Физико-химическая характеристика мембран эритроцитов крыс при гипотермии и на фоне введения даларгина

Актуальность проблемы. Гипотермия как метод снижения кислородных запросов организма в последнее время широко используется в различных областях медицины (Мешалкин, Верещагин, 1985; Бабийчук и др., 1990). Защитный эффект гипотермии связан со снижением обменных процессов, приводящим к повышению устойчивости организма к воздействию многих неблагоприятных факторов, прежде всего гипоксии, обычно сопутствующая различным видам патологий (Тимофеев, 1983; Сумбатов, 1985; Эмирбеков, Львова, 1985; Leietal., 1994).

Наряду с благоприятным эффектом гипотермия оказывает и патологическое действие. Установлено, что гипотермия вызывает дискоординацию метаболических процессов в тканях, имеющие длительные постгипотермические последствия (Тимофеев, 1983; Кличханов, 2001).

Основой формирования адаптационных процессов в организме служат биологические мембраны. Считается, что основной мишенью действия низкой температуры на клеточном и субклеточном уровне являются биологические мембраны (Тимофеев, 1983; Эмирбеков, Львова, 1985; Гулевский и др., 1988). Под действием низкой температуры могут изменятся структурные свойства мембран, проницаемость и лиганд-рецепторные взаимодействия и т. д. (Горди-енко, Гордиенко, 1986; Гулевский и др., 1990; Белоконева и др., 1991; Мальцева и др., 1991).

В то же время биологические мембраны служат основой для формирования адаптационных процессов в организме (Крепе, 1981). Поэтому, при изучении механизмов действия гипотермии важно особое внимание уделять исследованиям, направленным на выявление изменений в структуре и свойствах клеточных и субклеточных биомембран.

В связи с важнейшей ролью процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в развитии стресс-реакции (Меерсон, 1993; Кулинский, Ольховский, 1992), в том числе и низкотемпературного стресса (Василькова, Кухта, 1988;

Линчевская, Кондратьева, 1989; Эмирбеков и др., 1991; Бородин и др., 1992) и регуляции структурного состояния биомембран (Гулевский и др., 1990), возникает необходимость изучения интенсивности сврбодно-радикальных процессов, транспортных процессов и структурного состояния мембран эритроцитов при низких температурах тела. Это даст возможность судить об особенностях развития патологических и адаптационно-приспособительных реакций при гипотермии.

В последние годы получены убедительные данные, свидетельствующие о способности опиоидных пептидов, в частности, даларгина, препятствовать развитию стресса и стрессорной активации метаболических процессов (Дворцин, Шаталов, 1991; Маслова и др., 1991; Лишманов, Маслов, 1994). Наряду с анти-стрессорным эффектом даларгин обладает и антиоксидантным действием (Шлюзников и др., 1990; Короткина и др., 1992), в том числе и в условиях гипотермии (Львова и др., 1993). В условиях гипотермии даларгин оказывает и мем-браностабилизирующий эффект (Кличханов и др., 1997).

В связи с вышеизложенным представляется важным использование даларгина для коррекции изменений в мембранах эритроцитов в условиях низкой температуры тела.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось выяснение механизмов изменения структурно-функционального состояния мембран эритроцитов при гипотермии 30 и 20 °C, а также выяснение возможности химической коррекции обнаруженных изменений путём введения опиоидного гекса-пептида даларгина.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать кинетику кислотного гемолиза эритроцитов и содержание свободного гемоглобина в плазме крови крыс.

2. Исследовать интенсивность процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов по анализу содержания МДА, изменению поверхностного заряда мембран эритроцитов с помощью отрицательно заряженного зонда АНС" и пере-кисной резистентности эритроцитов.

3. Исследовать состояние транспортных процессов в мембранах эритроцитов по анализу активности Na, К-АТФазы и содержания ионов Na+ и К+ в эритроцитах и плазме крови.

4. Изучить структурные свойства мембран эритроцитов путем определения относительной микровязкости липидного бислоя, зон белок-липидных контактов и степени погруженности белков в липидный бислой. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Начальные этапы гипотермии стимулируют свободно-радикальные процессы, которые ведут к изменению структурно-функционального состояния мембран эритроцитов.

2. Опиоидный гексапептид даларгин при предварительном внутрибрюшин-ном введении препятствует активации процессов ПОЛ при умеренной гипотермии в эритроцитах и стабилизирует структурно-функциональные параметры мембран эритроцитов. Эффект даларгина зависит от глубины гипотермии.

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведены систематические исследования структурно-функциональных характеристик мембран эритроцитов крыс при гипотермии разной глубины.

Установлено, что при умеренной гипотермии, в отличие от глубокой, в мембранах эритроцитов крыс интенсифицируются процессы ПОЛ, что ведёт к дестабилизации мембран эритроцитов, ускорению внутрисосудистого гемолиза и снижению кислотной резистентности.

Обнаружено, что гипотермия разной глубины (30 и 20°С) способствует активации Na, К-АТФазы мембран эритроцитов. В то же время изменяется ионный состав эритроцитов и ионная асимметрия между эритроцитами и плазмой крови, что указывает на нарушение барьерных свойств эритроцитов при низкой температуре тела.

Впервые установлено зависимое от температуры тела, изменение структурных параметров мембран эритроцитов.

Выявлена возможность коррекции процессов ПОЛ и структурно-функциональных характеристик мембран эритроцитов при гипотермии путём внутрибрюшинного введения даларгина.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные представляют интерес для понимания механизмов патогенеза холодового повреждения, а также формирования адаптационных механизмов к действию низкой температуры на теплокровный организм. Практическая значимость данной работы определяется возможностью использования структурно-функциональных показателей для оценки тяжести холодового воздействия при гипотермии. Результаты работы указывают на возможность применения даларгина в системе лечебных и профилактических мероприятий при гипотермии.

Материалы, полученные при выполнении данной диссертации, используются в учебном процессе кафедры биохимии Дагестанского госуниверситета и Махачкалинского филиала Ростовского госуниверситета, при чтении ряда спецкурсов и больших практикумов. Методические аспекты работы включены в учебное пособие «Практикум по биохимии» (Ростов/Дон, 2001), рекомендованное для студентов университетов биологических специальностей.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на ежегодных итоговых научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава ДГУ (1997, 1998), на 12 Европейской международной нейрохимической конференции (Санкт-Петербург, 1998), на IV ассамблее университетов прикаспийских государств (Астрахань, 1999), на международной конференции посвященной 50-летию ДНЦ РАН (Махачкала, 1999), на международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), на 1-м Кавказском симпозиуме по медико-биологическим наукам (Тбилиси, 1999), на Всероссийской конференции «Химия в технологии и медицине» (Махачкала, 9.

2001), на совместном заседании кафедры биохимии и НИИ биологии ДГУ (Махачкала, 2001).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

ВЫВОДЫ.

1. Низкая температура тела приводит к снижению кислотной резистентности эритроцитов и «старению» клеток, которое выражается в накоплении в крови количества среднестойких эритроцитов и исчезновении из сосудистого русла высокостойких эритроцитов, а также существенным сокращением общего времени гемолиза. Результатом дестабилизации мембраны эритроцитов при гипотермии является и ускорение внутрисосудистого гемолиза эритроцитов.

2. Умеренная гипотермия стимулирует процессы ПОЛ мембран эритроцитов. Стимуляция ПОЛ сопровождается накоплением МДА, повышением отрицательного поверхностного заряда и снижением перекисной резистентности эритроцитов. При глубокой гипотермии интенсивность процессов ПОЛ несколько снижается по сравнению с умеренной гипотермией.

3. Исследование структурных параметров мембран эритроцитов не выявило влияния гипотермии на относительную микровязкость «общего» липида. Низкая температура тела, независимо от уровня гипотермии, снижает микровязкость зон белок-липидных контактов мембран эритроцитов. В зависимости от температуры тела изменяется погруженность белков в липидный бислой мембраны.

4. Гипотермия, и в особенности умеренная, существенно активирует Na, К-АТФазу эритроцитов. Повышение активности Na, К-АТФазы не предотвращает изменение содержания ионов Na+ и К+ в эритроцитах при гипотермии что свидетельствует об изменении барьерных свойств мембран эритроцитов при глубокой гипотермии.

5. Даларгин оказывает выраженный защитный эффект при гипотермии. Предварительное внутрибрюшинное введение даларгина снижает интенсивность ПОЛ, увеличивает кислотную резистентность и сохраняет весь спектр популяций эритроцитов в крови, удлиняет длительность гемолиза, снижает ин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящее время в медико-биологической науке внимание криобиологов сосредоточено в основном на изучении возможностей обратимого охлаждения живого. Искусственное обратимое снижение температуры тела теплокровного организма остаётся сложной проблемой, решение которой дало бы эффективное средство биологической защиты. Переносимость глубокого снижения температуры зимоспящими животными свидетельствует о принципиальной возможности решения этой проблемы.

Уже несколько десятилетий искусственная гипотермия широко применяется не только в экспериментальной биологии, но и в различных областях клинической медицины (Волколаков, Лацис, 1977; Мешалкин, Верещагин, 1985; Бабийчук и др., 1990).

Гипотермию применяют, в основном, для уменьшения потребности в энергии при низких температурах тела, что повышает выживаемость клеток тканей при гипоксических состояниях, возникающих при пережатии кровеносных сосудов (Тимофеев, 1983; Сумбатов, 1985; Эмирбеков, Львова, 1985). Однако, снижение температуры теплокровного организма небезразлично для него и имеет негативные последствия.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что патологическое действие низкой температуры на теплокровный организм реализуется через изменение клеточной мембраны (Шепелев и др., 1984; Эмирбеков, Львова, 1985; Гулевский и др., 1988).

Удобным объектом для выяснения участия клеточных структур в адаптивном ответе является эритроцит, вследствие известной простоты его внутриклеточной организации и возможности получения плазматической мембраны в наиболее чистом виде (Морозова, Репина, 1990).

Ряд авторов (Шепелев и др., 1984; Василькова, Кухта, 1988; Линчевская, Кондратьева, 1989) считают, что активация свободно-радикальных процессов может быть одним из пусковых механизмов развития гипотермической патологии. Для оценки роли свободно-радикальных процессов при гипотермии нами была исследована интенсивность процессов ПОЛ в эритроцитах. Оказалось, что при умеренной гипотермии содержание одного из промежуточных продуктов ПОЛ МДА увеличивается почти 1,5 раза. Эти результаты свидетельствуют об активации процессов пероксидации липидов мембран эритроцитов при гипотермии 30 °C.

Интенификация процессов ПОЛ в эритроцитах при умеренной гипотермии может быть связано с повышенным образование активных форм кислорода как в самих эритроцитах, так и в плазме крови под действием низкотемпературного стресса. Снижение концентрации восстановленного глутатиона, а также НАД Н2 в эритроцитах при умеренной гипотермии (Василькова, 1988), может способствовать окислению гемоглобина в метгемоглобин и генерации супероксида.

Установлено, что каталаза и НАД Н2 защищают эритроциты от кратковременной экзогенной перекиси водорода, а восстановленный глутатион необходим для защиты от постоянного низкого уровня перекиси водорода и радикалов кислорода, образующихся эндогенно (Dumaswala et al., 1999).

Снижение уровня восстановленного глутатиона указывает, с одной стороны, на его расходование в реакциях ПОЛ, с другой может быть одним из факторов способствующий интенсификации ПОЛ.

Как установлено (Ситожевский и др., 1997) гемовое и негемовое железо эритроцитов участвуют в разложении гидропероксидов в липидной фазе, в реакции подобной реакции Фентона. Как полагают, негемовое железо в эритроцитах находится в железосвязывающих центрах, локализованных на цитоплазти-ческой стороне плазматической мембраны эритроцита в связанном с отрицательно заряженными фосфолипидами (фосфатидилсерин, фосфатидилэтанола-мин). Считают, что содержание негемового железа в мембране, в основном, определяет интенсивность ПОЛ и устойчивость к оксидативному стрессу (Ситожевский и др., 1997).

При умеренной гипотермии и в плазме крови усиливаются процессы ПОЛ (Эмирбеков и др., 1995).

Важную роль в активации ПОЛ в плазме крови при умеренной гипотермии играет гемовое и негемовое железо, концентрация которых возрастает в крови 3−4 раза (Халилов и др., 1998). Другим источником свободных радикалов кислорода может служить реакция окисления адреналина в адренохром. При умеренной гипотермии в плазме крови многократно возрастает содержание адреналина и норадреналина (Шкестерс и др., 1991; Козырева и др., 1999).

В тоже время при глубокой гипотермии интенсивность процессов ПОЛ в эритроцитах снижается до контрольного уровня. Причиной снижения содержания МДА при глубокой гипотермии может быть, с одной стороны, торможение генерации свободных радикалов из-за низкой температуры, с другой — с мета-болизацией МДА в эритроцитах (Банкова и др., 1988). Кроме того снижение концентрации МДА в эритроцитах возможно связано частично с участием в образовании межмолекулярных сшивок (Костюк и др., 1984) в мембранах, частично с вымыванием этого альдегида из мембраны, как гидрофильное соединение.

В норме мембрана эритроцита устойчива к окислительному стрессу. Это достигается как за счёт структурной организации мембраны, так и за счёт наличия в ней липофильных антиоксидантов. Анализ перекисной резистентности позволяет оценить нативность мембраны и её обеспеченность антиоксиданта-ми. Исследование перекисного гемолиза эритроцитов выявило снижение перекисной резистентности эритроцитов при гипотермии. Оказалось, что чем ниже температура тела тем ниже устойчивость эритроцитов к активным формам кислорода. Эти результаты свидетельствуют о том, что при гипотермии снижается обеспеченность мембран эритроцитов токоферолом (Воскресенский, Туманова, 1982). Большая доступность липидов мембран эритроцитов гипотермирован-ных животных активным формам кислорода в условиях in vitro свидетельствует о нарушении упаковки липидного бислоя мембран эритроцитов в результате активации их фосфолипазного гидролиза. В результате действия фосфолипаз или ПОЛ мембрана приобретает отрицательно заряженные группы (Владимиров, 1989). Исследование взаимодействия отрицательно заряжённого зонда АНС" с мембранами эритроцитов подтвердил факт повышения поверхностного отрицательного заряда мембран эритроцитов при гипотермии. Существенную роль в повышении отрицательного поверхностного заряда на мембране при гипотермии играет появление в мембране гидрофильных продуктов, а также свободных жирных кислот (Линчевская, Кондратьева, 1989). При ПОЛ биологических мембран, наряду с повреждением липидного слоя, происходит модификация мембранных белков, что оказывается небезразличным для проницаемости мембран. В первую очередь при ПОЛ поражаются сульфгидрильные группы белков как напрямую, в реакциях SH-групп со свободными радикалами, так и ферментативным путём, с участием фермента глутатионпероксидазы и гидроперекисей липидов (Владимиров, 1989). При гипотермии обнаружено повышение окислительной модификации как плазменных, так и мембранных белков эритроцитов (Эмирбеков и др., 1995; Кличханов и др., 1998).

Пероксидация липидов и окислительная модификация мембранных белков является причиной старения эритроцитов (Козлова и др., 1998). При гипотермии нами выявлено ускоренное старение эритроцитов. Так, при гипотермии как при умеренной, так и глубокой значительно увеличивается процентное содержание среднестойких эритроцитов на фоне снижения повышенностойких и высокостойких форм. Популяция сверхвысокостойких эритроцитов, при этом, исчезает из кровяного русла. Нужно отметить, что более выраженные изменения в качественном составе эритроцитов наблюдается при гипотермии 20 °C.

Активация ПОЛ, фосфолипазного гидролиза и окисление SH-групп мембранных белков способствует появлению катионной проницаемости у мембран эритроцитов, что приводит к их коллоидно-осмотическому гемолизу (Владимиров, 1989). О том, что при низкой температуре увеличивается количество гемо-лизирующихся эритроцитов свидетельствуют данные В. И. Кидалова и В.Ф.

Лысака (1987). Они с помощью электронной микроскопии установили друкрат-ное увеличение гемолизирующих форм эритроцитов в крови крыс при гипотермии. Помимо повышения концентрации свободного гемоглобина при гипотермии в плазме крови также увеличивается содержание железа (Кличханов и др., 1997). Как гемовое, так и негемовое железо, участвуя в реакциях Фентона, генерирует свободные радикалы кислорода (Владимиров и др., 1991), что служит дополнительным фактором инициации свободно-радикального окисления белков и липидов плазмы и форменных элементов крови при гипотермии. Кроме того, гемоглобин и его продукты деструкции, разносимые кровью, попадая в ткани, могут служить центрами радикалообразования в этих тканях.

Активация процессов ПОЛ влияет на структурно-функциональные свойства мембран клеток. Нами показано, что коэффициент эксимеризации пирена при исследованных нами уровнях гипотермии не меняется. По-видимому, ли-пидная фаза мембраны эритроцитов, в котором расстворены молекулы зонда, сама по себе не претерпевает существенных изменений при гипотермии (табл. 7, рис. 8).

В тоже время зависимо от уровня гипотермии изменяется другой параметр — коэффициент эксимеризации пирена F3/FM (282), характеризующий текучесть аннулярных липидов мембран (Владимиров, Добрецов, 1980). При гипотермии 30 °C коэффициент эксимеризации пирена повышается на 32%, а при гипотермии 20 °C на 50%.

Таким образом, полученные нами результаты указывают на зависимое от температуры тела снижение микровязкости зон белок-липидных контактов, или повышение текучести аннулярных липидов.

Исследование интенсивности безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения с тринтофановых остатков мембранных белков на пирен при гипотермии 30 °C выявило снижение эффективности переноса энергии (F0-F)/Fo с белков на пирен на 32%, что может быть следствием структурных перестроек в мембранных белках эритроцитов. При глубокой гипотермии, в отличие от умеренной, эффективность переноса энергии с триптафановых остатков мембранных белков на пирен возрастает.

Можно предположить, что при умеренной гипотермии уменьшается степень погружености мембранных белков в липидный бислой. Причиной уменьшения погруженности белков в липидный бислой может быть появление на поверхности мембранных белков гидроперекисных группировок. Известно, что под действием АФК белки подвергаются окислительной модификации (Gebicki, Gebicki, 1993; Gebicki, 1997). В то же время АФК и поперечно-сшивающие продукты ПОЛ, избыточно образующиеся в крови при гипотермии, могут приводить к олигомеризации мембранных белков.

Поскольку известно, что окислительно модифицированные белки легче и быстрее гидролизуются специфическими протеиназами (Stadtman, 1992), можно предположить, что возрастание эффективности переноса энергии электронного возбуждения с трипфановых остатков мембранных белков на пирен при гипотермии 20 °C связано с диссоциацией мембранных белков за счёт активации эндогенных протеиназ, с одной стороны, и увеличением погружения мембранных белков в липидный бислой, с другой.

Таким образом, при гипотермии наблюдается изменение структурной организации мембран эритроцитов крыс, которое проявляется в изменении структурных перестроек в мембранных белках. Такие изменения в мембранах в первую очередь отражается на работе интегральных белков и ферментов. Одним из важных интегральных ферментов мембран эритроцитов является Na, К-АТФаза, участвующая в регуляции ионного гомеостаза в клетке. Нами обнаружено, что гипотермия как умеренная, так и глубокая приводит к возрастанию активности Na, К-АТФазы мембран эритроцитов. Однако, при гипотермии 20 °C активность Na, К-АТФазы снижена по сравнению с гипотермией 30 °C, хотя остаётся достоверно выше контроля.

Важным регулятором активности Na, К-АТФазы является холестерин. Включение холестерина в мембраны эритроцитов приводит к повышению микровязкости мембранных липидов и уменьшению активности Na, К-АТФазы (Торховская и др., 1980; Халилов и др., 1982; Таганович и др., 1985). В то же время снижение содержания холестерина в мембранах эритроцитов сопровождалось уменьшением микровязкости мембран и возрастанием активности Na, К-АТФазы мембран эритроцитов (Бородин, 1986).

Данные А. А. Линчевской и Л. А. Кондратьевой (1989) свидетельствуют о том, что при гипотермии достоверно снижается содержание холестерина в мембранах эритроцитов крыс. При этом соотношение холестерин/фосфолипид снижается с 0,6 в норме до 0, 52 при гипотермии. Исходя из этого, можно думать, что повышение активности Na, К-АТФазы, обнаруженное нами при гипотермии, частично связано со снижением холестерина в мембранах эритроцитов. Снижение микровязкости зон белок-липидных контактов, обнаруженное нами при гипотермии, видимо, также отражает снижение в этих зонах содержания холестерина. Известно, что при гипотермии в мембранах эритроцитов увеличивается содержание ненасыщенных жирных кислот (Шепелев, 1978). Учитывая важность низкой вязкости аннулярных липидов в функционировании Na, К-АТФазы, вышеприведённые результаты в какой то мере объясняют повышение активности Na, К-АТФазы при гипотермии.

Na, К-АТФаза является тиоловым ферментом и содержит 34 SH-группы на каталитическую субъединицу (Модянов и др., 1988). Для фермента важно поддержание тиоловых групп в восстановленном состоянии (Чеснокова, Ку-ляш, 1985). Восстановленное состоянии сульфгидрильных групп мембранных белков обеспечивается глутатионовой системой эритроцитов (Кулинский, Ко-лесниченко, 1990). По данным Т. В. Васильковой (1988) при гипотермии 33−34°С в эритроцитах снижается содержание GSH на 14%. Однако, активность ферментов, участвующих в восстановлении глутатиона-глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при этом повышалось. Гипотермия 24−25°С не изменяет содержание глутатиона, но достоверно снижает активности глутати-онредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах. Можно предподожить, что небольшое снижение глутатиона восстановленного в эритроцитах при умеренной гипотермии отражает его участие в восстановлении тиоловых групп мембранных белков, в том числе и Na, КАТФазы.

Хотя активность Na, К-АТФазы эритроцитов при гипотермии повышается, это однако не способствует стабилизации уровня ионов Na+ и К+ в эритроцитах. Так, при гипотермии концетрация ионов Na+ повышается, а концентрация ионов К+ снижается в эритроцитах.

Одной из причин нарушения ионного гомеостаза эритроцитов при гипотермии может являться разобщение АТФ-гидролизующей и ион-транспортирующей функции Na, К-АТФазы. Разобщение гидролиза АТФ Na, К-АТФазой с активным транспортом ионов было обнаружено при развитии окислительного стресса (Болдырев и др., 1995). Другой возможной причиной нарушения ионного состава эритроцитов при гипотермии может быть появление каналов утечки для ионов Na+ и К+. Установлено, что увеличение пассивной проницаемости для ионов зависит от интенсивности процессов ПОЛ в мембране (Атауллаханов и др., 1986).

Таким образом, гипотермия приводит к активации Na, К-АТФазы эритроцитов. Однако это не приводит к стабилизации уровня ионов Na+ и К+ в эритроцитах при низких температурах тела.

Анализируя полученные нами результаты можно заключить, что на начальных этапах гипотермии существенно ускоряются процессы свободно-радикального окисления. Под действием АФК происходит активация процессов ПОЛ как в плазме, так и форменных элементах крови. Повышенный уровень ПОЛ мембран эритроцитов ответственен за структурно-функциональные изменения мембран этих клеток.

Одной из основных причин активации ПОЛ при гипотермии является развитие низкотемпературного стресса. Поэтому для коррекции свободно-радикальных процессов при гипотермии целесообразно использовать препараты обладающие стресс-лимитирующими свойствами. Одним из таких препаратов является синтетический аналог лей-энкефалина — гексапептид даларгин (Маслова и др., 1991; Дворцин, Шаталов, 1991; Лишманов и др., 1997).

Наши результаты свидетельствуют о том, что введение даларгина способствует предотвращению активации процессов ПОЛ эритроцитов при гипотермии. Так, у крыс с температурой тела 30 °C даларгин достоверно снижает содержание МДА в эритроцитах по сравнению с гипотермией без введения этого пептида. В условиях глубокой гипотермии, на фоне введения даларгина полностью нормализуется уровень МДА в эритроцитах.

О том, что даларгин предотвращает ПОЛ при гипотермии свидетельствует также данные о его влиянии на поверхностный заряд эритроцита. Даларгин предотвращает повышение отрицательного поверхностного заряда эритроцитов при гипотермии.

Поскольку в условиях окислительного стресса повышение отрицательного поверхностного заряда связано с появлением гидрофильных продуктов ПОЛ (Владимиров, 1989), то отсутствие изменения поверхностного заряда на фоне введения даларгина свидетельствуют о торможении образования свободных радикалов этим пептидом при низких температурах тела.

Помимо предотвращения активации свободно-радикальных процессов даларгин предотвращает снижение перекисной устойчивости эритроцитов при низких температурах тела. Защитное действие даларгина на перекисную резистентность эритроцитов, возможно, связано с ограничением процессов ПОЛ, в результате чего сохраняются запасы антиоксидантов в клетках тканей при низкой температуре.

Поскольку процессы ПОЛ существенно влияют на структурные свойства липидов биомембран (Владимиров, 1989), то интерес представляет исследование влияния даларгина на микровязкость липидного бислоя эритроцитарных мембран. Оказалось, что как у контрольных так и у животных с низкой температурой тела даларгин не влияет на микровязкость липидной фазы мембраны эритроцита. В то же время даларгин оказывает влияние на микровязкость белок-липидных зон мембраны эритроцита. Так, у контрольных животных при введении даларгина наблюдается тенденция к снижению микровязкости аннулярных липидов. Однако в условиях гипотермии даларгин предотвращает снижение микровязкости зон белок-липидных контактов. Таким образом, даларгин стабилизирует белок-липидные контакты в мембранах эритроцитов при гипотермии.

Вышеприведённые данные свидетельствуют о том, что при гипотермии существенно не ускоряются процессы ПОЛ в общей липидной массе мембраны эритроцита. В то же время, аннулярные липиды более подвержены ПОЛ при гипотермии, что может быть связано с увеличением доступности их для проок-сидантов из-за нарушения белок-липидных взаимодействий под действием низкой температуры тела.

Важную роль во взаимодействии белков и липидов в мембране играет структура и площадь гидрофобной поверхности белков, которые определяют степень погруженности их в липидный бислой мембраны.

Даларгин предотвращает зависимое от температуры тела изменение степени погружения белков в липидный бислой эритроцитов при гипотермии, что свидетельствует об определённом стабилизирующем влиянии даларгина на структуру и комформацию мембранных белков при гипотермии. Стабилизирующее влияние даларгина на структуру мембранных белков, возможно, связано с предотвращением окислительной модификации белков из-за снижения уровня АФК и продуктов ПОЛ.

Исследование кинетики кислотного гемолиза эритроцитов также свидетельствуют о стабилизации белковых и липидных компонентов мембран эритроцитов даларгином при гипотермии. У животных с температурой тела 30 и 20 °C данный пептид способствует частичной нормализации эритрограммы. Это выражается в сохранении в кровяном русле высокостойких и сверхвысокостой-ких эритроцитов и в удлинении общего времени гемолиза, по сравнению с гипотермией без введения этого пептида. Нормализация кислотной резистентности эритроцитов при введении даларгина частично может быть связано с предотвращением окислительной модификации белковых и липидных компонентов мембран эритроцитов при низких температурах тела. Однако это може быть связано также с предотвращением даларгином стресс-индуцированной полици-темии. На это указывает гот факт, что предварительно введённый даларгин препятствует повышению гематокрита, вызванное гипотермией.

Изменение микровязкости аннулярных липидов под действием даларгина может оказать влияние на активность мембраносвязанных ферментов. Исследование активности Na, К-АТФазы, активность которой существенно зависит от липидного окружения, показало, что даларгин полностью предотвращает активацию фермента, вызываемое умеренной гипотермией. Стабилизация активности Na, К-АТФазы при умеренной гипотермии под действием даларгина способствует нормализации ионного состава эритроцитов. Снижение степени внутрисосудистого гемолиза эритроцитов при умеренной гипотермии на фоне введения даларгина, видимо, также связано в определённой степени со стабилизацией ионного состава эритроцитов и осмотического давления внутри клеток.

Эти результаты свидетельствуют о том, что даларгин препятствует повышению пассивного транспорта ионов в эритроцитах.

Стабилизация ионного состава эритроцитов при умеренной гипотермии даларгином, по-видимому, связана с тем, что этот пептид препятствует избыл i точному вхождению ионов в эритроциты (Лишманов, Маслов, 1994), в результате чего, с одной стороны, предотвращается открытие Са2±зависимых калиевых каналов (Асланиди и др., 1997), а с другой, активация внутриклеточных фосфолипаз (Белоус, Бондаренко, 1981).

В отличии от умеренной, при глубокой гипотермии даларгин не предотвращает активацию Na, К-АТФазы эритроцитов, не препятствует изменению ионного состава эритроцитов, а также не предотвращает внутрисосудистый гемолиз эритроцитов.

Таким образом, эффект даларгина зависит от глубины гипотермии.

Отсутствие защитного эффекта даларгина при глубокой гипотермии может быть связано с рядом причин. Во-первых, при глубокой гипотермии время проходящее с момента инъекции даларгина значительно больше (90 мин) чем при умеренной (50 мин). Учитывая тот факт, что даларгин циркулирует в крови непродолжительное время, а в последующим гидролизуется специфическими пептидазами, можно сказать, что к моменту наступления глубокой гипотермии эффективная концентрация даларгина в крови существенно уменьшается. Во-вторых, известно, что даларгин действует на ткани через специфические рецепторы (Лишманов и др., 1997). В многих работах показано, что при низких температурах тела существенно снижается или полностью теряется чувствительность рецепторов к своим лигандам (Плотников и др., 1987). Можно предположить, что при глубокой гипотермии опиоидные рецепторы теряют чувствительность к лигандам. Потеря чувствительности опиоидных рецепторов к да-ларгину при глубокой гипотермии может быть связано с изменением липидного микроокружения и активацией процессов ПОЛ (Мальцева и др., 1991; Белоко-неваи др., 1991).