Разработка методических приемов повышения гигиенической надежности санитарно-бактериологических методов анализа воды

Обеспечение эпидемической безопасности водопользования в отношении кишечных инфекций, распространяющихся водным путем, является первостепенной задачей микробиологического контроля качества воды. Надежность системы контроля, как основы профилактических мероприятий, обусловлена научно-обоснованными показателями и эффективными методами обнаружения и количественного учета возбудителей кишечных инфекций и их индикаторов [84, 109, 112, 113].

Вместе с тем до настоящего времени отмечаются вспышки кишечных инфекций при соответствии качества воды установленным требованиям [80, 82] Это может быть связано с появлением устойчивых штаммов патогенных бактерий, их способностью к размножению, в частности сальмонелл, в чистых водах, и как результат — с нарушением количественных соотношений индикаторных и патогенных бактерий [30, 85]. Поэтому требуется совершенствование существующей нормативно-методической базы в направлении повышения адекватности оценки эпидемической безопасности водопользования.

В этом направлении, а также с целью унификации с международным сообществом, в последние годы происходит пересмотр нормативных требований к качеству воды по бактериологическим показателям, что определяет необходимость разработки и стандартизации методов определения бактериологических показателей: колиформные бактерии и глюкозоположительные колиформные бактерии, как основные надежные индикаторные показатели эпидемической опасности водопользованияEscherichia coli, как показатель фекального загрязнения водных объектов.

Методы, утвержденные в МУК 4.2.1018−01 [121], по ряду параметров не отвечают современному уровню: длительные сроки анализа (2−3 суток) — низкая воспроизводимость результатов из-за субъективной выборки колонийотсутствие учета изменчивости культуральных и биохимических свойств бактерий. Аналогичные проблемы существуют и в международных методических документах (ИСО 9308−1:2000) [43].

Кроме того, низкое качество выпускаемых отечественными производителями питательных сред требует разработки способов повышения их чувствительности, ростовых качеств, дифференцирующих свойств в целях увеличения надежности бактериологического анализа.

Перспектива разработки ускоренных методов определения колиформных бактерий заключается в использовании на этапе идентификации специфичности их ферментативных свойств [236]. Отсутствие фермента цитохромоксидазы у представителей семейства Enterobacteriaceae дает возможность их надежной дифференциации с посторонней водной оксидазоположительной микрофлорой. Однако, представление о бактерицидности оксидазных реактивов препятствует эффективному внедрению в методические документы экспрессного теста определения оксидазной активности бактерий непосредственно на мембранном фильтре. Разработка ускоренных методов определения Escherichia coli может быть основана на наличии у этих бактерий специфических ферментовглюкуронидазы и триптофаназы.

Метод определения спор Clostridium perfringens, предложенный в Директиве 98/83/ЕС [35], сложен в выполнении, требует наличия анаэростата, делает методику малопригодной для выполнения рутинных анализов практическими лабораториями, в связи с чем возникает необходимость совершенствования метода выделения спор сульфитредуцирующих клостридий для повышения эффективности обнаружения анаэрбных бактерий в условиях обычного термостатирования.

Разработка в настоящее время новых средств обеззараживания воды ставит задачу увеличения надежности оценки их эффективности с учетом изменения биологических свойств микроорганизмов, на которых основаны методы их индикации [6, 39, 128]. Основная проблема связана с возникновением стрессированных форм бактерий после недостаточно эффективного обеззараживания, которые не определяются общепринятыми методами, и контролирующие органы не получают достоверную информацию о безопасности воды. В дальнейшем при благоприятных условиях происходит реактивация — восстановление жизнеспособности стрессированных бактерий, что создает возможность эпидемических осложнений [12, 96, 137].

На основании вышеизложенного целью работы являлось хсовершенствование санитарно-бактериологических методов анализа воды, направленное на повышение чувствительности, точности, экспрессности, эпидемической надежности и обеспечивающее соответствие международному уровню, с учетом изменчивости биологических свойств и способности к реактивации бактерий после обеззараживания воды.

Задачи исследования:

1.Обосновать параметры экспрессного теста определения оксидазной активности и разработать на его основе ускоренные методы индикации колиформных бактерий в воде.

2.Модифицировать ускоренные методы определения Escherichia coli, основанные на специфичности ферментативной активности бактерий.

3.Усовершенствовать метод индикации спор сульфитредуцирующих клостридий в воде в условиях обычного термостатирования.

4.Разработать методические приемы повышения гигиенической надежности оценки эффективности процессов обеззараживания воды.

Научная новизна работы.

Впервые установлены количественные зависимости степени ингибирования ферментативных реакций колиформных бактерий от типа оксидазного реагента, используемого в экспрессном тесте определения оксидазной активности, продолжительности контакта бактерий с ним, а также длительности последующего пребывания на питательной среде.

Впервые выявлена зависимость способности бактерий к реактивации после обеззараживания воды от вида и дозы реагента, времени экспозиции.

Обоснована необходимость учета индикаторных и патогенных бактерий с измененными культуральными и биохимическими свойствами для повышения гигиенической надежности оценки обеззараживания воды. Определены признаки, характеризующие изменчивость Escherichia coli, сальмонелл, энтерококков, стафилококков.

Практическая значимость.

На основании экспериментальных и натурных исследований оптимизирована система санитарно-бактериологического контроля качества воды различного вида водопользования в направлении повышения её эпидемической надежности.

Разработан ускоренный метод индикации в воде основных нормируемых показателей — колиформных бактерий на основе совершенствования экспрессного теста определения оксидазной активности. Метод позволяет получать ответ через 18−24 часа (вместо 2−3 суток).

Разработаны эффективные и экономичные ускоренные методы определения колиформных бактерий, Escherichia coli и спор сульфитредуцирующих клостридий с использованием отечественных питательных сред.

Разработанные методы включены, наряду с международными, в ГОСТ Р 52 426 — 2005 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть I. Метод мембранной фильтрации» (справка № 343−05 от 07.02.2007).

Материалы диссертационной работы использованы при подготовке проекта МУ «Санитарно-эпидемиологическая экспертиза средств дезинфекции воды» (справка №.11−5/279 от 12.05.2009).

Результаты диссертационной работы включены в программу циклов повышения квалификации, проведенных в 2006 — 2009 гг. для специалистов бактериологических лабораторий Роспотребнадзора и Водоканалов РФ по обучению методам санитарно-микробиологического контроля качества воды различного назначения. (Акт исх. № 01−6/274 от 12.05.2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Зависимость степени ингибирования ферментативных реакций колиформных бактерий от типа оксидазного реагента, используемого в экспрессном тесте определения оксидазной активности. Методические приемы по устранению негативного влияния диметил-п-фенилендиам ина дигидрохлорида с а-нафголом.

2. Модификация методов определения колиформных бактерий, Е. coli, спор сульфитредуцирующих клостридий в воде с учетом специфичности их ферментативной активности и культуральных свойств.

3. Методические подходы для адекватной оценки эффективности обеззараживания воды с учетом реактивации и изменчивости свойств индикаторных и патогенных бактерий.

выводы.

1. Научно обоснованы алгоритмы экспрессного теста определения оксидазной активности одновременно всех бактерий, выросших на мембранном фильтре (1−4 мин вместо 24 ч). Показано, что оксидазный реактив 1% водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина не оказывает влияния на жизнеспособность и ферментативную активность бактерий Escherichia coli после контакта в течение 2 часов. Комплексный реактив диметил-п-фенилендиамин за счет а-нафтола подавляет биохимическую активность бактерий через 5 мин воздействия. Изменение соотношения 1% спиртового раствора а-нафтола (2,5 части) и 1% водного раствора диметил-п-фенилендиамина (7,5 частей), уменьшение допустимого времени контакта с реактивом до 4-х минут, обратный перенос мембранного фильтра на питательную среду устраняют негативное влияние комплексного реактива на бактерии Escherichia coli.

2. В сравнительных исследованиях на основе предложенных алгоритмов экспрессного теста определения оксидазной активности разработаны ускоренные методы определения колиформных бактерий, общих колиформных бактерий, глюкозоположительных колиформных бактерий, которые ускоряют анализ воды по сравнению с отечественным методом на двое суток (24−28 ч вместо 72 ч) и по сравнению с международным методом на сутки (24 ч вместо 48 ч).

3. Совместное определение колиформных бактерий и Escherichia coli на хромогенных средах, избирательно Escherichia coli — на модифицированной двуслойной среде, состоящей из триптон-желчного агара и питательного агара с добавлением 1 г/л триптофана, ускоряет микробиологический анализ с 48 часов до 18−24 часов. При использовании хромокульт кольформ агара допустима фильтрация воды только на мембранах из нитрата целлюлозы или из смеси ацетатов целлюлозы.

4. Добавление к железо-сульфитному агару восстановителя тиогликолята натрия в количестве 1 г/л позволило повысить на 36−55% эффективность выделения спор сульфитредуцирующих клостридий из воды в условиях обычного термостатирования.

5. Установлена реактивация колиформных бактерий и сальмонелл через 24 часа после обеззараживания как воды поверхностного источника гипохлоритом натрия в дозе 1 мг/л и диоксидом хлора в дозах 2, 3 мг/л, так и сточных вод гипохлоритом натрия в дозе 5 мг/л. Гуанидинсодержащий препарат в дозах 0,24 и 0,5 мг/л вызывает реактивацию в отношении ОМЧ через 24 часа и Pseudomonas aeruginosa через 48 часов. После фотообеззараживания с использованием метиленового голубого восстановление жизнеспособности Staphylococcus aureus отмечено через 5 суток в концентрации 0,25 мг/л, Escherichia coli и Enterococcus faecalis — через 5 суток в концентрации 0,5 мг/л, Salmonella infantis spp. — через 1 сутки в концентрации 2 мг/л. Бактериостатический эффект дезинфектантов проявляется в реактивации стрессированных бактерий после зафиксированного их отсутствия, что вызывает необходимость оценивать эффективность обеззараживания при изучении новых средств и подборе режимов обработки воды в течение 1−5 суток.

6. Неполное бактерицидное действие дезинфектантов приводит к адаптивной изменчивости культуральных и биохимических свойств индикаторных и патогенных бактерий — Escherichia coli, сальмонелл, энтерококков, стафилококков. Адекватность гигиенической оценки эффективности обеззараживания воды повышается за счет удлинения срока инкубации посевов до 5 суток, учета не характерных для тест-микроорганизмов колоний на дифференциальных средах, выполнения пассирования подозрительных колоний через оптимальные жидкие и плотные среды, использования нескольких методов посева.

ГЛАВА 8.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ИССЛЕДОВАНИЯ.

Обеспечение эпидемической безопасности в отношении кишечных инфекций, распространяющихся водным путем, является первостепенной задачей. Совершенствование методической базы контроля качества воды по микробиологическим показателям является одной из актуальных проблем в решении этой задачи. Быстрое получение ответа о микробном загрязнении воды является основой проведения своевременных профилактических мероприятий. Кроме того, повышение надежности результата бактериологического анализа, адекватности оценки процессов очистки и обеззараживания невозможно без учета изменчивости бактерий под воздействием неблагоприятных факторов, в том числе обеззараживающих реагентов.

Основное направление работы заключалось в разработке и усовершенствовании методов, повышающих скорость, надежность микробиологического контроля и адекватность оценки качества воды различного вида водопользования, а таюке эффективности обеззараживания питьевых и сточных вод.

Для определения степени бактерицидности оксидазных реактивов и их влияния на биохимическую активность колиформных бактерий в экспериментальных исследованиях изучено два реактива, которые альтернативно используют при постановке оксидазного теста: 1.1% водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида (ТМ) рекомендуется как в отечественных, так и в международных (ИСО 93 081:2000) [43] методических документахП. 1% водный раствор диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида и 1% спиртовой раствора а-нафтола в соотношении 7:3 (ДМ) — рекомендуется в МУК 4.2.1018−01 [121].

Эксперименты проводили на модели тест-микроорганизма Escherichia coli 1257, как основного представителя колиформных бактерий. Мембранные фильтры с выросшими на них колониями накладывались колониями вверх на смоченную оксидазным реактивом фильтровальную бумажку. Время воздействия реактива составляло 2- 5- 30- 60 и 120 минут. После контакта с реактивом способность бактерий Е. coli к ферментации лактозы до кислоты и газа определяли путем посева в пробирки с полужидкой средой Гисса с лактозой и последующей инкубацией посевов при температуре 37 °C. Контролем служили результаты определения скорости ферментативных реакций бактерий E. coli, не подвергнутых действию реактива.

После выдерживания на реактиве ТМ реакция ферментации лактозы бактериями Е. coli развивалась с той же скоростью, что и в контроле (Р>0,05). Признаки роста и образование кислоты отмечали уже через 1 час после посева в пробирки со средой Гисса с лактозой. Начало газообразования наблюдалось через 2 часа во всех вариантах опыта, кроме бактерий, подвергшихся действию ТМ в течение 120 минут. Реакция ферментации полностью завершилась через 3 ч у бактерий, контактировавших с ТМ в течение 2 мин, через 4 ч — в контроле и после контакта с ТМ в течение 5 и 30 мин, через 5чпосле 120-минутного воздействия ТМ. Таким образом, реактив ТМ не оказывал влияния на скорость роста и биохимическую активность бактерий Е. coli даже при длительном контакте в течение двух часов.

После контакта бактерий с реактивом ДМ в интервале времени от 2 до 5 минут ферментация лактозы начиналась и заканчивалась на 1 и 2 часа позже, соответственно, по сравнению с контролем. Однако, различия с контролем у бактерий после контакта с ДМ в течение 2 мин являлись не достоверными (Р>0,05), тогда как у бактерий, контактировавших с ДМ в течение 5 мин, отличия статистически значимы (Р < 0,01).

Более продолжительный контакт с реактивом в течение 30 — 60 минут оказывал существенное бактериостатическое (в 40−60% посевов) и частичное бактерицидное действие, а после 120 минут контакта — полностью бактерицидное действие в 100% посевов. При этом существенно возросла продолжительность ферментации лактозы — до 24 ч, в то время как в контроле биохимическая реакция полностью завершалась через 4 ч.

Изучение воздействия оксидазных реактивов на биохимическую активность бактерий Е. coli, выросших на лактозном агаре с тергитолом, который рекомендован ИСО 9308−1:2000, подтвердило закономерности, полученные при выращивании бактерий на агаре Эндо, рекомендуемом МУК 4.2.1018−01.

Следующий этап работы заключался в разработке методических приемов по снижению влияния реактива ДМ на биохимическую активность бактерий Е. coli. Через 1, 2, 3, 4 и 5 минут контакта с реактивом ДМ мембранные фильтры переносили обратно на агар Эндо или лактозный агар с тергитолом. Посев бактерий на среду Гисса с лактозой проводили сразу же после переноса фильтра на питательную среду, через 5, 30 и 60 минут.

Как видно из таблицы 2, при времени контакта с реактивом ДМ в пределах 1−4 минут и посеве колоний на среду Гисса с лактозой сразу же после переноса мембранного фильтра с бактериями обратно на питательную среду, а также через 5−60 мин статистически значимых различий между контрольным и опытными вариантами не обнаружено (Р>0,05). Полученные результаты доказывают, что более длительное, по сравнению с рекомендуемым в МУК 4.2.1018−01, пребывание мембранного фильтра, пропитанного оксидазным реактивом ДМ, на питательной среде не оказывает влияние на биохимические свойства бактерий Е. coli.

При контакте бактерий, выросших на агаре Эндо, на фильтре с реактивом ДМ в течение 5 минут, как это допускается в МУК 4.2.1018−01, ингибирующее действие реактива сохранялось сразу после переноса фильтра с бактериями на агар Эндо и через 5 мин пребывания на среде. Различия между контрольным и опытным вариантами являлись статистически значимыми (Р < 0,05). При более длительном выдерживании фильтра на среде в течение 30 и 60 минут негативное действие реактива прекращалось, и биохимическая активность бактерий восстанавливалась.

После контакте бактерий, выросших на лактозном агаре с тергитолом, с реактивом на фильтре в течение 5 минут начало ферментации лактозы достоверно задерживалось на 60 мин (Р < 0,01). Дальнейшее выдерживание фильтра на среде после 5-ти минутного контакта с оксидазным реактивом не привело к существенному сниженшо времени ферментации лактозы (Р<0,01). Это может быть объяснено тем, что лактозный агар с тергитолом является менее ингибиторной средой, чем агар Эндо, и воздействие реактива ДМ на выросшие на нем бактерии более выражено.

Таким образом, в экспериментах с использованием двух питательных сред (агара Эндо и лактозного агара с тергитолом) доказано, что торможение биохимической активности Е. coli оксидазным реактивом ДМ может быть предотвращено в случае контакта мембранного фильтра с реактивом в пределах 4 минут и дальнейшего нахождения на питательной среде без ограничения времени, но не менее 5 минут.

С целью обоснования рекомендаций по уменьшению неблагоприятного действия реактива ДМ на жизнедеятельность бактерий проведены исследования по изучению влияния компонентов реактива на жизнедеятельность бактерий. Основная составная часть реактива ДМ — 1% водный раствор диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида не влияет на ферментативные свойства бактерий Е. coli даже при длительном в течение 1 часа времени контакта. Другая составная часть реактива — 1% спиртовой раствор а-нафтола в соотношении с водой 3:7 при контакте с бактериями E. coli уже в течение 2,5 и 5 минут достоверно задерживал время ферментации лактозы. В то же время, при соотношении спиртового раствора а-нафтола и воды 2,5: 7,5 не выявлено влияния испытуемой смеси в течение этого же периода экспозиции на биохимические свойства бактерий.

Для оценки влияния мембранных фильтров, используемых в практике бактериологического контроля, на биохимическую активность бактерий E. coli использовано три типа фильтров: «Владипор» из смеси ацетатов целлюлозы, «Владисарт» из нитрата целлюлозы и «Владисарт» из ацетата целлюлозы.

При соблюдении рекомендуемого времени контакта с оксидазным реактивом ДМ до 4 мин статистически достоверных отличий от контроля для всех марок фильтров не выявлено (Р>0,05). Некоторое незначительное различие во влиянии фильтров на ферментативную активность могут быть связаны с особенностями структуры мембран, которые влияют на степень проникновения оксидазного реактива. Полученные результаты свидетельствуют о допустимости применения исследованных мембранных фильтров для выполнения экспрессного теста определения оксидазной активности.

Результаты проведенных экспериментов позволили усовершенствовать методику выполнения экспрессного теста определения оксидазной активности по сравнению с МУК 4.2.1018−01, а также дифференцировать алгоритм его проведения в зависимости от используемого оксидазного реактива. При использовании комплексного реактива ДМ, в случае необходимости дальнейшей идентификации оксидазоотрицательных бактерий, пересев колоний на подтверждающие среды целесообразно производить не сразу же после проявления реакции, а после переноса мембранного фильтра на питательную среду и последующего выдерживания свыше 5 минут. Этот прием полностью исключит негативное действие реактива ДМ и ускорит время получения ответа по тесту ферментации лактозы на 1−2 часа. Кроме того, изменено соотношение 1% спиртового раствора а-нафтола (2,5 части) и 1% водного раствора диметил-п-фенилендиамина (7,5 частей), уменьшено допустимое время контакта с реактивом до 4-х минут, исключено ограничение времени посева бактерий в подтверждающие среды для идентификации после переноса мембранного фильтра обратно на питательную среду.

При работе с реактивом ТМ, не влияющим на жизнедеятельность бактерий, исключен этап переноса фильтра обратно на среду после проявления оксидазной активности, не ограничено время посева бактерий в подтверждающие среды для дальнейшей идентификации колиформных бактерий и E.coli. Предложенные приемы существенно упрощают алгоритм экспрессного теста.

Усовершенствованный экспрессный тест определения оксидазной активности позволил разработать ускоренный метод индикации колиформных бактерий, применение которого сокращает время проведения анализа на 48 ч по сравнению с МУК 4.2.1018−01, и на 24 ч — по сравнению с ИСО 9308−1:2000. Метод исключает субъективную выборку колонийосновную причину ошибок микробиологического анализа, существенно уменьшает время контакта исследователя с канцерогенными оксидазными реактивами, а также экономичен и доступен для выполнения практическими лабораториями.

Ускоренный метод определения колиформных бактерий апробирован в натурных условиях при анализе различных типов вод с разной степенью бактериального загрязнения. Валидизация разработанного метода проводилась путем сравнения с результатами, получаемыми по методике ИСО 9308−1:2000. При исследовании воды поверхностных и подземных источников частота проб, в которых по методике ИСО определено более низкое содержание колиформных бактерий, составила 21,43% и 8,33%, соответственно, что указывает на большую надежность ускоренного метода в оценке эпидемической опасности воды. При работе по методу ИСО ошибки результатов возрастают за счет субъективной выборки колоний исследователем.

Анализ материалов исследований воды показал, что достоинством усовершенствованного метода индикации колиформных бактерий по сравнению с методикой ИСО, помимо сокращения времени проведения анализа, является предварительное исключение из дальнейшей идентификации посторонней водной оксидазоположительной микрофлоры, что особенно актуально при исследовании таких вод, где оксидазоположительные бактерии преобладают над индикаторными. Наибольшее количество оксидазоположительных бактерий отмечено при исследовании питьевой воды подземных источников (57,3±18,7%), наименьшее — в загрязненной сточными водами питьевой воде (39,3±17,3%). Экспрессный тест особенно эффективно упрощал исследование воды с предполагаемой низкой степенью микробного загрязнения (бутылированной, подземных источников) в случаях, когда на мембранном фильтре вырастала только оксидазоположительная микрофлора. В этих случаях через 4 минуты дается ответ, в то время, как по методике ИСО 9308−1:2000 колонии микроорганизмов необходимо пересевать на неселективный агар для постановки оксидазного теста через 24 часа. Ускоренный метод определения колиформных бактерий вместе с международным методом ИСО 9308−1:2000 включен в ГОСТ Р 52 426−2005 [23].

Усовершенствованный экспрессный тест определения оксидазной активности особенно необходим для методического обеспечения наиболее надежного показателя эпидемической безопасности воды — глюкозоположительных колиформных бактерий. Определение этого показателя предполагает оксидазный тест в качестве основного этапа идентификации от посторонней водной микрофлоры, что связано с использованием для первичного посева лактозных дифференциальных сред, которые позволяют выделить в первичном посеве только бактерии, ферментирующие лактозу. На основании исследований разработан алгоритм выполнения метода определения глюкозоположительных колиформных бактерий с использованием экспрессного теста определения оксидазной активности одновременно всех выросших на фильтре колоний и ускоренного теста ферментации глюкозы на полужидких средах Гисса, время анализа составляет 24 — 28 часов.

Отличительной особенностью колиформных бактерий является наличие специфического фермента — Р-галактозидазы [173, 195]. При этом бактерии Е. coli характеризуются наличием ферментов как р-галакгозидазы, так и p-D-глюкуронидазы. Эти свойства используются при выращивании бактерий на специальных хромогенных питательных средах, содержащих субстрат, разлагая который колонии окрашиваются в цвет, отличный от других видов микроорганизмов. Этот принцип, помимо ускорения анализа на 24 часа, позволяет проводить количественный учет Е. coli, исключая ошибки метода, связанные с выборочной проверкой колоний для идентификации.

На первом этапе исследований проведена сравнительная оценка эффективности ускоренного метода определения колиформных бактерий и E. coli в воде с использованием хромогенных питательных сред (Chromocult® Coliform Agar, Merck (хромокульт колиформ агар) — Chromocult® триптонный агар с желчью и Х-глюкуронидом (ТЖХ-агар), Merck) и классического двухэтапного метода индикации этих бактерий на лактозном агаре с тергитолом-7 и ТТХ (Merck) и на агаре Эндо, производства НПО «Микроген», г. Махачкала (контроль). Посев микроорганизмов производили методом мембранной фильтрации.

Достоверные различия в количестве колиформных бактерий, идентифицированных в одной и той же пробе воды ускоренным методам с использованием хромокульт колиформ агара и классическим методом, не выявлены (Р > 0,05). При определении в этих же посевах бактерий E. coli наблюдались более выраженные различия в полученных данных. Наиболее эффективным в данном исследовании оказался лактозный агар с тергитолом (Р<0,05). Однако на хромогенных средах при определении E. coli ускоренными методами, получены сопоставимые результаты с традиционным методом на агаре Эндо (Р>0,05).

Изучение ингибиторных свойств оцениваемых питательных сред в отношении посторонней микрофлоры, препятствующей росту изолированных колоний колиформных бактерий и искажающей результаты идентификации при наложении и соприкосновении колоний, показало, что наименее ингибиторной являлась среда с тергитолом, что соответствует рекомендациям ИСО 9308−1:2000. Посторонние бактерии на этой среде преобладали над колиформными в 2 раза, на агаре Эндо и на хромокульт колиформ агаре — в 1,5 раза. Меньше всего посторонних колоний вырастало на ТЖХ-агаре, содержащем желчные соли, при температуре инкубации посевов 44 °C — треть от общего числа бактерий, что очень важно для выполнения ускоренного метода определения Е. coli на этой среде.

Как показано в работе Ossmer R. [222], на чувствительность методов индикации микроорганизмов в воде могут оказывать влияние типы используемых для фильтрации мембран. В наших исследованиях установлено, что при работе на хромокульт колиформ агаре с применением фильтров «Владипор» из смеси ацетатов целлюлозы и «Владисарт» из нитрата целлюлозы наблюдается четкая дифференциация колоний по цвету. Фильтры «Владисарт» из ацетата целлюлозы оказались неэффективны для работы на хромокульт колиформ агаре, что выражалось в снижении выявленных колиформных бактерий и Е. coli на 34,1% и 60,3%, соответственно, по сравнению с фильтрами из нитрата целлюлозы. Эти результаты свидетельствуют о необходимости внесения дополнения в MP № 24ФЦ/513 [91] с указанием пригодных для работы на хромогенных средах марок мембранных фильтров.

Недостатком хромогенных питательных сред является их высокая стоимость и отсутствие отечественных аналогов. В связи с этим, на следующем этапе проводилась сравнительная оценка эффективности ускоренного метода определения Е. coli на основе двуслойной среды (по ИСО 9308−1:2000) и разработанной нами модификации с использованием отечественных ингредиентов.

Принцип ускоренного метода анализа на двуслойных средах заключается в выявлении бактерий, способных образовывать индол при выращивании колоний на триптофансодержащих средах. Все колонии, изменившие цвет на розовый, учитывают как бактерии Е. coli. Двуслойная агаризованная среда состоит из верхнего слоя триптон-соевого агара (ТСА) и нижнего слоя триптон-желчного агара (ТЖА). На этой среде рост сопутствующей микрофлоры тормозится солями желчных кислот и высокой температурой инкубации (44 ° С). Двуслойную среду по прописи ИСО готовили из импортных ингредиентов, а в модифицированной среде заменили неселективный ТСА на питательный агар (НПО «Микроген», г. Махачкала) с добавлением 1 г/л триптофана.

Сравнительную оценку разработанной среды и рекомендуемой ИСО проводили на питьевой воде, загрязненной бытовыми сточными водами. Анализ полученных данных показал, что на двуслойной среде и модифицированной двуслойной среде, по сравнению с лактозным агаром с тергитолом (контроль), бактерий E. coli выделено больше на 29,6±8,4% и 28,3±10,5%, соответственно. Статистической разницы между количеством бактерий E. coli, обнаруженных на двуслойной среде и модифицированной среде, не обнаружено (Р > 0,05).

Для выявления причины расхождения результатов, полученных ускоренным методом на двуслойных средах и при использовании лактозного агара с тергитолом, каждая окрашенная по ускоренному тесту колония была исследована на принадлежность к бактериям E.coli. Установлено, что 18,9±8,6% колоний, учтенных ускоренным методом по окраске колоний как E. coli, не были отнесены к этому виду по другим биохимическим тестам. Это связано, по-видимому, с наличием триптофаназы у бактерий других родов, вырастающих на двуслойной среде. В соответствии с международной классификацией 33 вида бактерий семейства Enterobacteriaceae способны образовывать индол из триптофана [92]. Эти виды принадлежат к таким родам как Citrobacter, Edwardsiella, Klebsiella, Kluyvera, Morganella, Providencia, Serratia, Yersinia и др., которые считаются условно-патогенными, и поэтому гипердиагностика при единичных случаях их обнаружения не снижает гигиеническую надежность оценки качества воды.

Таким образом, для ускоренного определения колиформных бактерий и Е. coli в практике бактериологического контроля воды может быть рекомендовано использование хромокульт колиформ агара. Ускоренное определение Е. coli может проводиться на хромогенной питательной среде ТЖХ-агар или на модифицированной двуслойной среде, состоящей из триптон-желчного агара и питательного агара с добавлением 1 г/л триптофана. При использовании хромогенных питательных сред допустима фильтрация воды только на мембранах из нитрата целлюлозы или из смеси ацетатов целлюлозы. Отсутствие необходимости проведения дополнительной идентификации бактерий, которая применяется в классическом двухэтапном методе, позволяет сократить время анализа до 18−24 часов.

Для ускорения и повышения эффективности методики выделения спор сульфитредуцирующих клостридий (СК) в условиях обычного I термостатирования проведена оптимизация питательной среды — железо-сульфитного агара (ЖА), рекомендованного МУК 4.2.1018−01, путем добавления тиогликолята натрия (ТГ) в концентрациях 1 и 0,1 г/л. Это вещество вводят для создания необходимой степени окислительно-восстановительного потенциала среды, что поддерживает размножение анаэробных микроорганизмов [69,145].

Помимо двух вариантов ЖА с ТГ проводилась оценка готовых сред производства НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич: полужидкой железо-сульфитной среды (ЖСС-1) и плотной железо-сульфитной среды (ЖСС -2), рекомендованных для выращивания СК.

Исследования выполнялись при анализе воды с разной степенью бактериального загрязнения: из поверхностных источников (п-10 КОЕ/20 мл).

2″ 3 и загрязненной питьевой воды (п-10 — п-10 КОЕ/20 мл). Статистически значимые различия в количестве спор СК, обнаруженных в воде поверхностных источников, при использовании ЖА без добавок (контроль), ЖА с добавлением ОД г/л ТГ и среды ЖСС-1 отсутствовали (Р > 0,05). Две другие среды — ЖА с добавлением 1 г/л ТГ и среда ЖСС-2 показали наличие статистически значимых различий по сравнению с контрольной средой (Р < 0,05). Но если в случае с ЖА с добавлением 1 г/л ТГ количество выделенных спор СК было выше, по сравнению с контрольной средой, то в отношении среды ЖСС-2 имело место статистически значимое обратное соотношение.

Аналогичные закономерности получены при исследовании загрязненной питьевой воды. Споры СК были обнаружены в 100% проб на всех питательных средах, кроме среды ЖСС-2 (обнаружены в 93,34% проб).

Скорость роста спор СК на всех исследуемых средах при анализе загрязненной питьевой воды, примерно одинаковой. При исследовании воды поверхностных источников почернение среды и начальные признаки газообразования наблюдались через 4−5 часов в 53,3% проб на железосульфитной среде с добавлением 1, г/л ТГ, в 40% проб — на ЖА и ЖА с добавлением 0,1 г/л ТГ. Учет колоний полностью завершался через 10−12 часов. На средах ЖСС-1 и ЖСС-2 признаки роста через 5−6 часов наблюдались только в 26,7% проб, окончательный результат был получен через 12−14 часов. По видимому, разница во времени выделения спор СК при исследовании воды поверхностных источников связана с длительностью пребывания спор в окружающей среде.

Таким образом, добавление к железо-сульфитному агару восстановителя (тиогликолята натрия) в количестве 1 г/л позволяет повысить эффективность выделения спор СК в условиях обычного термостатирования. При исследовании воды поверхностных источников эффективность выделения на оптимизированной среде выше на 55,2±27,6%, при исследовании питьевой воды, загрязненной сточными водами — на 35,9±14,9% по сравнению с железо-сульфитным агаром. Данная модификация железо-сульфитной среды обладает рядом преимуществ: проста в изготовлении, не имеет сложных или дефицитных компонентов, изготовлена из непищевого сырья. Добавление химического реагента, такого как тиогликолят натрия, позволяет в большей степени стандартизовать модифицированную среду по сравнению со средами, где в качестве добавок для понижения окислительно-восстановительного баланса среды используются нестандартизуемые компоненты (лизированная кровь, измельченное мясо).

Одной из причин вторичного роста микроорганизмов в воде водопроводных сетей является восстановление жизнеспособности (реактивации) патогенных, условно-патогенных и индикаторных бактерий за время поступления питьевой воды к потребителю после неполного бактерицидного действия обеззараживающих агентов. При этом на выходе с водопроводных сооружений бактерии, временно утратив способность вырастать на питательных средах, не определяются общепринятыми методами контроля, и вода ошибочно характеризуется как безопасная в эпидемическом отношении.

В связи с актуальностью проблемы, в работе изучена возможность реактивации индикаторных, условно-патогенных и патогенных бактерий с различными морфологическими и биохимическими свойствами после воздействия обеззараживающих средств различного состава и механизма действия: гипохлорита натриядиоксида хлорагуанидинсодержащего препарата и двух фотосенсибилизаторов — профлавин ацетата и метиленового голубого.

В эксперименте воспроизводился процесс обеззараживания воды на водопроводных станциях, базирующихся на поверхностном источнике, реагентами гипохлоритом натрия и диоксидом хлора в дозах: 1- 2- 3- 4 мг/л. Исходные уровни индикаторных бактерий составляли п- 103 КОЕ/ЮО мл, с добавлением S. enteritidis и S. infantis и Ps. aeruginosa до концентрации п-Ю3 КОЕ/л. Микроорганизмы определяли через сроки экспозиции: 0,5- 1- 2- 3- 24 часа после внесения дезинфекгантов.

Воздействие диоксида хлора в дозе 1 мг/л через 30 мин экспозиции приводило к резкому снижению содержания уровня сальмонелл — от 1500 КОЕ/л до 20 КОЕ/л. На протяжении 2 часов сальмонеллы не были обнаружены. Однако, через 24 часа наблюдалась слабая реактивация сальмонелл до 25 КОЕ/л. Диоксид хлора в дозах 2 и 3 мг/л вызвал 100%-ную инактивацию ГКБ, ОКБ, коли через 30−180 мин экспозиции. Однако через 24 часа наблюдалась частичная реактивация бактерий: ГКБ, ОКБ до 5 КОЕ/ 100 мл, Е. coli — до 4 КОЕ/100 мл. При более высоких дозах диоксида хлора — 4,0 мг/л, гипохлорита натрия — 2, 3, 4 мг/л отмечалась инактивация колиформных бактерий, сальмонелл и достигался полный бактерицидный эффект. Реактивация энтерококков, клостридий, Ps. aeruginosa не наблюдалась.

При концентрации гипохлорита натрия 1,0 мг/л через 30 минут экспозиции, также как при действии диоксида хлора, происходит резкое снижение содержания колиформных бактерий до единичных клеток в 100 мл, с дальнейшей инактивацией. Через 24 часа выявлен эффект реактивации бактерий до 82 и 80 КОЕ ГКБ и ОКБ в 100мл. Что же касается Е. coli, то эффекта реактивации через 24 часа не было отмечено.

Таким образом, увеличение срока наблюдения за динамикой инактивации бактерий до 24 ч дало возможность определить бактериостатические дозы диоксида хлора (2 и 3 мг/л) и гипохлорита натрия (1 мг/л), при которых индикаторные и патогенные стрессированные бактерии после снижения остаточных количеств реагентов восстанавливают жизнеспособность и размножаются в воде до эпидемически опасных уровней.

Проведены исследования по изучению возможности реактивации бактерий после обеззараживания сточных вод с использованием гипохлорита натрия в дозах 2, 5 и 10 мг/л по активному хлору и экспозиции 1, 2, 20, 120 часов. Исходный уровень микробного загрязнения в модельных водоемах п-105 КОЕ/ЮО мл. Гипохлорит натрия в дозе 5 мг/л через 2 часа контакта вызывал 100%-ную инактивацию всех исследованных бактерий (остаточный хлор 2,1 мг/л). Через 20 часов при снижении остаточного хлора до 1,0 мг/л наблюдалось увеличение ОМЧ, размножение КБ и сальмонелл.

Через 120 часов численность сальмонелл возросла до 100 КОЕ/л, ОКБ и ГКБ до 5000 КОЕ/ЮО мл, ТКБ — до 400 КОЕ/ЮО мл, ОМЧ — до 25 000 КОЕ/мл. 100% инактивация всех изученных групп бактерий достигнута только при дозе гипохлорита натрия 10 мг/л. Полученные данные объясняют причину размножения сальмонелл на значительных расстояниях от места сброса сточных вод [137] и обнаружения патогенных бактерий в воде у водозаборов.

В экспериментальных исследованиях по изучению эффективности гуанидинсодержащего препарата (полигексаметиленгуанидин-гидрохлорида (ПГМГ-ГХ) и четвертичного аммонийного соединения) в концентрациях 0,24 и 0,5 мг/л по ПГМГ-ГХ, в отношении индикаторных и условно-патогенных бактерий выявлена реактивация ОМЧ (через 24 ч) и Pseudomonas aeruginosa (через 48 ч), что свидетельствует о бактериостатическом эффекте препарата в отношении этих микроорганизмов. Отсутствие размножения всех групп колиформных бактерий и энтерококков в течение 48 ч после обеззараживания воды в сочетании с коагулированием и фильтрацией является доказательством бактерицидного действия дезинфектанта в концентрациях 0,24 и 0,5 мг/л по ПГМГ-ГХ в отношении этих микроорганизмов.

В последние годы предложен новый метод обеззараживания воды с использованием фотодинамически активных красителейфотосенсибилизаторов [52], в том числе, метиленового голубого (МГ) и профлавина ацетата (ПА).

Для установления возможности к реактивации индикаторных, условно-патогенных и патогенных бактерий после фотообеззараживания с использованием МГ и ПА проведены исследования на воде модельных водоемов, зараженных суточными культурами музейных штаммов и бактерий, выделенных из сточных вод: Salmonella infantis spp, Salmonella enteritidis spp, Salmonella enteritidis 5765 ATCC, Pseudomonas aeruginosa 10 145, Pseudomonas aeruginosa spp, Escherichia coli 1257, Staphylococcus aureus 906, Enterococcus faecalis 29 212. Исходный уровень заражения составил п-106 КОЕ/ЮО мл. Количество микроорганизмов определяли после контакта с фотосенсибилизаторами в темноте в течение 30 минут и последующего освечивания в течение 30 минут при температуре 20 °C, а также через 24 часа и через 5 суток. Исследовались концентрации МГ и ПА как допустимые по токсикологическому признаку [129], так и более высокие, создающие агравированные условия эксперимента: 0,25- 0,5- 1- 1,5 и 2 мг/л.

В результате проведенных исследований установлена возможность реактивации бактерий E. coli после воздействия МГ в концентрации 0,5 мг/л. Сразу после освечивания воды в присутствии МГ в концентрации 0,5 мг/л и через 24 ч бактерии E. coli не были обнаружены. МГ, как и ПА, в концентрации 1 мг/л оказали полное бактерицидное действие в отношении E. coli в процессе фотообеззараживания без проявления реактивации на протяжении 5 суток.

В следующей серии экспериментов изучена эффективность фотообеззараживания в отношении грам положительных индикаторных (Ent. faecalis) и патогенных (St. aureus) бактерий. Как видно из таблицы 4, ПА концентрация 1,0 мг/л оказывал полное бактерицидное действие в отношении энтерококков, МГ в концентрации 0,75 мг/л — в отношении стафилококков и энтерококков. Выявлено бактериостатическое действие МГ в концентрации 0,25 мг/л в отношении стафилококков и в концентрации 0,5 мг/л в отношении энтерококков. В этих случаях в течение 24 ч стрессированные бактерии утратили способность образовывать видимые колонии на плотных средах с последующим через 5 суток восстановлением ростовых и биохимических свойств. МГ в концентрации 0,25 мг/л и ПА в концентрации 0,5 мг/л не вызывали 100% инактивациина Ent. faecalis, и через 5 суток наблюдалось не только восстановление жизнеспособности, но и размножение бактерий.

Выявлена большая устойчивость сальмонелл по сравнению с индикаторными бактериями при воздействии сенсибилизаторов МГ и ПА. 100%-ная инактивация установлена только при высокой дозе МГ 2 мг/л в отношении музейного штамма S. enteritidis. После окончания освечивания при дозе МГ 1 мг/л численность сальмонелл снизилась на 4 порядка, при дозе 1,5 мг/л — на 5 порядков с последующим интенсивным размножением сальмонелл до исходного уровня заражения.

Эффективность обеззараживания МГ в концентрации 1 мг/л в отношении сальмонелл, выделенных из сточных вод (S. infantis spp.), была меньше (98,59%) по сравнению с действием на музейный штамм (99,84%). МГ в концентрации 2 мг/л оказывал бактериостатическое действие на S. infantis spp. с проявлением реактивации после фотообеззараживания воды: сразу после освечивания бактерии не были обнаружены, а через сутки бактерии размножились на 2 порядка.

Во всех вариантах опыта, где отсутствовала 100%-ная инактивация сальмонелл наблюдалось их последующее интенсивное размножение. Через 5 суток после фотообеззараживания воды уровень сальмонелл превышал исходный и контрольный, что представляет большую эпидемическую опасность. Полученные данные об интенсивном (в сотни и тысячи раз) размножении сальмонелл после фотообеззараживания в фильтрованной через угольный фильтр и автоклавированной водопроводной воде опровергают представление о том, что возбудители кишечных инфекций не способны увеличивать популяцию при попадании в водную среду с небольшим содержанием питательных веществ [85].

Наиболее высокая устойчивость к фотообеззараживанию установлена у бактерий Ps. aeruginosa. Как и в опытах с сальмонеллами, выявлена большая чувствительность музейного штамма, по сравнению с выделенным из сточных вод. Сразу после освечивания уровень условно-патогенных бактерий даже в присутствии больших концентраций фотосенсибилизаторов (1,0 и 1,5 мг/л) снизился всего на 1 порядок, эффективность беззараживания колебалась в пределах 81,67−95,42%. Через 24 часа численность бактерий Ps. aeruginosa во всех вариантах опыта увеличилась на 1 порядок с дальнейшим размножением в течение 5 суток до более высоких количеств по сравнению с контролем.

Выявление способности микроорганизмов к реактивации после фотообеззараживания позволило установить бактериостатические дозы сенсибилизатора МГ в отношении St. aureus (0,25 мг/л), E. coli (0,5 мг/л), Ent. faecalis (0,5 мг/л), S. infantis spp .(2 мг/л), при действии которых наблюдалась 100%-ная инактивация микроорганизмов сразу после завершения процесса обеззараживания с последующим воостановлением их жизнеспособности через 1−5 суток. В случае полного обеззараживающего эффекта ПА реактивация микроорганизмов не наблюдалась.

Таким образом, в результате экспериментов установлена возможность реактивации патогенных, условно-патогенных и индикаторных бактерий через 24 и более часов после воздействия обеззараживающих средств различного состава (диоксида хлора и гипохлорита натрия, гуанидинсодержащего препарата, фотосенсибилизатора метиленового голубого). Выявленная способность стрессированных бактерий к восстановлению жизнеспособности в случае неполного бактерицидного эффекта вызывает необходимость оценивать эффективность обеззараживания при изучении новых средств и подборе режимов обработки воды в течение 1 -5 суток.

Большая устойчивость сальмонелл по сравнению с индикаторными бактериями свидетельствует о снижении индикаторного значения последних и о необходимости выполнения исследований не только на индикаторных, но и на патогенных бактериях. Для более надежной оценки эффективности обеззараживания при выборе модельных бактерий необходимо учитывать меньшую устойчивость музейных штаммов, по сравнению с выделенными из окружающей среды.

С целью совершенствования методических подходов к контролю качества воды после обеззараживания помимо выявления возможности реактивации изучалась изменчивость культуральных и биохимических свойств индикаторных и патогенных бактерий. Изменчивость в процессе фотообеззараживания культуральных свойств бактерий Е. coli выявлена в 60% проб, сальмонелл — в 50% проб. Измененные колонии Ent. faecalis и St. aureus выявлены в 73% случаев (таблица 8.1.). Отсутствие типичных культуральных особенностей колоний может привести к ложноотрицательному результату оценки эпидемической безопасности воды. Таблица 8.1. Изменчивость культуральных и биохимических свойств индикаторных и патогенных бактерий.

Свойства бактерий Микроорганизмы.

Е. coli Сальмонеллы Энтерококки Стафилококки.

Культуральные особенности Отсутствие металлического блеска колоний на среде Эндоотсутствие способности бактерий ферментировать лактозу Отсутствие характерного зеркального блеска вокруг колонии на висмут-сульфитном агаре Отсутствие блеска колоний на энтерококк-агаре Задержка образования пигмента и проявления лецитови-теллазной активности.

Бактериальный рост Контроль: 1−2 суток Опыт: 3−4 суток.

Размер колоний Контроль: все колонии одного размера Опыт: выраженный полиморфизм по рамеру.

Для повышения адекватности оценки эффективности обеззараживающих агентов даны рекомендации по усовершенствованию методики микробиологического анализа с учетом изменчивости культуральных и биохимических свойств бактерий: удлинение срока инкубации посевов до 5 суток, учет не характерных для тест-микроорганизмов колоний на дифференциальных средах, выполнение пассирования подозрительных колоний через оптимальные жидкие и плотные среды, использование нескольких методов посева в случае отсутствия дезактиватора дезсредства.