Синтез и оценка биологической активности новых производных и аналогов глицирризиновой кислоты

Актуальность работы. Проблема создания новых лекарственных средств для лечения и профилактики вирусных инфекций и иммунодефицитов различной этиологии, по-прежнему, является одной из важнейших задач медицины, фармации и медицинской химии по причине все более широкого распространения ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов В и С, герпетических инфекций и появлением новых вирусных респираторных инфекций, таких как атипичная пневмония (SARS), «куриный» грипп и др. Поэтому среди наиболее интенсивно разрабатываемых в последние годы лекарственных средств противовирусные препараты выдвинулись на одно из первых мест.

Арсенал эффективных противовирусных препаратов, обладающих этиотропным и/или иммунокоррегирующим эффектом, разрешенных, к применению в медицине, пока невелик и их можно разделить на три основные группы по химическому составу, механизму действия, спектру активности и длительности клинического эффекта: ингибиторы вирусных ферментов, интерфероны и их индукторы и иммуномодуляторы. Для лечения вирусных гепатитов в течение последних 20 лет базовыми препаратами являются интерфероны, причем интерфероновая терапия эффективна в 30−40% случаев [38,39]. Для лечения ВИЧ-инфекции применяются в основном ингибиторы протеазы и обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ, такие как азидотимидин (зидовудин), ламивудин, ставудин, апренавир, индинавир, ритонавир и др. ингибиторы репликации ВИЧ нуклеозидной структуры [60,100,163]. Основной проблемой при монотерапии аналогами нуклеозидов является развитие резистентности к этим препаратам, лечение ВИЧ-инфекции азидотимидином приводит к появлению мутантных форм вируса [163].

Новым подходом является поиск противовирусных средств нового поколения, с новым механизмом, действия среди природных соединений, получаемых из доступного растительного сырья, и их модификантов.

С природными веществами в настоящее время связано около 30% мирового фармацевтического рынка с ежегодным оборотом 50 млрд. долларов.

154]. Стоимость этих препаратов намного ниже, чем у известных нуклеозидных противовирусных препаратов, а значит, доступность для широких масс населения выше. Все большее распространение в качестве лекарственных средств получают различные модификанты и аналоги природных соединений, обладающие более высокой активностью по сравнению с нативными веществами.

К числу природных соединений, представляющих большую ценность для медицины в качестве основы для создания новых высокоэффективных препаратов для лечения и/или профилактики вирусных инфекций и иммунодефицитов различной этиологии можно отнести глицирризиновую кислоту (ГК) — основной тритерпеновый сапонин экстракта корней солодки голой (Glycyrrhyza glabra L.) и уральской (Gl. uralensis Fisher), распространенных на территории Западной Сибири, Южного Урала, Средней Азии, Афганистана, Восточного Китая, Монголии, Испании и др. стран. ГК и ее моноаммонийная соль — глицирам полностью ингибируют in vitro репродукцию ряда ДНК и РНК-вирусов (Vaccinia, New Castle, Vesicular stomatitus, Herpes simplex, Herpes В, Varicella zoster) [23]. ГК является одним из лидирующих природных соединений, пригодных для терапии ВИЧ-инфекции. Уникальным свойством ГК является новый механизм действия на ВИЧ: гликозид солодки действует уже на ранних этапах репликационного цикла вируса, препятствуя стадии адсорбции вируса клеткой. ГК является первым природным соединением, наиболее эффективно ингибирующим репликацию новых коронавирусов, вызывающих атипичную пневмонию (SARS). ГК является объектом многочисленных исследований зарубежных фармацевтических компаний и научно-исследовательских центров в Китае, Японии, Корее, Италии, Испании, Германии, США, Польши и других стран. На основе ГК в Японии разработан и успешно применяется в виде внутривенных вливаний препарат SNMC (Stronger Neo-Minophagen Со.) для лечения хронических вирусных гепатитов В и С и цирроза печени. Россия в настоящее время не располагает высокоэффективными отечественными противовирусными препаратами, полученными на основе ГК, кроме препарата глицирам, разрешенного к применению в качестве противовоспалительного средства. Однако, инъекционные формы глицирама, подобные препарату SNMC, еще не разработаны.

В Институте органической химии Уфимского научного центра РАН на основе ГК синтезирован новый препарат — ниглизин, полусинтетическое производное ГК, эффективный в отношении АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ. Ниглизин является в настоящее время первым кандидатом, полученным на основе модификанта природного гликозида, который рекомендован в качестве ингибитора ВИЧ в комплексной терапии СПИДа. Препарат проходит расширенные предклинические исследования в Государственном Научном Центре Вирусологии и Биотехнологии «Вектор».

Молекулярные механизмы большинства видов биологической активности ГК и ее модификантов еще не полностью изучены и исследования зависимости структура — иммунотропная или противовирусная активность в мире практически не проводились. Для таких исследований предпочтительны синтетические подходы, позволяющие получать структурно близкие соединения. Поэтому поиск новых высокоэффективных противовирусных и иммунотропных агентов среди производных и модифицированных аналогов доступных природных гликозидов является одной из актуальных задач в области создания новых лекарственных препаратов.

Настоящая работа является развитием цикла исследований, связанных с синтезом новых биологически активных веществ и разработкой высокоэффективных лекарственных средств на основе ГК и родственных соединений.

Цель работы. Синтез новых биологически активных веществ на основе ГК и родственных соединений, исследование их физико-химических свойств, поиск новых иммуностимуляторов и противовирусных агентов в ряду производных и аналогов ГК.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: 1) разработать новый способ получения моноаммонийной соли ГК из корней солодки уральской- 2) разработать методы синтеза новых азотсодержащих производных и аналогов ГК (гликопептидов, тритерпеновых коньюгатов с аминосахарами, азотсодержащих гетероциклов) — 3) осуществить синтез новых сложных эфиров тритерпеновых гликозидов — аналогов ГК- 4) разработать новый метод синтеза тритерпеновых З-О-гликозидов- 5) провести первичную оценку иммунотропной и противовирусной активности (анти-ВИЧ-1, a. wm-SARS CoV) новых соединений.

Научная новизна работы. Предложен новый патентно чистый способ получения моноаммонийной соли ГК (глицирама) и ГК из корней солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisher) российского происхождения.

1 13.

Методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения Н (600 МГц) и С (150 МГц) проведено полное отнесение сигналов протонов в спектрах ГК, ее моноаммонийной соли и триметилового эфира.

Разработан селективный метод синтеза коньюгатов ГК с аминокислотами и дипептидами (гликопептидов), базирующийся на активации карбоксильных групп ГК с помощью Л^'-дициклогексилкарбодиимида-ТУ-гидроксисукцинимида. Впервые синтезированы гликопептиды ГК, содержащие по два остатка аминокислот, дипептидов и их эфиров в углеводной части молекулы ГК, в том числе L-цистеин илизинсодержащие. Разработан улучшенный способ синтеза тритерпеновых коньюгатов с D-глюкозамином и лактозамином — модифицированных аналогов ГК. Впервые синтезированы гетероциклические пиразольные производные ГК и эфиры 18а-ГК и софорозидного аналога ГК. Разработан новый метод получения тритерпеновых З-О-гликозидов — аналогов ГК с использованием в качестве активатора монобромида иода.

Впервые изучена противовирусная активность новых производных ГК в отношении ЗЛДО-ассоциированных коронавирусов (SARS CoV), вызывающих атипичную пневмонию.

Практическая значимость. Синтезировано и охарактеризовано 80 новых соединений — производных и аналогов ГК, среди которых найдены перспективные стимуляторы гуморального иммунного ответа, анти-ВИЧ-1 и анти-SARS-CoV агенты, имеющие ряд преимуществ перед известными фармакологическими аналогами и природным гликозидом. Гликопептиды ГК с метиловым эфиром L-валина и L-пролином рекомендованы к углубленным фармакологическим исследованиям в качестве стимуляторов гуморального иммунного ответа. Коньюгаты ГК с (8-бензил)-Ь-цистеином, диметиловым эфиром L-аспарагиновой кислоты и глицил-Ь-фенилаланином представляют интерес для медицины в качестве высокоактивных анти-ВИЧ-1 агентов, менее токсичных по сравнению с известным анти-ВИЧ препаратом азидотимидином. Выявлен ряд закономерностей зависимости структура-противовирусная (анти-ВИЧ- 1, анти-З^Л? Со V) активность в ряду синтезированных соединений.

Получены опытные образцы высокоочищенного глицирама и ГК, разработана инъекционная форма глицирама, обладающая анти-ВИЧ-1 активностью.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на IV Международном симпозиуме по фармацевтической химии (Стамбул, Турция, 2003) — XVIII Международном симпозиуме по медицинской химии (Коппенгаген, ДанияМальмо, Швеция, 2004) — 2-ой Международной конференции по природным продуктам и физиологически активным веществам (Новосибирск, 2004) — 2-й Международном совещании по медицинской и фармацевтической химии (Анталия, Турция, 2004) — Совместном международном Европейском совещании по медицинской химии (Вена, Австрия, 2005) — V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005) — 14-м Европейском симпозиуме по органической химии (Хельсинки, Финляндия, 2005) — XIII.

Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006) — Международном симпозиуме по химии, биологии и медицине (Пафос, Кипр, 2006) — XIX Международном симпозиуме по медицинской химии (Стамбул, Турция, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 6 статей в центральных и международных журналах, 10 тезисов докладов на конференциях и симпозиумах, получено положительное решение на выдачу патента РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ получения моноаммонийной соли ГК из корней солодки уральской.

2. Методы синтеза новых азотсодержащих производных и модифицированных аналогов ГК (гликопептидов, пиразолов, тритерпеновых коньюгатов с аминосахарами).

3. Методы синтеза новых эфиров 18а-ГК и софорозидного аналога ГК.

4. Метод синтеза модельных тритерпеновых З-О-моногликозидованалогов ГК.

5. Структуры впервые синтезированных соединений, установленные на основе спектральных данных.

6. Результаты испытаний биологической активности синтезированных соединений и некоторые закономерности зависимости «структура-противовирусная активность».

Объем и структура и диссертации. Диссертационная работа изложена на 192 стр. и состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 268 наименований. В приложение включены акты испытаний, ВЭЖ-хроматограммы и ЯМР спектры.

ВЫВОДЫ.

1. Осуществлен синтез новых групп биологически активных азотсодержащих производных и аналогов ГК (гликопептидов, пиразолов, коньюгатов тритерпеновых кислот с аминосахарами), представляющих интерес для медицины в качестве потенциальных иммуностимуляторов и анти-ВИЧ-1 агентов.

2. Разработан селективный метод синтеза гликопептидов ГК, содержащих фрагменты аминокислот и их эфиров в углеводной части молекулы, основанный на активации карбоксильных групп ГК с помощью N-гидроксисукцинимида-Ы, Ы'-дициклогексилкарбодиимида.

3. Предложен улучшенный метод синтеза тритерпеновых конъюгатов а-D-глюкозамина и /WD-лактозамина — модифицированных аналогов ГК в присутствии М, 1чР-дициклогексилкарбодиимида — N-гидроксибензотриазола. Впервые синтезированы азотсодержащие гетероциклы (пиразолы) на основе дигидразида ГК и новые сложные эфиры 18сс-ГК и /?-софорозида ГЛК.

4. Разработан новый способ получения моноаммонийной соли ГК (глицирама) из российского растительного сырья — корней солодки уральской. Предложена схема получения высокоочищенного глицирама и ГК из промышленной субстанции глицирама и разработана его новая лекарственная (иньекционная) форма, обладающая анти-ВИЧ-1 активностью. Методами.

1 т т.

ЯМР спектроскопии высокого разрешения Н (600 МГц) и С (150 МГц) проведено полное отнесение сигналов в спектрах ГК, ее моноаммонийной соли и триметилового эфира.

5. Среди синтезированных гликопептидов ГК найдены эффективные стимуляторы гуморального иммунного ответа у мышей. Коньюгаты ГК с метиловым эфиром L-валина и L-пролином рекомендованы к углубленным фармакологическим исследованиям.

6. Показано, что химическая модификация ГК путем введения аминокислот и дипептидов в углеводную часть молекулы является перспективным путем получения новых анти-ВИЧ-1 агентов, превосходящих по противовирусной активности природный гликозид. Ряд новых производных ГК обнаружили высокую анти-ВИЧ-1 активность в культуре клеток МТ-4 и более низкую цитотоксичность по сравнению с азидотимидином. Гликопептиды ГК с L-цистеином, диметиловым эфиром L-аспарагиновой кислоты и глицил-Ь-фенилаланином рекомендованы для расширенных биологических исследований в качестве анти-ВИЧ-1 агентов. Найдены соединения, ингибирующие ^/^-ассоциированные коронавирусы в культуре клеток' VERO. Установлены некоторые закономерности зависимости структура-противовирусная активность в ряду новых производных и аналогов ГК.

Автор выражает благодарность своему научному руководителю — академику Толстикову Г. А. за постоянное внимание к данной работед.м.н., проф. Покровскому (ГНЦ ВБ Вектор) за проведение испытаний анти-ВИЧ активности и проф. Синатлу Дж. (Германия) за изучение анти-SARS CoV активности синтезированных соединений.

дегидроглицирретовой кислоты (96). Выход 80,5%> (аморф.). [a]D + 125 ° (с 0,08- МеОН). УФ-спектр, Ятах (МеОН): 280 нм (lg s 4,1). Молекулярный ион [M+NH4+] 646,4. С37Н57О9. М.в. 645,8. Спектр ЯМР 13С приведен в табл. 12.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Разработан новый способ получения моноаммонийной соли ГК (глицирама) из корней солодки уральской российского происхождения. Предложен селективный метод получения новых гликопептидов ГК с использованием N-гидроксисукцинимида — ТЧ^'-дициклогексилкарбодиимида, позволивший синтезировать новые конъюгаты ГК с аминокислотами и дипептидами. Разработан улучшенный метод синтеза коньюгатов тритерпеновых кислот с аминосахарами — модифицированных аналогов ГК. Синтезированы новые гетероциклические (пиразольные) производные ГК. Впервые синтезированы биоактивные эфиры 18а-ГК и софорозида ГЛК. Разработан новый способ гликозилирования тритерпеноидов солодкового корня в присутствии монобромида иода и осуществлен синтез модельных З-О-моногликозидов.

Среди новых гликопептидов ГК найдены эффективные стимуляторы гуморального иммунного ответа у мышей. Установлено, что иммунотропная активность синтезированных производных ГК зависит от структуры аминокомпонента, связанного с углеводной частью ГК, способа введения и дозы. Соединения (11) и (57) представляют интерес для расширенных фармакологических исследований в качестве стимуляторов гуморального иммунного ответа и рекомендованы к углубленным фармакологическим исследованиям.

Показано, что химическая модификация ГК путем селективного введения CONH-связей по СООН группам углеводной цепи и конъюгирования ГК с аминокислотами или дипептидами является перспективным путем получения новых анти-ВИЧ-1 агентов со сниженной цитотоксичностью, превосходящих по индексу селективности и противовирусной активности нативный гликозид. Анти-ВИЧ-1 активность гликопептидов (23), (41) и (61) не уступает активности известного анти-ВИЧ препарата АЗТ по ингибированию вирусспецифического белка р24, в отличие от последнего соединения они менее токсичны для культуры клеток МТ-4. Соединения (23) и (61) превосходят ГК по индексу селективности. Данные производные ГК рекомендованы для расширенных биологических исследований в качестве анти-ВИЧ-1 агентов.

Замена диглюкуронидной цепи ГК на остаток a-D-глюкозамина снижает цитотоксичность и повышает индекс селективности аналогов ГК (коньюгат 74). Замена углеводной цепи ГК на остаток нейтрального дисахарида (гликозид 80) усиливает цитотоксичность тритерпеновых гликозидов. Изменение конфигурации С18 агликона (18а-ГК) приводит к исчезновению анти-ВИЧ-1 активности.

Впервые изучена противовирусная активность производных ГК в отношении ^^-ассоциированных коронавирусов, вызывающих атипичную пневмонию. Выявлены некоторые закономерности наблюдаемого противовирусного эффекта от химической структуры соединений. Установлено, что необходимым условием для проявления данного вида активности является наличие диглюкуронидной цепи, 18/?-конфигурации агликона и свободной ЗО-СООН.