяются на основе скоростей дейтерообмена амидных протонов. Ограничения на торсионные углы определяются из значений констант спин-спинового взаимодействия. Связанная молекула воды идентифицируется при помощи NOESY и ROESY спектроскопии, ее наличие проверяется методом молекулярной динамики в явно заданном растворителе. Структура белка рассчитывается на основе ограничений, полученных из двумерных NOESY спектров белка и констант спин-спинового взаимодействия минимизацией штрафной функции в программе CYANA.

Константы рКа депротонирования боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков определяются по изменению химических сдвигов в двумерных спектрах ЯМР.

Взаимодействие цитотоксинов с мицеллой ДФХ изучается мониторингом химических сдвигов в двумерных спектрах белка и коэффициента трансляционной диффузии белка методом градиентного спин-эха. Для анализа полученных данных разрабатывается оригинальная математическая модель, которая позволяет одновременно анализировать изменения химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белок/мицеллярного комплекса.

Взаимодействие цитотоксина II с модельной липидной мембраной изучается методом ЭПР спектроскопии с использованием спин-меченого аналога цитотоксина. Кривая связывания с липидной мембраной анализируется в рамках модели Гуи-Чапмена.

Основные задачи исследования.

1. Получить гомоядерные 'Н-ЯМР спектры высокого разрешения, произвести полное отнесение сигналов и рассчитать пространственную структуру цитотоксина I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, моделирующей мембранное окружение;

2. Провести титрование цитотоксинов I и II в диапазоне рН 2.0−7.0 и определить рКа отрицательно заряженных ионогенных групп цитотоксинов и изменения химических сдвигов Ад близлежащих атомов для обоих цитотоксинов в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ;

3. Проанализировать связывание цитотоксинов с мицеллой ДФХ по данным об изменении химических сдвигов и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов для различного соотношения белок/детергент. Выявить наличие/отсутствие кооперативное&tradeсвязывания молекул цитотоксина, определить количество молекул цитотоксина, способных связаться с мицеллой и оценить константу связывания.

4. Изучить связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с липидной мембраной методом ЭПР. Получить кривую связывания, проанализировать в рамках модели Гуи-Чапмена и определить константу связывания и эффективный заряд цитотоксина. Сравнить данные, полученные для взаимодействия с мембраной с данными по взаимодействию с мицеллой ДФХ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Все результаты, изложенные в настоящей работе, получены впервые.

1. Получена структура высокого разрешения для цитотоксина I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Обнаружена связанная молекула воды в составе второй петли цитотоксина I в водном растворе. Показано, что при связывании с мицеллой ДФХ происходит сильное изменение структуры второй петли цитотоксина. Факт существенного изменения структуры цитотоксина при связывании с мицеллой показан для цитотоксинов впервые.

2. Анализ рН—зависимостей химических сдвигов цитотоксина I показал высокую консервативность свойств заряженных остатков Азр40 и АБр57 и выявил особую роль остатка Азр29 в конформации второй петли молекулы.

3. По данным об изменении химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии построена модель связывания токсинов с мицеллой. Согласно данной модели цитотоксины связываются с мицеллой ДФХ антикооперативно, что говорит против формирования комплекса из нескольких молекул токсина. Константа связывания первой молекулы с мицеллой согласуется с константой связывания спин-меченого цитотоксина с липидным бислоем. Показано, что для корректного описания диффузионных данных необходимо учесть вытеснение части детергента из состава мицеллы при связывании молекулы цитотоксина.

4. Изучено связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с модельной липидной мембраной, кривая связывания описана моделью Гуи-Чапмена и определена константа связывания цитотоксина с липидной мембраной.

Разработанные в настоящей диссертации методики представляют самостоятельный интерес и могут быть применены к исследованию других мембраносвязывающихся белков. Модель динамического равновесия в системе белок-мицелла может быть использована при анализе ЯМР данных для определения количества молекул белка, связанного с мицеллой, выявления кооперативности/антикооперативности связывания белков с мицеллой, а так же для оценки объема белка, погруженного в мицеллу через способность белка вытеснять часть детергента при связывании с мицеллой. Несмотря на то, что изменение химических сдвигов и трансляционной диффузии традиционно используются при изучения формирования белок/белковых и белок/лигандных комплексов, изучение формирования комплекса белка с мицеллой на основе аналогичных данных является новым подходом.

Основные результаты работы опубликованы в реферируемых журналах [1,2,3,4,5,6] и тезисах конференций [7,8,9,10].

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав включая литературный обзор, заключения, выводов и списка литературы.

Выводы.

1. Методом ЯМР высокого разрешения рассчитана пространственная структура цитотоксина I Naja oxiana в двух средах: в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Структуры депонированы в Банк Белковых Структур (PDB) с кодом 1RL5 (в водном растворе) и IZAD (в комплексе с мицеллой ДФХ).

2. Показано наличие связанной воды в петле II цитотоксина в водном растворе и ее отсутствие в комплексе с мицеллой ДФХ. Установлено значительное изменение конформации функционально важной петли II при переходе цитотоксина из водного раствора в липидное окружение.

3. Изучены pH-зависимости химических сдвигов цитотоксина I. Показано, что наблюдаемые изменения химических сдвигов и констант рКа, a так же их изменение при переходе из раствора в мицеллу находятся в согласии с полученными пространственными структурами, системой водородных связей и принятой моделью расположения цитотоксина на поверхности липидной мембраны.

4. Предложена математическая модель для описания химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белка при связывании с мицеллой.

5. На примере цитотоксинов I и II Naja oxiana показано, что совместный анализ химических сдвигов и коэффициента трансляционной диффузии позволяет оценить кооперативность/антикооперативность связывания белка с мицеллой, эффект вытеснения детергента из мицеллы и ожидаемую константу связывания белка с липидной мембраной.

6. При помощи спин-меченого аналога цитотоксина II Naja oxiana изучено связывание цитотоксина с липидной мембраной. Оценены значения эффективного заряда и константы связывания цитотоксина с мембраной. Последняя величина находится в согласии с константой, полученной при анализе связывания белка с мицеллой детергента.

7. На примере двух цитотоксинов из яда Naja oxiana продемонстрирована связь структуры и функции для данного класса белков.

Заключение

.

В первой части настоящей работы всесторонне изучена структура ЦТ I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, моделирующей мембранное окружение. Во второй петле цитотоксина обнаружена прочно связанная долгоживущая молекула воды, которая стабилизирует структуру петли II цитотоксина при помощи четырех водородных связей. Подобная структура второй петли характерна для большинства изученных цитотоксинов. Отличительной особенностью ЦТ I является «потеря» связанной воды при переходе в липидное окружение мицеллы ДФХ. Это является первым отличием от изученной ранее структуры ЦТ II [55,56]. Данное различие связано с уникальным для ЦТ I остатком Asp29, который изменяет свою конформацию, чтобы избежать неблагоприятного контакта с гидрофобным окружением мицеллы.

Неожиданным для данного цитотоксина является его связывание с мицеллой всеми тремя функциональными петлями, так как предварительные расчеты методом Монте-Карло предсказывали связывание только одной петлей цитотоксина [90]. Данное расхождение было связано с тем, что в моделировании использовалась структура цитотоксина I из яда Naja atra, полученная без учета молекулы связанной воды во второй петле. Моделирование связывания с мембраной с использованием структуры ЦТ I (PDB код 1RL5) показало [5], что ЦТ I связывается с мембраной всеми тремя петлями, хотя и с меньшим значением свободной энергии.

Анализ ионогенных групп цитотоксина I, проведенный во второй части данной работы, находится в согласии с полученными структурными данными. Остатки аспарагиновых кислот Asp40 и Asp57 присутствуют во всех цитотоксинах и стабилизируют структуру водородными связями и благоприятными электростатическими взаимодействиями. Остаток Asp29 уникален для ЦТ I. Под его влиянием структура второй петли претерпевает сильные конформационные изменения при связывании с мицеллой ДФХ. По-видимому, именно Asp29 ответственен за то, что константа связывания ЦТ I с мицеллой ДФХ на порядок меньше константы связывания ЦТ II, как установлено в третьем разделе данной представленной работы. Это второе обнаруженное отличие от цитоток-сина II, которое так же проявляет себя в меньшей цитотоксичности ЦТ I по отношению к различным группам клеток [4].

Заряженный остаток Glul6 так же отличает ЦТ I от ЦТ II, однако присутствует во многих других аминокислотных последовательностях цитотоксинов, например, в цитотоксине А5 из Naja atra, который способен связываться с aV?3 интегрином. Здесь можно выдвинуть гипотезу, что аминокислотная последовательность EGK (Glu-Gly-Lys), которая присутствует во всех цитотоксинах, содержащих остаток Glul6, является «перевернутым» RGD-мотивом, который не был обнаружен в интегрин-связывающем цитотоксине А5. Данная гипотеза требует дополнительной теоретической и экспериментальной проверки.

Метод анализа трансляционной диффузии и химического сдвига белков, разработанный в третьей части настоящей работы, является довольно сложным математическим построением. Метод учитывает сразу три явления, которые раньше никогда не рассматривались одновременно: эффект вытесненного объема, изменение размера мицеллы и изменение константы связывания белка с мицеллой. Наградой за сложность модели является не только хорошее согласие измеренных параметров с экспериментом (см. рис. 11), но и разумные значения свободных параметров модели. В частности, полученное значение константы связывания цито-токсина II с мицеллой хорошо согласуется с константой связывания токсина с липидным бислоем, измеренной в четвертой части работы. Параметр модели р > 2.5 говорит об антикооперативности связывания молекул обоих токсинов с мицеллой детергента, что опровергает гипотезу формирование комплексов из нескольких молекул цитотоксина в мицелле, по крайней мере для ЦТ I и ЦТ II Naja oxiana. Параметр ДМ характеризует вытеснение детергента связавшимся токсином и при определенных оговорках может служить мерой погруженности белка в мицеллярное окружение.

Таким образом методическая часть настоящей работы эффективно дополняет проведенные структурные исследования.