Управление процессом биосинтеза лизина с использованием контроля состава методом тонкослойной хроматографии

Получение таких продуктов, как антибиотики, ферменты, аминокислоты, кормовые белки, с использованием микробиологического синтеза широко применяется в современном производстве. Интеграция естественных и инженерных наук позволяет наиболее полно реализовать возможности живых организмов. Технология производства этих веществ хорошо отработана, получение их микробиологическим путём не только экономически выгодно, но и более безопасно, нежели с использованием химического синтеза.

Биотехнологические производства бурно развивались в СССР до середины 80-х годов, микробиологический синтез имел широкое распространение. После распада Советского Союза данная отрасль промышленности пришла в полный упадок. Только в конце 90-х годов начало возобновляться данное производство, ввиду возросшего интереса к различного вида белкам, аминокислотам и ферментам.

Среди комплекса основных задач, решаемых на биотехнологических производствах для обеспечения их эффективной и бесперебойной работы, особое место занимают задачи автоматизации как производства в целом, так и отдельных его участков. Основным образующим и энергоемким является отдел ферментации, состоящий из батареи аппаратов называемых биореакторами.

Назначением всякого биореактора (рис. 1.1) является создание оптимальных условий для жизнедеятельности культивируемых в нём клеток и микроорганизмов, а именно обеспечение аэрации, подвод питания и отвод метаболитов путём равномерного перемешивания газовой и жидкой-составляющих содержимого аппарата. Такие показатели как, рН, давление, концентрация растворенного кислорода рОг, температура являются косвенными показателями процесса биологического синтеза. Основным прямым параметром, объективно характеризующим ход процесса биосинтеза, является концентрация целевого вещества в культуральной жидкости. Своевременная корректировка процесса с учётом оперативно получаемой информации об основных показателях состояния процесса позволит достичь оптимального соотношения между себестоимостью и качеством готовой продукции, решить чрезвычайно важную задачу экономии энергоресурсов за счет оптимизации всех стадий процесса. Обеспечить высокую скорость анализа продуктов биологического синтеза с необходимой точностью позволяет метод тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Рис. 1.1. Схема биореакгора 1. Емкость- 2. Контур нагрева- 3. Механическая мешалка- 4. Подача воздуха- 5. Аэрация- 6. Порты- 7. Смотровые окна- 8. Выход воздуха- 9. Засев- 10. Отбор образцов- 11. Слив;

12. Залив среды.

Метод ТСХ позволяет разделять до нескольких десятков компонентов и поэтому находит широкое применение для анализа состава продуктов микробиологического синтеза, которые представляют собой сложную смесь близко родственных по своей структуре веществ.

Важным достоинством ТСХ по сравнению со значительно более дорогостоящей колоночной хроматографией является возможность анализа загрязненных проб и, таким образом, резкое упрощение пробоподготовки при анализе реальных, в первую очередь природных, объектов [1].

Одним из основных способов детектирования в ТСХ, наряду с традиционными фотометрическим (в отраженном или проходящем свете) и флуориметрическим методами, возрастающую роль начинают играть масс-спектрометрические методы детектирования — главным образом с лазерной десорбцией-ионизацией. Для фотометрического детектирования все больше используется сканирующая лазерная денситометрия, в том числе с применением оптоволоконной техники.

Не менее важной задачей является подбор среды и сравнение эффективности различных штаммов на них. Для анализа полученных культуральных жидкостей также используется метод тонкослойной хроматографии.

Таким образом, для оптимального управления процессом биосинтеза в промышленных ферментёрах и проведения экспериментов на исследовательских установках необходимо иметь метод анализа культуральной жидкости на такие антибиотики, как эритромицины, низинаминокислоты — лизин, лейцин, триптофан, серинсахара — глюкоза, мальтоза, лактоза, обладающий следующими характеристиками: время анализа не должно превышать 1 часодновременный анализ нескольких пробне должно сказываться влияние примесейспособность определять наличие вещества в малых количествах, порядка 100 нгпогрешность анализа не должна превышать 5%- низкая стоимость проведения анализапростота проведения анализа.

Метод ТСХ вполне удовлетворяет всем заявленным требованиям, кроме точности анализа — в настоящее время методы детектирования обладают существенной погрешностью, что приводит к использованию ТСХ для полуколичественного или качественного анализа.

В соответствии с вышеизложенным и учитывая, что концентрация целевого вещества в культуральной жидкости является основным прямым параметром, одной из основных задач работы является усовершенствование методики экспресс-анализа в процессах биосинтеза методом тонкослойной хроматографии и её внедрение в структуру АСУТП сложным биотехнологическим производством на базе современной вычислительной техники.

В данной работе будет рассмотренно применение усовершествованного метода детектирования анализа при помощи тонкослойной хроматографии для управления процессом биосинтеза аминокислот на примере L-лизина. Аминокислоты — это любые органические кислоты, в состав молекулы которых входит аминогруппа, хотя чаще всего под этим названием подразумевают а-аминокислоты вследствие их исключительного значения как составляющей части биополимеров — белков. Незаменимыми называются а-аминокислоты, которые не могут быть синтезированы организмом из веществ, поступающих с пищей в количествах, необходимых для поддержания жизнедеятельности. К незаменимым для человека аминокислотам относятся лейцин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин.

По химическим свойствам лизин — а-аминокислота с сильными основными свойствами, обусловленными е-аминогруппой. С кислотами дает два ряда солей, например с соляной кислотой — гидрохлорид и дигидрохлорид. Образует нерастворимые соли с пикриновой и фосфорномолибденовой кислотами. н н 0 L-лизин {рас. 1.2) — необходимый компонент пищи для.

S I l/N~~<f—человека и животных (незаменимая аминокислота), н сн он.

Г 2 сн 2.

Встречается во всех организмах в составе молекул белков и сн2 пептидов, входит в состав активных центров ферментов,.

С* н.

I 2 например аминотрансфераз в больших количествах nh2 содержится в гистонах и протаминах. Его содержание в.

Рис. 1,2.

Структурная продуктах (на сухую массу) составляет: в пшеничной муке формула 1,9%, говядине 10%, коровьем молоке 8,7%. Биосинтез лизина:

L-лизина из аспарагиновой и пировиноградной кислот через 2,6-диаминопимелиновую кислоту (декарбосилирование которой приводит к L-лизину) или из а-аминоадипиновой кислотыпоследняя образуется также при распаде L-лизина в организме.

Получают L-лизин микробиологически или из гидролизатов белков путем осаждения в виде пикрата. Синтетически лизин получают аминированием а-галогенкапролактама. В спектре ПМР L-лизин в D20 химические сдвиги (в м.д.) 3,762 (а-Н), 1,91 (Р-Н), 1,393 (у-Н), 1,732 (8-Н), 2,649 (е-Н). Лизин применяют как кормовую добавку для восполнения дефицита этой аминокислоты в растительных белкахиспользуют также в синтезе пептидов, в смеси с другими аминокислотами — для составления питательных сред.

Несмотря на большую историю промышленного биосинтеза лизина, предлагаются новые технологические способы улучшения технологии синтеза, выделения и очистки лизина. Например, в работе [21] разработан метод получения L-лизина гидрохлорида, пригодного для использования в качестве пищевой добавки, а также способ электродиализной конверсии гидрохлорида лизина в лизин основной. Приведены испытания, по добавлению лизина гидрохлорида в муку и хлеб при выпечке, которые показали повышение биологической ценности муки и хлеба. Для оптимизации разработанных мембранно-сорбционных технологий очистки и концентрирования аминокислот на основе теоретических и экспериментальных разработок получены сведения о механизмах процессов, происходящих в электромембранных системах, включающих в себя растворы аминокислот. Разработаны новые методики и построены адекватные математические модели.

Использование широко распространенной компьютерной техники позволяет существенно улучшить традиционные методы химического анализа, повысить его точность и оперативность. Используя более точные данные о ходе процесса возможно его моделировать и рассчитывать оптимальные расходы подпиток и время их внесения, время передачи ферментационной среды на стадию выделения, что позволит уменьшить расходы на исходные субстанции, снизить нагрузку на системы нанои ультрафильтрации, уменьшить расход воды и реагентов на их чистку и регенерацию.

5.5 Выводы.

Стадия ферментации, будучи самой энергозатратной, является определяющей для всего производства вцелом — от производительности каждого из аппаратов зависят экономические показатели производства вцелом, поэтому, оптимизируя процесс биосинтеза на каждой из стадий процесса, можно добиться существенных результатов. Обеспечить достижение требуемых показателей эффективности возможно лишь с применением адаптивных систем управления. Проведённые исследования показали, что последняя стадия — стадия окончания процесса — до настоящего времени не подвергалась оптимизации. Прогнозирование времени окончания сводится к определению времени снижения концентрации углеводов (сахаров) до пороговой величины. Таким образом, получение достоверной информации о составе культуральной жидкости позволяет спрогнозировать оптимальное время окончания процесса. Применение созданной методики экспресс-анализа состава и разработанный на её базе алгоритм работы адаптивной системы управления позволят вносить своевременные корректировки в процесс управления биосинтезом.

Заключение

.

1. Разработана экспериментально-аналитическая модель окрашенности зоны диффузии от количества, содержащегося в ней, вещества.

2. Создана методика определения концентрации продуктов биосинтеза и редуцирующих веществ в культуральной жидкости.

3. Разработанная методика апробирована и подтверждена экспериментально на ряде веществ — аминокислот, антибиотиков и Сахаров.

4. Создан программно-технический комплекс реализующий методику и необходимые для её работы алгоритмы.

5. Созданная методика внедрена в работу научно-исследовательской лаборатории Института промышленной биотехнологии МГУИЭ, включена в производственный регламент завода по производству L-лизина в республике Чувашии.

6. Разработана автоматизированная система определения оптимального момента завершения процесса биосинтеза лизина.