Фармакогностическое и фармакологическое изучение надземной части шалфея сухостепного Salvia tesquicola Klok. et Pobed

Актуальность темы

В современной медицине лекарственные растения продолжают оставаться одним из перспективных источников получения эффективных лекарственных препаратов. Препараты растительного происхождения обладают более мягким действием, менее токсичны и проявляют широкий спектр фармакологического действия (Соколов, Замотаев, 1990).

Различные виды рода шалфей Salvia L. флоры России используются в народной медицине при различных заболеваниях, а S. aethiopis L. и S. officinalis L являются официнальными растениями. Шалфей лекарственный в диком виде на территории России не произрастает, но культивируется в специализированных хозяйствах на юге европейской части страны. Потребности в сырье этого растения удовлетворяются не полностью. Поиск заменителя этого сырья во флоре России достаточно актуален. Изучаемый нами вид — шалфей сухостепной Salvia tesquicola Klok. et Pobed. — распространен в европейской части бывшего СССР, во всех районах Кавказа, в Западной Сибири и в северозападной части Средней Азии, что делает его перспективным в ресурсоведческом отношении.

Несмотря на популярность этого вида шалфея в народной медицине, анализ данных литературы показал, что сведения о химическом составе и биологических свойствах его ограничены. Поэтому фармакогностическое и фармакологическое изучение надземной части шалфея сухостепного представлялось актуальным.

Диссертационная работа выполнена на кафедрах фармакогнозии и фармакологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с научным направлением «Изыскание и изучение биологически активных веществ растительного, микробного и синтетического происхождения» и тематическим планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Исследование лекарственных растений, перспективных для создания фитопрепаратов». Изучение антимикробного действия выполнено на кафедре микробиологии СПХФА под руководством заведующей Лаборатории биотехнологии к.б.н. Л. А. Коссиор, исследования с использованием методов газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии.

Цель и задачи исследования

.

Целью настоящего исследования является фармакогностическое и фармакологическое изучение надземной части шалфея сухостепного. В задачи исследования входило:

1. Проведение общего фитохимического анализа с целью выявления основных групп действующих веществ.

2. Изучение компонентного состава доминирующих групп биологически активных соединений.

3. Определение острой токсичности и фармакологических эффектов сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного в сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного.

4. Изучение антимикробной активности сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного в сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного.

5. Определение нормативов качества изученного сырья и разработка проекта нормативной документации (ФСП) на сырье.

6. Рекогносцировочная ресурсоведческая оценка данного вида. Научная новизна. Из надземной части б*. 1е8цшсо1а были впервые выделены и идентифицированы 4 флавоноидных соединения — гликозиды лютеолина и хризоэриола: цинарозид, сколимозид, 7−0-Б-глюкуронид лютеолина и 7−0-0-глюкуронид хризоэриола. Установлено присутствие в траве шалфея сухостепного водорастворимых полисахаридов, определено их содержание, а также изучен мономерный состав. Определены качественный состав, а также содержание фенольных кислот и аминокислот надземной части шалфея сухостепного. В экспериментах на животных установлено, что сухие водные и спиртовые экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладают низкой токсичностью, выраженными антигипоксическим, противовоспалительным, ранозаживляющим, анальгезирующим и седативным эффектами. В сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного они показали более выраженный антиэкссудативный, иммуномодулирующий и муколитический эффекты. В результате сравнительного изучения антимикробной активности сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного установлено сходство по бактерицидной и бактериостатической активности в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве шалфея сухостепного.

Практическая значимость. Определены характеристики подлинности, показатели качества и их нормативы для сырья шалфея сухостепного. Результаты исследования использованы при разработке проекта ФСП на новый вид лекарственного сырья «Шалфея сухостепного трава», который рекомендуется для внедрения в медицинскую практику в качестве противовоспалительного и антимикробного средства. Составлена карта ареала шалфея сухостепного и проведено определение урожайности в естественных условиях произрастания в Волгоградской области (Жирновский район). Полученная ресурсоведческая характеристика вида свидетельствует об обеспеченности его сырьевой базы.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Компонентный состав основных групп биологически активных соединений: флавоноидов, фенольных кислот, аминокислот и полисахаридов надземной части шалфея сухостепного, а также их количественная оценка.

2. Сравнительная характеристика острой токсичности и фармакологических эффектов сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного.

3. Сравнительная характеристика антимикробной активности сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного.

4. Обоснование методов стандартизации и нормативов качества сырья «Шалфея сухостепного трава».

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на:

• 67-ой научной сессии КГМО отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2002 г.);

• IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002 г.).

• 60-ой Юбилейной открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых Волгоградской медицинской академии: «Медицина в начале нового века: достижения и перспективы» (Волгоград, 2002).

• VI Международном Съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2002).

• VII Международном Съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» ФИТОФАРМ 2003 (Санкт-Петербург — Пушкин, 2003).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 10 научных статьях и тезисах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, иллюстрирована 39 рисунками и 33 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, характеризующей материалы и методы исследованийа также 3 глав.

выводы.

1. В результате общего фитохимического анализа установлены основные группы действующих веществ надземной части Salvia tesquicola Klok. et Pobed., к которым относятся флавоноиды, фенольные кислоты, аминокислоты и полисахариды.

2. Из надземной части S. tesquicola впервые выделены и идентифицированы 4 флавоноидных соединения: 7−0-Р-0-глюкозид лютеолина (цинарозид), 7-О-рутинозид лютеолина (сколимозид), 7-O-D-глюкуронид лютеолина и 7−0-0-глюкуронид хризоэриола. Содержание суммы флавоноидов в фазы бутонизации и цветения является максимальным и составляет более 3,7%.

3. В составе комплекса фенольных кислот надземной части S. tesquicola содержится 10 фенольных кислот, среди которых методами хроматографии на бумаге и ВЭЖХ идентифицировали галловую, гентизиновую, хлорогеновую, ванилиновую, кофейную, сиреневую, вератровую, салициловую, гс-кумаровую и гс-гидроксибензойную кислоты. Установлено, что основными кислотами являются сиреневая, хлорогеновая, кофейная, салициловая и гс-кумаровая кислоты. Общее содержание фенольных кислот составило 4,8% в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

4. Методами хроматографии на бумаге и ВЭЖХ-анализа идентифицированы 18 аминокислот: лейцин, фенилаланин, валин, метионин, тирозин, пролин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, лизин, цистеин, серин, аргинин, треонин, глицин, изолейцин, триптофан и гистидин. Причем, доминирующими являются тирозин, гистидин, пролин и триптофан. Общее содержание аминокислот в надземной части шалфея сухостепного составило 0,12% в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

5. На основании разработанного способа выделения полисахаридного комплекса из надземной части S. tesquicola установлено, что содержание полисахаридов составляет 1,97%. При этом, по органам они распределены неравномерно, в листьях их содержится 3,12%, в стеблях — 0,61%, в цветках — 0,5%. Основными мономерными единицами полисахаридного комплекса являются галактоза, рамноза, арабиноза, глюкоза и глюкуроновая кислота. Полисахариды шалфея сухостепного относятся к классу сложных галактанов, в составе которых присутствуют фрагменты, близкие по структуре к пектиновым веществам.

6. ДЦ5о сухих водных и спиртовых экстрактов из надземной части шалфея сухостепного при внутрибрюшинном введении составляет от 1630+100 до 2820+250 мг/кг, что позволяет считать их малотоксичными.

7. В экспериментах на животных установлено, что сухие водные и спиртовые экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладают выраженными антигипоксическим, противовоспалительным, ранозаживляющим, анальгезирующим и седативным эффектами. В сравнении с экстрактами из листьев шалфея лекарственного экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладают более выраженными антиэкссудативным, иммуномодулирующим и муколитическим эффектами.

8. Установлены минимальные концентрации сухих экстрактов из надземной части шалфея сухостепного и листьев шалфея лекарственного, оказывающие бактерицидное и/или бактериостатическое действие на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы при микробной нагрузке 2000 клеток/мл. Антифунгальная активность экстрактов в отношении Candida albicans не обнаружена.

9. Разработаны методики качественного и количественного анализа суммы флавоноидов травы шалфея сухостепного, установлены основные макрои микроскопические признаки подлинности сырья, а также показатели качества и нормативы для сырья. Результаты исследования использованы при разработке проекта ФСП на сырье «Шалфея сухостепного трава».

10. На основании составленной карты ареала & {еядшсо1а на территории России и сопредельных государств бывшего СССР возможна организация ресурсоведческих исследований по выявлению потенциально продуктивных угодий для организации промышленных заготовок сырья. Урожайность надземной части шалфея сухостепного в естественных условиях произрастания в Жирновском районе Волгоградской области составила 2933,3+372 кг/га в пересчете на воздушно-сухое сырье, а выход воздушно-сухого сырья из свежесобранного составил 30%.

4.10.

Заключение

.

Сравнительное фармакологическое изучение сухих экстрактов (водных и спиртовых) из надземной части шалфея сухостепного S. tesquicola и из листьев шалфея лекарственного S. officinalis позволяют отметить следующее. Все изучаемые экстракты обладали низкой токсичностью, выраженными антигипоксическим, противовоспалительным, ранозаживляющим, анальгезирующим и седативным эффектами. В сравнении с сухими экстрактами из листьев шалфея лекарственного сухие экстракты из надземной части шалфея сухостепного обладали более выраженными антиэкссудативным, иммуномодулирующим и муколитическим эффектами. Сравнительное изучение антимикробной активности сухих экстрактов, полученных на основе водных и спиртовых (70%-ный этанол) извлечений, из надземной части S. tesquicola и из листьев S. officinalis в отношении Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli не выявило у них значительных различий. Не обнаружена бактерицидная активность в отношении Р. aeruginosa у сухого экстракта (водного) из надземной части S. tesquicola. Исследованные сухие экстракты не проявляли антифунгальной активности в отношении тест-культуры Candida albicans. Перспективно дальнейшее изучение экстрактов из надземной части шалфея сухостепного в качестве заменителя препаратов из листьев шалфея лекарственного.

ГЛАВА 5. Разработка методов стандартизации «Шалфея сухостепного трава», составление карты ареала и определение урожайности шалфея сухостепного.

5.1. Разработка методов стандартизации сырья При разработке проекта ФСП на новый вид сырья «Шалфея сухостепного трава» по разделам «Внешние признаки цельного сырья», «Внешние признаки измельченного сырья» и «Микроскопия» проведен макрои микроскопический анализ и выделены диагностические признаки сырья. Для установления нормативов качества сырья по разделу «Числовые показатели» разработана методика количественного определения суммы флавоноидов и определены основных товароведческие показатели.

5.1.1. Морфологические диагностические признаки сырья При анализе образцов сырья шалфея сухостепного, собранных в фазу цветения на территории Волгоградской и Ростовской областей, установлены следующие внешние признаки сырья:

Цельное сырье. Сырье представлено цельными и частично измельченными облиственными цветущими цветоносными стеблями длиной до 40 см, а также листьями, стеблями, цветками и бутонами. Стебель четырехгранный, опушенный. Листья простые, яйцевидно-продолговатые, 3−7 см длиной и 1−3 см шириной, морщинистые, густо опушенныеверхние стеблевые нередко очень широкие, округлые, длинно заостренные на верхушке и крупно острозубчатые по краям. Нижняя поверхность листа мелкоячеистая из-за густой сети мелких жилок, среди которых выделяют 3−4 крупные боковые жилки. Прицветные листья длинно заостренные, но нередко встречаются округлые, с коротким заострением, по краям длинно белореснитчатые, длиннее чашечки, фиолетовые, редко нижние зеленые. Соцветия прямые, с короткими или длинными ветвями, часто доходящие до верхушки, состоящие из мутовок.

14 — 30). Цветки на белоопушенных цветоножках. Чашечка двугубая, рассечена на ½ или 1/3 длины, опушена длинными волоскаминижняя губа длиннее верхней, ворсинчато опушенная, верхняя губа округлая, с тремя сближенными зубчиками, средним более коротким, нижняя с двумя продолговатыми, заостренными, прямо торчащими зубцамивенчик — 8−12 мм длиной, двугубыйверхняя губа слабо серповидно изогнутая, с короткими белыми волосками на спинке и на верхушкесредняя лопасть нижней губы венчика округлая, слабо чашевидно углубленнаястолбик немного выдается из верхней губы, лопасти рыльца почти одинаковыетычинки 2, передние. Сверху листья светло-зеленого цвета, снизусеровато-зеленого, окраска стеблей серовато-зеленаячашечка — светло-зеленого, а венчик — сине-фиолетового цвета. Запах слабо ароматный. Вкус горьковато-пряный.

Измельченное сырье. Кусочки листьев, стеблей, цветков, цветоносов и бутонов, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Окраска серовато-зеленая с вкраплениями сине-фиолетового цвета. Запах ароматный. Вкус горьковато-пряный.

5.1.2. Анатомические диагностические признаки сырья При рассмотрении листа с поверхности видны клетки эпидермиса верхней стороны — многоугольные и прямостенные (рис. 24), нижней стороны — более вытянутые (рис. 25). Устьица диацитного и аномоцитного типов, более многочисленные на нижнем эпидермисе.

Рис. 25. Эпидермис нижней стороны листа.

Примечание. 1 — простые волоски, 2 — устьица, 3 — эфиромасличные железки, 4 — головчатые волоски, 5 — клетки эпидермиса.

На обеих сторонах листа характерно наличие трихом. Встречаются простые волоски одноклеточные с утолщенными стенками и многоклеточные, толстостенные двух-трехклеточные волоски с бородавчатой поверхностью, часто изогнутые. Простые волоски в основании не имеют розетки. Головчатые волоски состоят из одно-трехклеточной ножки и шаровидной одно-двухклеточной головки, лучше заметны по краю и по жилкам листа. Эфиромасличные железки с восьмиклеточной головкой, крупные, типичного строения для яснотковых.

Клетки эпидермиса стебля имеют вытянутую форму с прямыми стенками. Встречаются в основном короткие двухклеточные простые волоски и головчатые волоски с одноклеточной головкой на короткой одноклеточной ножке (рис. 26).

Примечание. 1 — простые волоски, 2 — головчатые волоски, 3 — клетки эпидермиса.

На поперечном срезе стебля в его верхней и средней частях обнаружено, что он имеет пучковое строение (рис. 27). Пучки открытые коллатеральные, располагаются по кругу. В ребрах стебля — пучки больших размеров. В основании (на расстоянии 3 см от земли) стебель имеет непучковое строение (рис. 28). Уголковая колленхима в ребрах стебля ярко выражена, состоит из нескольких рядов клеток. Первичная кора имеет трехслойное строение (состоит из экзодермы, мезодермы и эндодермы). Под эндодермой расположена склеренхима перициклического происхождения, которая окрашивается реактивом на одревеснение (флороглюцином). Лубяная часть представлена ситовидными трубками с клетками-спутницами и клетками лубяной паренхимы. Камбий имеет четкую линию клеток, вытянутых в тангентальном направлении. Сосудистые элементы древесины располагаются правильными рядами, чередуясь с рядами клеток либриформа. Сердцевина состоит из крупных живых паренхимных клеток и занимает 2/3 объема поперечного среза стебля.

Рис. 27. Поперечный срез верхней и средней части стебля Примечание. 1 — уголковая колленхима, 2 — эндодерма, 3 — склеренхима, 4 -пучки, 5 — флоэма, 6 — камбий, 7 — ксилема, 8 — сердцевина. 2 3 4 5.

Рис, 28. Поперечный срез основания стебля.

Примечание. 1 — уголковая колленхима, 2 — эндодерма, 3 — склеренхима, 4 флоэма, 5 — камбий. 6 — ксилема, 7 — сердцевина.

При микроскопическом исследовании внешней и внутренней поверхности чашелистиков обнаружено, что клетки эпидермиса имеют извилистые стенки. Встречаются короткие одноклеточные и многоклеточные простые и головчатые волоски, эфиромасличные железки, подобные элементам листа, а также сосочковидные волоски. В мезофилле заметны мелкие призматические кристаллы оксалата кальция (рис. 29).

Ж— 1.

Рис. 29. Эпидермис зубца чашечки.

Примечание. 1 — простые волоски, 2 — головчатые волоски, 3 — клетки эпидермиса, 4 — сосочковидные волоски, 5 — эфиромасличные железки, 6 -призматические кристаллы оксалата кальция.

Клетки верхнего и нижнего эпидермиса венчика имеют сходное строение, они — многоугольные, с извилистыми стенками. Встречаются многоклеточные гладкие простые волоски, головчатые волоски, состоящие из одно-трехклеточной ножки и шаровидной одно-двухклеточной головки, мелкие сосочковидные волоски и эфиромасличные железки (рис. 30).

Рис. 30. Эпидермис венчика.

Примечание. 1 — простые волоски, 2 — эфиромасличные железки, 3 — клетки эпидермиса, 4 — головчатые волоски, 5 — сосочковидные волоски.

Таким образом, для идентификации сырья травы шалфея сухостепного диагностическое значение имеют следующие анатомические признаки: клетки эпидермиса верхней стороны листа — многоугольные и прямостенные, нижней стороны — более вытянутыеустьица диацитного и аномоцитного типов, в большем количестве на нижней стороне листаволоски простые одноклеточные и многоклеточные, гладкие и с бородавчатой поверхностью, в основании не имеют розеткиголовчатые волоски из короткой одно-трехклеточной ножки и шаровидной одно-двухклеточной головкиэфиромасличные железки с восьмиклеточной головкой, крупные, типичного строения для яснотковыхдля элементов цветка характерны многоугольные клетки эпидермиса с извилистыми стенкамиволоски и эфиромасличные железки, подобные элементам листасосочковидные волоски, а также мелкие призматические кристаллы оксалата кальция в мезофилле чашечки.

5.1.3. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в надземной части S. tesquicola.

По результатам фитохимического анализа установлено, что одной из основных групп биологически активных веществ в надземной части шалфея сухостепного являются флавоноиды. Они переходят в полиэкстракты, для которых выявлена фармакологическая активность. Кроме того, эта группа соединений удобна для стандартизации сырья.

Для количественного определения флавоноидов нами был использован метод дифференциальной спектрофотометрии, который в настоящее время чаще всего применяется при анализе флавоноидсодержащего сырья (Государственная Фармакопея СССР., 1989). Присутствие в надземной части шалфея сухостепного производных флавона, среди которых идентифицирован 7−0-(3-Dглюкозид лютеолина (цинарозид), дало основание при разработке методики определения содержания суммы флавоноидов в сырье использовать ГСО этого соединения (Фармакопейная., 1995).

На первом этапе было проведено сравнительное изучение спектров поглощения водного и спирто-водных извлечений из надземной части шалфея сухостепного, а также спиртового раствора ГСО цинарозида в УФ и видимой областях с добавками хлорида алюминия. Растворами сравнения служили исходные извлечения. Продукты реакции водного, 40%, 70%) и 95% спиртовых извлечений с хлоридом алюминия имели максимумы поглощения при 425, 440, 455 и 400 нм соответственно. Спиртовой раствор комплекса стандартного образца цинарозида с хлоридом алюминия имел максимум поглощения при 425 нм (рис. 31). В качестве рабочей была выбрана длина волны 425 нм.

360 375 390 405 420 435 450 465 480 495 510 525.

Длина волны, нм.

-¦-1 -л-2 -*-3 4 —5 Рис. 31. Дифференциальные УФ-спектры различных извлечений из надземной части Salvia tesquicola и раствора ГСО цинарозида.

1 — спектр раствора ГСО цинарозида в 95% этаноле,.

2 — спектр водного извлечения,.

3 -спектр 40% спиртового извлечения,.

4 — спектр 70% спиртового извлечения,.

5 — спектр 95% спиртового извлечения.

Определение концентрации суммы флавоноидов в сырье проводили по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартного образца цинарозида в концентрации от 1 до 20 мкг/мл (рис. 32).

1,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 концентрация ГСО цинарозида, мкг/мл.

20,0.

Рис. 32. Калибровочный график для определения концентрации флавоноидов в пересчете на цинарозид методом дифференциальной спектрофотометрии.

Построение калибровочного графика. 0,025 г (точная навеска) ГСО цинарозида, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 100−105 °С, помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в небольшом количестве 40% этанола и доводили до метки тем же растворителем — раствор А. 5 мл раствора, А переносили в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводили 40% этанолом до метки — раствор Б. Отбирали по 1- 2,5- 5- 7,5- 10- 12,5- 15- 17,5- 20 мл раствора Б в мерные колбы вместимостью по 25 мл, прибавляли по 0,5 мл 2% раствора хлорида алюминия в 95% спирте и доводили до метки 40% этанолом. Смеси выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего определяли оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 425 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 40% этиловый спирт.

При подборе условий экстракции суммы флавоноидов из травы шалфея сухостепного определяли значения следующих параметров:

— экстрагент (вода, 40% этиловый спирт, 70% этиловый спирт, 95% этиловый спирт);

— измельченность сырья (1, 2, 3, 5, 7 мм);

— соотношение сырья и экстрагента (гидромодуль) (1:10, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100);

— температурный режим (20 °С, 40 °C, кипящая водяная баня);

— время экстракции (15, 30, 45, 60, 90, 120 минут);

— кратность экстракции (одно-, двух-, трех-, четырехкратная);

Результаты экспериментов по подбору параметров экстракции проведены в трехкратной повторности и представлены на рисунках 33−38 и в таблицах 25−30.

При экстрагировании травы шалфея сухостепного различными растворителями максимальное содержание суммы флавоноидов отмечали при использовании в качестве экстрагента 40% этилового спирта, минимальный — при экстракции 96% этиловым спиртом (табл. 25, рис. 33).

Поэтому в последующей серии экспериментов в качестве экстрагента был выбран 40% этанол.

При исследовании степени измельченности сырья наибольшее содержание флавоноидов в извлечениях установлено при размере частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм (табл. 26, рис. 34). Исходя из этого, для количественного определения суммы флавоноидов выбран именно этот размер частиц сырья.