Роль точечных мутаций в генах топоизомеразы IV и ДНК гиразы в формировании резистентности Mycoplasma hominis к фторхинолонам

Молликуты (микоплазмы) — наименьшие из известных микроорганизмов, способных к самостоятельному делению. Геном одного из представителей класса — M. genitalium — всего в несколько раз больше генома крупных вирусов и составляет 580 т.п.о. Молликуты достаточно гетерогенная группа микроорганизмов, однако их основным таксономическим признаком является отсутствие клеточной стенки, свойственной остальным бактериям. Большинство из известных к настоящему времени микоплазм являются паразитами. Mycoplasma hominis — преимущественно колонизирует слизистые урогенитального тракта, вызывая эндометрииты, сальпингиты, негоннококовые уретриты [Прозоровский СВ. 1995]. По данным литературы около 10% человеческой популяции инфицированы этим видом микоплазм [Tailor-Robinson, 1997].

Современные схемы лечения бактериальных инфекций, в том числе микаплазмозов, включают использование антибактериальных препаратов. Для лечения микоплазмозов препаратами выбора являются тетрациклины и макролиды. Однако широкое использование тех или иных антибиотиков в клинике приводит к появлению резистентных к ним штаммов микроорганизмов. Например, в результате использования тетрациклина для лечения микоплазменных инфекций количество резистентных изолятов за десять лет возрасло в 3−4 раза [Cummings 1990 ]. В тех случаях, когда использование традиционных препаратов затруднено, применяют прапараты фторхинолонового ряда. Фторхинолоны — синтетические антибиотики широкого спектра действия производные налидиксовой кислоты.

Мишенями для действия фторхинолонов являются бактериальные топоизомеразы типа II: ДНК гираза и топоизомераза IV. К настоящему моменту известно два основных механизма, обеспечивающих формирование резистентности бактерий к фторхинолонам. Первый это мутации в так называемых районах, определяющих резистентность к хинолонам (QRDR) генов, кодирующих субъединицы ферментов-мишеней топоизомеразы П (ДНК-гиразы) — gyrA, gyrB и (или) топоизомеразы IVparC, parE (grlA, grlB у S. aureus). Второй — изменение уровня накопления препаратов в клетках за счет снижения проницаемости клеточной мембраны или увеличеия обратного выброса препарата из клетки .

Применение новых препаратов требует теоретических и эпидемиологических исследований: определения ингибирующих и бактерицидных концентраций, изучения механизмов формирования резистентности, выявления частот встречаемости резистентных клинических изолятов и перекрестной резитстентности. Микоплазмы относятся к категории латентных инфекций с хроническим течением заболевания и стертой клинической картиной. Часто манифестация заболевания связана с развитием иммунодифецитных состояний. В то же время неадекватное использование антибиотиков может, с одной стороны представлять угрозу для нормальной микрофлоры челевека, а с другой стороныспособствовать появлению антибиотикорезистентных штаммов.

В предлагаемой работе на примере M. hominis в условиях культивирования in vitro показана высокая приспосабляемость микоплазм к действию фторхинолоновых препаратов. Обнаружены новые мутации в генах ДНК гиразы и топоизомеразы IV в хинолон-резистентных штаммах. В связи с этим актуальным является вопрос о роли точечных мутаций в формировании резистентности и определения участия других механизмов резистентности микоплазм к хинолоновым препаратам.

Целью данной работы было изучение связи между наличием точечных мутаций в генах ДНК гиразы и топоизомеразы IV M. hominis и резистентностью к некоторым препаратам фторхинолонового ряда лабораторного штамма Н34 и клинических изолятов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить неизвестную последовательность QRDR фрагмента гена, кодирующего, А субъединицу ДНК гиразы Mycoplasma hominis;

2. Получить серию мутантов лабораторного штамма М. hominis Н34 и клинических изолятов и определить перекрестную резистентность мутантов к используемым в данной работе антибактериальным препаратам;

3. Определить мутации в QRDR генов gyrA, gyrB, parC, рагЕ у клонов, полученных в результате селекции;

4. Проанализировать указанные участки генов у клинических изолятов M. hominis;

1. Культивирование лабораторного штамма М. hominis Н34 и клинических изолятов М. hominis в жидкой среде с возрастающими концентрациями ФХ приводит к появлению высокорезистентных штаммов.

2. Получены культуры М. hominis, устойчивые к высоким концентрациям ФХ и не имеющие мутаций в генах ДНК гиразы и топоизомеразы IV, что свидетельствует о существовании других механизмов, участвующих в резистентности к ФХ.

3. Говорун В. М., Гущин А. Е., Ладыгина В. Г., Абрамычева Н. Ю, Тополь Ю. Ю. 1998. О формировании резистентности к фторхинолонам у М. hominis и A.laidlawii. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 3:16−19.

4. Мазин В. А., Кузнеделов К. Д., Краев A.C. 1990. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука. Сибирское отделение.

5. Падейская E.H., Яковлев В. П. 1998. Антимикробные препараты группы фторхинолонов в клинической практике. Логата, Москва.

6. Прозоровский C.B., Раковская И. В., Вульфович Ю. В. 1995. Медицинская микоплазмология. Москва. Медицина.

7. Чернова O.A. 1999. Биохимические и молекулярнобиологические аспекты персистенции микоплазм у человека. Успехи биологической химии 39: 103−140.

8. Яковлев C.B. 1997. Клиническая химиотерапия бактериальных инфекций. Ньюадиамед-АО, Москва.

9. Adams D., Shekhtman Е., Zechiedrich Е., Schmid M., Cozzarelli N. 1992. The role of topoisomerase IV in partioning bacterial replicons and structure of catenated intermediates in DNA replication. Cell 71: 277−288.

10. Barnes M., Tarantino P.M., Spacciapoli Jr. P., Brown N.C., Yu H., Dybvig K. 1994. DNA polymerase III of Mycoplasma pulmonis, isolation and characterization of the enzyme and its structural gene, polC. Mol. Microbiol. 13: 843−854.

11. Bebear C.-M., Aullo P., Bove J.-M., Renaudin J. 1996. Spiroplasma citri virus SpVl: characterisation of viral sequence present in the spiroplasmal host chromosome. Curr. Microbiol. 32: 134−140.

12. Bebear C.M., Bove J.M., Bebear C., Renaudin J. 1997. Characterisation of Mycoplasma hominis mutations invilved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 269−273.

13. Bebear C.M., Charron A., Bove J.M., Bebear C., Renaudin J. 1998. Cloning and nucleotide sequences of the topoisomerase IV parC and parE genes of Mycoplasma hominis. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2024;2031.

14. Bebear C M., Renaudin H., Charron A., Bove J.M., Bebear C., Renaudin J. 1998. Alteration in topoisomerase IV and DNA gyrase in quinolone-resistant mutants of Mycoplasma hominis obtained in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 42:23 042 311.

15. Bebear, C., B. de Barbeyrac, C. M. Bebear, H. Renaudin, and A. Allery. 1997. New development in diagnostic and treatment of mycoplasma infections in humans. Wien. Klin. Wochenschr. 109: 594 599.

16. Beiland R.J., Morrison S.G., Ison C., Huang W.M. 1994. Neisseria gonorrhoeae acquires mutations in analogous regions of gyrA and parC in fluoroquinolone-resistant isolates. Mol. Microbiol. 14(2):371−380.

17. Berger J.M., Gamblin S.J., Harrison SC., Wang J.C. 1996. Structure and mechanism of DNA topoisomerase II. Nature 379: 225−232.

18. Bhugra B., Voelker L.L., Zou N, Yu H., Dybvig K. 1995. Mechanism of antigenic variation in Mycoplasma pulmonis, intervomen, site-specific DNA inversions. Mol. Microbiol. 18:703−714.

19. Boesen T., Emmersen J., Jensen L.T., Ladefoged S.A., Thorsen P., Birkelund S., Christiansen G. 1998. The Mycoplasma hominis vaa gene displays s mosaic gene structure. Mol. Microbiol. 29:97−110.

20. Boom R., Sol C.J. A., Salimans M.M. et al. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J.Clinical. Microbiol. 28: 495−503.

21. Bove J.M. 1997. Spiroplasmas: infections agents of plants, arthropods and vertebrates. Wien Klin Wochenschr. 109:604−612.

22. Brenwald N.P., Gill M.J., Wise R. 1998. Prevalence of a putative efflux mechanism among fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2032;2035.

23. Bruner H. 1997. Models of mycoplasma respiratory and genital tract infections. Wien Klin Wochenschr. 109/14−15: 569−573.

24. Cambau E., Sougakoff W., Jarlier V. 1994. Amplification and nucleotide sequence of the quinolone resistance-determining region in the gyrA gene of Mycobacteria. FEMS Microbiol. Lett 116: 49−54.

25. Carle P.F., Laigret F., Tully J.G., Bove J.M. 1995. Heterogenity of genome size within the genus Spiroplasma. Int.J.Syst. Bacterid. 45. 178−181.

26. Chen C.-R., Malik M., Snyder M., Drilka K. 1996. DNA gyrase and topoisomerase IV on the bacterial chromosome: quinolone-indused DNA cleavage. J. Mol. Biol. 258: 627−637.

27. Christiansen C., Christiansen G., Rasmussen O.F. 1987 Heterogeneity of Mycoplasma hominis as detected by probe for atp genes. Isr. J. Med Sei. 23: 591−594.

28. Christiansen G., Andersen H., Birkelund S., Freundt E.A. 1987. Genomic and gene variation in Mycoplasma hominis strains. Isr. J. Med Sei. 23: 595−602.

29. Cohen S.P., Hooper D C., Wolfson IS., SouzaK.S., McMurry L.M., Levy S.B. 1988. Endogenous active efflux of norfloxacin in susceptible Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 32(8): 1187−91.

30. Cove, M. E., Tingey A. P., and Maxwell A. 1997. DNA gyrase can cleave short DNA fragments in the presence of quinolone drugs. Nucleic Acids Res. 25: 2716- 2722.

31. Cowan S.W., Schirmer T, Rummel G., Steierl M., Ghosh R., Pauptit R.A., Jansonius J.N., Rosenbusch JP. 1992. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature 358(63 89):727−733.

32. Cummings M.C., McCormack W.M. 1990. Increase in resistance of Mycoplasma hominis to tetracyclines. Antimicrob. Agents Chemothe. r 34(12):2297−2299.

33. Dong Y., Zhao X., Domagala J., Drlica K. 1999. Effect of fluoroquinolone concentration on selection of resistant mutants of Mycobacterium bovis BCG and Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 43(7): 1756−1758.

34. Eschenbach D.A. 1986. Ureaplasma urealiticum as a couse of postpartum fever. Pediatr. Inf. Dis. 5 Suppl.: 258−261.

35. Faser C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., Clayton R.A. 1995. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science 270:397−403.

36. Ferrero L., Cameron B., Crouzet J. 1995. Analisis of gyrA and grlA mutations in stepwise-selected ciprofloxacin-resistant mutants of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1554−1558.

37. Furr P.M., Tailor-Robinson D.1987. Prevalence and significance of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealiticum in urines of non-veneral disease population. Epidem. Inf. 98: 353−359.

38. Geliert M., CTDea M.H., Mizuuchi K., Nash H. 1976. DNA gyrase: an enzyme that introduses superhelical turns into DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73: 3872−3876.

39. Ghosh A.S., Ahamed J., Chauhan K.K., Kundu M. 1998. Involvement of an efflux system in high-level fluoroquinolone resistance of Shigella dysenteriae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 242: 54−56.

40. Goulet, M., Dular R., Tully J G., Billowes G., Kasatiya S. 1995. Isolation of Mycoplasma pneumoniae from the human uregenital tract. J. Clin. Microbiol. 33: 2823−2825.

41. Griffith J.K., Baker M.E., Rouch D.A., PageM.G., Skurray R.A., Paulsen IT., Chater K.F., Baldwin S.A., Henderson P.J. 1992. Membrane transport proteins: implications of sequence comparisons. Curr. Opin. Cell Biol. 4(4):684−695.

42. Griggs D. J., Gensenberg K., Piddock L. 1996. Mutation in gyrA gene of quinolone-resistant Salmonella serotypes isolated from human and animals. Antimicrob. Agents Chemother. 40: 1009−1013.

43. Grinius L., Dreguniene G., Goldberg E.B., Liao C.H., Projan S.J. 1992. A staphylococcal multidrug resistance gene product is a member of a new protein family. Plasmid 27(2): 119−129.

44. Hallett P, Maxwell A. 1991. Novel quinolone resistance mutations of the Escherichia coli DNA gyrase A protein: enzymatic analysis of the mutant proteins. Antimicrob. Agents Chemother. 35(2):335−40.

45. Harasawa R., Asada K., Kato I. 1995. A novel repetitive sequence from Mycoplasma hyopneumoniae. J.Vet. Med.Sei. 57:557−558.

46. Herrera G., Aleixandra V., Urios A., Blanco M. 1993. Quinolone action in Escherichia coli cells carrying gyrA and gyrB mutations. FEMS Microbiol Lett 106(2): 187−91.

47. Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H, Pirkl E., Li P.C., Hermann R. 1996. DNA sequence of the complete genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae and interpretation of data. IOM Letters 4: 9.

48. Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., Reiner B., Hermann R. 1997. Comparative analysis of the genome of the bacteria Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium. Nucleic Acids Res. 25: 701−712.

49. Hooper DC. 1995. Quinolone mode of action. Drugs. 49 Suppl.: 10−15.

50. Hooper D.C. 1998. Bacterial topoisomerases, antitopoisomerases, and anti-topoisomerase resistance. Clin. Infect. Dis. 27Suppl.: S54- 63.

51. Hooper D.C., Wolfson J.S., Bozza M.A., Ng E.Y. 1992. Genetics and reguletion of outer membrane protein expression by quinolone resistance loci nficB, nficC, and cficB.

52. Horowitz S., Horowitz J., Tailor-Robinson D., Sukenik S. 1994. Ureaplasma urealiticum in Reiter" s syndrome. J. Rheumatol. 21:877−882.

53. Hoshino K., Kitamura A, Morrissey K., Sato K., Kato J., Ikeda H. 1994. Comparison of inhibition of Escherichia coli topoisomerase IV by quinolones with DNA gyrase inhibition. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 2623−2627.

54. Howard B.M., Pinney R.J., Smith J.T. 1993. Function of the SOS process in repair OF DNA damage indused by modern 4-quinolones. J. Pharm. Pharmacol. 45. 658 662.

55. Hu W S., Wang R.Y.-H., Liou R.S., Shih W.-K., Lo S.-C. 1990. Identification of an insertion-like sequence genetic element in a newly recognized human pathogen Mycoplasma incognitus. Gene 93: 67−72.

56. Ito H., Yoshida H., Bogaki-Shonai M., Niga H., Hattori H, Nakamura S. 1994. Quinolone resistance mutations in the DNA gyrase gyrA and gyrB genes of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 2014;2023.

57. James P.A., Reeves D.S. 1996. Bacterial resistance to cephalosporins as a function of outer membrane permiability and access to their target. J.Chemother. 8 Suppl.: 3747.

58. Kaatz G.W., Seo S.M. 1997. Mechanisms of fluoroquinolone resistance in genetically related strains of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 27 332 737.

59. Kaatz G.W., Seo S.M., Ruble C.A. 1993. Efflux-mediated fluoroquinolone resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 37: 1086−1094.

60. Kanematsu E., Degushi T., Yashida M. 1998. Alterations in the GyrA subunit of the DNA gyrase and ParC subunit of DNA topoisomerase IV associated with quinolone resistance in Enterococcus faecalis. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 433−435.

61. Kato J.-I., Susuki H., Ikeda H. 1992. Purification and characterisation of DNA topoisomerare IV inE.coli. J.Biol.Chem. 267:25 676−25 684.

62. Kenny G.E., Cartwright F.D. 1994. Susceptibilities of Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae Ureaplasma urealyticum to new glycylcyclines in comparison with those of older tetracyclines. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 2628−2632.

63. Khodursky A.B., Zechiedrich E.L., Cozzarelli N.R. 1995. Topoisomerase IV is the target of quinolones in Escherichia coli. Proc.Natl. Acad. Sei. USA 92: 11 801−11 805.

64. Lagefoged S.A., Christiansen G., 1992. Physical and genetic mapping of the genomes of five mycoplasma hominis straines by pulsed-field gel electrophoresis. J. Bacteriol 174: 2199−2207.

65. Levi N., Prag J., Jensen J.S., Schroeder T.V., Lorenzten J.E. 1997. Surgical infections with Mycoplasma: a brife review. J.R.Coll. Surg. Edinb. 42:107−109.

66. Lewin C., Howard B., Smith J. 1991. Protein and RNA-synthesis independent bactericidal activity of cyprofloxacin tha involves the A subunit of DNA gyrase. J. Med. Microbiol. 34: 19−22.

67. Liu J., Takiff H E., Nikado H. 1996. Active efflux of fluoroquinolones in Mycobacterium smegmatis mediated by LfrA, a multidrug efflux pump. J.Bacteriol. 178: 3791−3795.

68. Lo, S.C., Hayes M M., Kotani H., et.al.1993. Adhesion onto and invasion into mammalian cells by Mycoplasma penetrans: a newly isolated mycoplasma from patients with AIDS. Mod. Pathol. 6: 276−280.

69. Lucier T.S., Heitzman K., Liu S.K., Hu P.C., 1995. Transition mutations in the 23S rRNA of erythromycin-resistant isolates of Mycoplasma pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 2770−2773.

70. Maniloff J., Kampo G.J., Dascher C.C. 1994. Sequence analysis of a temperate phage: mycoplasma virus L2. Gene 141: 1−8.

71. ManilofF, J. 1996. Mycoplasma phylogeny: correlation with molecular biological and paleontological changes, p.8 In Abstracts of the 8th IUMS International Congress of Bacteriology.

72. Maniloff, J. 1996. The minimal cell genome: «on being the right size». Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 10 004−10 006.

73. Marger M.D., Saier M.H. Jr. 1993. A major superfamily of transmembrane facilitators that catalyse uniport, symport and antiport. Trends Biochem. Sci. 18(1): 13−20.

74. Marshall A.J., Miles R.J., Richards L. 1995. The phagocytosis of mycoplasmas. J.Med. Microbiol. 43:239−250.

75. Maxwell A. 1992. The molecular basis of quinolones action. Antimicrob. Agents. Chemother. 30: 409−416.

76. McGarity, G.J., Kotani H., Butler G.H. 1992. Mycoplasma and tissue culture cells, p. 445−454. American Society for Mycrobiology., Washington D.C.

77. Moore R.A., Beckthold B., Wong S., Kureishi A., Bryan L.E. 1995. Nucleotide sequence of the gyrA gene and characterization of ciprofloxacin-resistant mutants of Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 107−111.

78. Morais Cabral J.H., Jackson A.P., Smith C.V., Shikotra N., Maxwell A., Liddington R.C. 1997. Crystal structure of breakage-reunion domen of DNA gyrase. Nature 28- 388(6645):903−906.

79. Mufson M.A., Ludwig W.M., Purcell R.H., Cate T.R., Tailor-Robinson D., Chanock R.M. 1965. Exudative pharyngitis following experimental! Mycoplasma hominis type 1 infection. JAMA 192: 1146−1152.

80. Nakanishi N., Yoshida S., Wakabe H., Inoue M., Yamagushi T., Mitsuhashi S. 1991. Mechanism of clinical resistance to fluoroquinolones in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 35: 2562−2567.

81. Nakano M., Deguchi T., Kawamura T., Yashida M. 1998. Mutation in the gyrA and parC genes in fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 2289−2291.

82. Neyfakh A.A., Borsch C.M., Kaatz G.W. 1993. Fluoroquinolone resistance protein NorA of Staphylococcus aureus is a multidrug efflux transporter. Antimicrob Agents Chemother. 37(1): 128−129.

83. Nikado H. 1994. Prevention of drug access to bacterial targets: permeability barriers and active efflux. Science. 264: 382−388.

84. Nikaido H., Saier M.H. Jr. 1992. Transport proteins in bacteria: common themes in their design. Science 258(5084):936−942.

85. Ohshita Y., Hiramatsu K., Yokota T. 1990. A point mutation in norA gene is responsible for quinolone resistance in Staphylococcus aureus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 1028−1034.

86. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T. 1989. Detection of human DNA by gel electrophoresis as singl-strand conformation polymorphism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766−2770.

87. Pan X. S., Fisher L.M. 1996. Cloning and characterization of the parC and parE genes of Streptococcus pneumoniae encoding DNA topoisomerase IV: role in fluoroquinolone resistance. J. Bacteriol. 178(14): 4060−4069.

88. Pan X.S., Ambler J., Mehtar S., Fisher L.M. 1996. Involvement of topoisomerase IV and DNA gyrase as ciprofloxacin targets in Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 40(10):2321−2326.

89. Priestley C.J., Jones B.M., Dhar J., Goodwin L. 1997. What is normal vaginal flora? GenitourinMed. 73:23−8.

90. Pruss G.J., Franco R., Chevalier S., Manes S.H., Drilka K. 1986. Effects of DNA gyrase inhybitors in E. coli topoisomerase I mutants. J.Bacteriol. 168: 276−282.

91. Pruss G.J., Manes S.H., Drilka K. 1982. Ecoli DNA topoisomerase I mutants: increased supercoiling is corrected by mutations near gyrase genes. Cell 31: 35−42.

92. Razin S., Yogev D., Naot Y. 1998. Molecular biology and pathogenity of mycoplasmas. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:1094−1156.

93. Reece R. J., Maxwell A. 1991. Biol. Chem. 1991. Probing the limits of the DNA breakage-reunion domain of the Escherichia coli DNA gyrase A protein. 25−266(6):3540−3546.

94. Reece R.J., Maxwell A. 1991. The C-terminal domain of the Escherichia coli DNA gyrase A subunit is a DNA-binding protein. Nucleic. Acids Res. 11−19(7): 13 991 405.

95. Revel V., Cambau E., Jarlier V., SougakofF W. 1994. Characterisation of mutations in Mycobacterium smegmatis involved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1991;1996.

96. Rinken R., Wackernagel W. 1992. Inhibition of the rec? CD-dependent activation of chi recombinational hot spots in SOS-indused cells of E.coli. J.Bacteriol. 174:11 721 178.

97. Robertson J. A., Pyle L.E., Sterake G.W., Finch L R. 1990. Human Ureaplasmas show deverse size by pulsed-field gel electrophoresis. Nucleic. Acids.Res. 18:14 511 455.

98. Rosenstain I.J., Morgan D.J., Sheehan M., Lamont R.F., Tailor-Robinson D. 1996. Bacterial vaginosis in pregnancy, distribution of bacterial species in different gram-stain kategories of the vaginal flora. J.Med. Microbiol. 44: 1−7.

99. Rotten, S., Kahane I., 1993. Mycoplasma cell membranes. Subcell. Biochem. 20: 1−314.

100. Saier M.H. Jr., Tam R., Reizer A., Reizer J. 1994. Two novel families of bacterial membrane proteins concerned with nodulation, cell division and transport. Mol. Microbiol. 11(5)841−7.

101. Schulz G.E. 1993. Bacterial porins: structure and function. Curr. Opin. Cell. Biol. 5(4):701−707.

102. Takaba H., Kusano N. 1998. Sparfloxacin resistance in clinical isolates of Streptococcus pneumoniae, involvment of multiple mutations in gyrA and parC genes. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2193−2196.

103. Tanaka M, Onodera Y, Uchida Y, Sato K, Hayakawa I. 1997. Inhibitory activities of quinolones against DNA gyrase and topoisomerase IV purified from Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 41(11):2362−2366.

104. Tanaka M., Otsuki M., Nishino T." Kobayashi I., Matsumoto T., Kamazawa J. 1996. Mutation in DNA gyrase of norfloxacin-resistance isolates of Neisseria gonorrhoeae. Genitourin. Med. 72: 295−295.

105. Taylor-Robinson D. 1995. The history and role of Mycoplasma genitalium in sexually transmitted deseases. Genitourin. Med. 71: 1−8.

106. Taylor-Robinson D. and Furr P.M. 1997. Genital mycoplasma infections. Wien Klin Wochenschr. 109/14−15: 578−583.

107. Taylor-Robinson D., Davied H.A., Sarathchandra P., Furr P.M. 1991. Intracellular location of mycoplasma in cultured cells demonstrated by immunocytochemistry and electron microscopy. Int. J. Exp. Pathol. 72: 705−714.

108. Taylor-Robinson D., Gilroy C.B., Hay P.E. 1993. Occurence of Mycoplasma genitalium in different populations and its clinical significance. Clin. Infect. Dis. 17 Suppl.: 66−68.

109. Taylor-Robinson D., Gilroy C.B., Horowitz S., Horowitz J. 1994. Mycoplasma genitalium in the joints of two patients with arthritis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13: 1066−1069.

110. Tsai S., Wear D.J., Shih J.W., Lo S C. 1995. Mycoplasmas and oncogenesis: persistent and mutistage malignant transformation. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 92:10 197−201.

111. Wang R.Y.-H., Shih J.W.-K., Weiss S.H. 1993. Mycoplasma penetrance infection in male homosexuals with AIDS: high seroprevalence and association with Kaposi’s sarkoma. Clin. Infect. Dis. 17: 724−729.

112. Wang T., Tanaka M., Sato K. 1998. Detection of grlA and grlB mutations in 344 Staphylococcus aureus strains. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 236−240.

113. Weigel L., Steward C D., Tenover F.C. 1998. gyrA mutations associated with fluoroquinolone resistance in eight species of Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2661−2667.

114. Whitcomb, R. F., and Tully J G. 1989. The mycoplasmas, vol. V. Spiroplasmas, achopleplasmas, and mycoplasmas of plants and arthropods. Academic Press, Inc. San Diego, Calif.

115. Yinezawa M., Takahata M., Banzawa N, Matsubara N., Watanabe Y., Narita H. 1995. Analysis of the NH2-terminal 83rd amino acid of the Escherichia coli GyrA in quinolone resistance. Microbiol. Immunol. 39: 243−247.

116. Yoneyama H., Yamano Y, Nakae T. 1995. Role of porins in the antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa: construction of mutants with deletion in the multiple porin genes.

117. Yonezawa M., Takahata M., Banzawa N., Matsubara N., Watanabe Y., Narita H. 1995. Analysis of the NH2-terminal 87th amino acid of Escherichia coli GyrA in quinolone resistance. Microbiol. Immunol. 39:517−520.

118. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M., Nakamura S. 1990. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 34: 1271−1272.

119. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M., Yamanaka L. M, Nakamura S. 1991. Quinolone resistancedetermining region in the DNA gyrase gyrB gene of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 35:1647−1650.

120. Zhang Q., Wise K. 1996. Molecular basis of size and antigenic variation of a Mycoplasma hominis adhesin encoded by divergent vaa genes. Infect. Immun. 64: 2737−2744.

121. Zhang Q., Wise K. 1997. Localized reversible frameshift mutation in a adhesin gene confers a phase-variable adherence phenotype in mycoplasma. Mol. Microbiol. 25: 859−869.

122. Zheng J., Mcintosh. 1995. Characterisation of IS 1221 from Mycoplasma hyorhinis: expression of its putative transposases in E. coli incorporates a ribosomal frameshift mechanism. Mol. Microbiol. 16: 6947−6953.