Масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Впервые установлены составы кожных секретов трех видов лягушек: R. lessonae, R. esculenta и Ну la arbor еа. Уточнены составы кожных пептид омов трех других видов: R. ridibunda, R. arvalis и R. temporaria (обитающей на территории России). Установлены структуры 153 пептидов, из них ранее не описанных — 39. Первичные структуры пяти новых пептидов дополнительно подтверждены методом деградации… Читать ещё >

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
- 1. 1. Роль пептидов в живых организмах
  - 1. 1. 1. Коммуникативные пептиды
  - 1. 1. 2. Мембраноактивные пептиды
    - 1. 1. 2. 1. Строение мембраноактивных пептидов
    - 1. 1. 2. 2. Механизм действия мембраноактивных пептидов
    - 1. 1. 2. 3. Ингибиторы синтеза N
- 1. 2. Пептиды из кожных секретов амфибий семейства Anura
  - 1. 2. 1. Синтез пептидов в организме амфибий
  - 1. 2. 2. Амфибии рода Rana и Hyla
  - 1. 2. 3. Кожные пептиды ранидных лягушек
    - 1. 2. 3. 1. Мембраноактивные пептиды
    - 1. 2. 3. 1. 1. Активность дисульфидсодержащих пептидов
    - 1. 2. 3. 1. 2. Пептиды, несодержащие дисульфидной связи.2Р
    - 1. 2. 3. 2. Нейропептиды ранидных лягушек
    - 1. 2. 3. 2. 1. Тахикинины
    - 1. 2. 3. 2. 2. Ранатензины ибомбезины
    - 1. 2. 3. 2. 3. Брадикинины
  - 1. 2. 4. Пептиды хилидных лягушек
    - 1. 2. 4. 1. Мембраноактивные пептиды
    - 1. 2. 4. 1. 1. Семейство дермасептина
    - 1. 2. 4. 1. 2. Пептиды-антибиотики австралийских квакш
    - 1. 2. 4. 2. Нейропептиды
    - 1. 2. 4. 2. 1. Каерулины
    - 1. 2. 4. 2. 2. Опиоидные пептиды
    - 1. 2. 4. 2. 3. Триптофиллины
- 1. 3. Секвенирование пептидов
  - 1. 3. 1. Химические методы
    - 1. 3. 1. 1. Метод Эдмана
    - 1. 3. 1. 2. Леддерное секвенирование
  - 1. 3. 2. Методы генной инженерии
  - 1. 3. 3. Масс-спектрометрическое секвенирование пептидов и белков
    - 1. 3. 3. 1. Применяемые для секвенирования пептидов методы ионизации
    - 1. 3. 3. 1. 1. Ионизация электрораспылением (ЭР)
    - 1. 3. 3. 1. 2. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ)
    - 1. 3. 3. 2. Тандемная масс-спектрометрия
    - 1. 3. 3. 2. 1. Диссоциация, активированная соударениями (ДАС)
    - 1. 3. 3. 2. 2. Диссоциация при захвате (ДЭЗ) или переносе электрона (ДПЭ)
    - 1. 3. 3. 2. 3. Фрагментация в МАЛДИ
    - 1. 3. 3. 3. Комплементарность различных способов активации фрагментации полипептидных цепей
    - 1. 3. 3. 4. Сложности масс-спектрометрического секвенирования
    - 1. 3. 3. 4. 1. Изомерные и изобарные аминокислоты
    - 1. 3. 3. 4. 2. Внутримолекулярная днсульфидная связь
    - 1. 3. 3. 4. 3. Масс-спектрометрические методы разрушения S-S связей
    - 1. 3. 3. 4. 4. Газофазная циклизация Ъ- и я-ионов коротких пептидов
    - 1. 3. 3. 5. Модификация N-концевой аминогруппы
    - 1. 3. 3. 5. 1. Введение незаряженной группы на N-конец пептида
    - 1. 3. 3. 5. 2. Введение отрицательно заряженной группы на N-конец пептида
    - 1. 3. 3. 5. 3. Введение положительно заряженной группы на N-конец пептида
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
- 2. 1. Оптимизация процедуры получения кожных секретов
- 2. 2. Оптимизация ВЭЖХ разделения кожных секретов
- 2. 3. Детальное масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек
  - 2. 3. 1. Комплементарность результатов de novo секвенирования полученных в режимах ДАС и ДЭЗ
  - 2. 3. 2. Ранидные лягушки
    - 2. 3. 2. 1. Комплементарность процедур карбоксамидометилирования и окисления дисульфидных связей ранидных пептидов
    - 2. 3. 2. 2. Побочные реакции, зафиксированные при карбоксамидометилировании и окислении дисульфидных связей
    - 2. 3. 2. 3. Кожный пептидом озерной лягушки, Rana ridibunda
    - 2. 3. 2. 4. Кожный пептидом прудовой лягушки, Rana lessonae
    - 2. 3. 2. 5. Кожный пептидом съедобной лягушки, Rana esculenta
    - 2. 3. 2. 6. Кожный пептидом травяной лягушки, Rana temporaria
    - 2. 3. 2. 7. Кожный пептидом остромордой лягушки, Rana arvalis
  - 2. 3. 3. Хилидные лягушки
    - 2. 3. 3. 1. Газофазная циклизация Ъ- и а-ионов коротких пептидов
    - 2. 3. 3. 2. Изучение трех способов предотвращения циклизации ионов коротких пептидов
    - 2. 3. 3. 3. Кожный пептидом квакши обыкновенной, Hyla arborea
- 2. 4. Экспресс-профилирование кожных секретов ранидных лягушек
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
ВЫВОДЫ

Масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

В процессе длительной эволюции для защиты от хищников и паразитов амфибии выработали высокосложный химический арсенал. Секрет, выделяемый их кожными железами в стрессовых ситуациях, помогает им эффективно противостоять внешней агрессии. В его составе присутствуют соединения с высокой биологической активностью, большая их часть относится к классу пептидов. Изученные к настоящему моменту пептиды амфибий проявляют антимикробные, противовирусные, противоопухолевые свойства, могут противодействовать паразитическим грибам и простейшим. Некоторые из них обладают нейроактивностыо и выполняют регуляторные функции в организмах продуцирующих их амфибий. Высокая степень сходства многих пептидов земноводных с пептидами млекопитающих делает их изучение актуальным для понимания физиологии в том числе и человека.

Постоянная эволюция патогенных микроорганизмов способствует появлению резистентных к существующим антибиотикам штаммов и, тем самым, вынуждает расширять поиск новых веществ, эффективных в борьбе с бактериями. Преимуществом антимикробных пептидов, в том числе кожных пептидов амфибий, в сравнении с традиционными антибиотиками является то, что их механизм действия исключает привыкание к ним со стороны патогенных микроорганизмов.

Классические биохимические методы определения структур белков и пептидов в настоящее время практически полностью вытеснены масс-спектрометрическим секвенированием. Оно оказалось более быстрым, простым и чувствительным методом, что резко уменьшило необходимое для анализа количество образца без ущерба надежности получаемых результатов. Основной и наиболее трудоемкой задачей масс-спектрометрического секвенирования является так называемое de novo секвенирование, т. е. установление структуры абсолютно неизвестного пептида.

В силу неоднородности состава кожные выделений амфибий чрезвычайно сложны даже для масс-спектрометрического исследования. Они содержат пептиды разной длины от 5 до 46 аминокислот) и природы (гидрофильность, зарядное состояние и т. д.) — часто осложненные С-терминальным дисульфидным кольцомЬ- и а-ионы коротких пептидов самопроизвольно циклизуются в газовой фазе масс-спектрометра. Концентрации отдельных компонентов пептидной смеси различаются на порядки, что может приводить к потере информации как о минорных, так и о мажорных ее составляющих в процессе массспектрометрического эксперимента. Таким образом, изучение состава кожных секретов амфибий, содержащих поистине уникальные биоактивные вещества, разработка и развитие новых подходов к анализу многокомпонентных смесей природных пептидов 6 неизвестной структуры, а также повышение эффективности их de novo секвенирования являются актуальными задачами современной науки.

Целью данной работы является апробация нового масс-спектрометрического подхода к de novo секвенированию пептидных компонентов кожных секретов лягушек, объединяющего два способа активации фрагментации пептидных цепей (соударениями и захватом электрона) с простыми химическими модификациями компонентов кожных секретов.

В работе решались следующие задачи:

1. Установление состава кожных выделений пяти видов ранидных лягушек (R. ridibunda, R. lessonae, R. esculenta, R. temporaria и R. arvalis), используя сумму параллельных процедур модифицирования внутримолекулярной дисульфидной связи: восстановление с последующим карбоксамидометилированием и окисление их надмуравьиной кислотой.

2. Сравнительное изучение трех способов модификации N-концевой КНг-труппы коротких пептидов с дальнейшим применением наиболее эффективного из них для анализа кожного секрета квакши обыкновенной Hyla arborea.

3. Изучение возможности проведения межвидовой идентификации ранидных. лягушек детальным МС2-профилированием неразделенных кожных секретов с применением ВЭЖХ-МС высокого разрешения, а также экспресс-профилированием с использованием ВЭЖХ и МАЛДИ-МС.

1. Обзор литературы.

Выводы.

1. Разработан и практически применен новый подход к de novo секвенированию неизвестных пептидов в составе природных смесей (кожных секретов ранидных и хилидных лягушек). Он сочетает в себе использование двух методов активации фрагментации пептидных связей: соударениями (ДАС) и захватом электронов (ДЭЗ) с простыми химическими модификациями кожного субстрата.

2. Изучены три способа модификации N-концевой аминогруппы коротких пептидов для предотвращения газофазной циклизации их Ъи а-ионов.

3. Впервые установлены составы кожных секретов трех видов лягушек: R. lessonae, R. esculenta и Ну la arbor еа. Уточнены составы кожных пептид омов трех других видов: R. ridibunda, R. arvalis и R. temporaria (обитающей на территории России). Установлены структуры 153 пептидов, из них ранее не описанных — 39. Первичные структуры пяти новых пептидов дополнительно подтверждены методом деградации по Эдману.

4. Показана возможность проведения межвидовой идентификации ранидных лягушек детальным МС2-профилированием неразделенных кожных секретов с применением ВЭЖХ-МС высокого разрешения, а также экспресс-профилированием с использованием ВЭЖХ-УФ и МАЛДИ-МС.

Показать весь текст

Список литературы

Jablonka Е., Lachmann М., Lamb MJ. Evidence, mechanisms and models for the inheritance of acquired characters. // J. Theor. Biol. 1992. V. 158. № 2. P. 245−268.
Egger G., Liang G., Aparicio A., Jones P.A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. // Nature. 2004. V. 429. № 6990. P. 457−463.
File S.E., Fluck E., Fernandes C. Beneficial effects of glycine (bioglycin) on memory and attention in young and middle-aged adults. // J. Clin. Psychopharmacol. 1999. V. 19. № 6. P. 506−512.
Viu E., Zapata A., Capdevila J., Skolnick P., Trullas R. Glycine (B) receptor antagonists and partial agonists prevent memory deficits in inhibitory avoidance learning. // Neurobiol. Learn. Mem. 2000. V. 74. № 2. P. 146−160.
McEntee W.J., Crook Т.Н. Glutamate: its role in learning, memory, and the aging brain. // Psychopharmacology (Berl). 1993. V. 111. № 4. P. 391−401.
Hooi D.S., Bycroft B.W., Chhabra S.R., Williams P., Pritchard D.I. Differential immune modulatory activity of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal molecules. // Infect. Immun. 2004. V. 72. № 11. P. 6463−6470.
Jurgens M., Schrader M. Peptidomic approaches in proteomic research. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2002. V. 4. № 3. P. 236−241.
Schulz-Knappe P., Zucht H.D., Heine G., Jurgens M., Hess R., Schrader M. Peptidomics: the comprehensive analysis of peptides in complex biological mixtures. // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2001. V. 4. № 2. P. 207−217.
Strand F.L. Neuropeptides: general characteristics and neuropharmaceutical potential in treating CNS disorders. // Prog. Drug Res. 2003. V. 61. № 1−37.
Soloviev M., Shaw C., Andren P. Peptidomics: Methods and Applications. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2008. 409 p.
Hummon A.B., Amare A., Sweedier J.V. Discovering new invertebrate neuropeptides using mass spectrometry. // Mass Spectrom. Rev. 2006. V. 25. № 1. P. 77−98.
Robas N.M., Fidock M.D. Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays. // Methods Mol. Biol. 2005. V. 306. № 17−26.
Kimbrell D.A., Beutler B. The evolution and genetics of innate immunity. // Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. № 4. P. 256−267.
Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. // Nature. 1981. V. 292. № 5820. P. 246−248.
Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. № 15. P. 5449−5453.
Bechinger В., Zasloff M., Opella S.J. Structure and orientation of the antibiotic peptide magainin in membranes by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. // Protein Sci. 1993. V. 2. № 12. P. 2077−2084.
Romeo D., Skerlavaj В., Bolognesi M., Gennaro R. Structure and bactericidal activity of an antibiotic dodecapeptide purified from bovine neutrophils. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. № 20. P. 9573−9575.
Selsted M.E., Harwig S.S., Ganz Т., SchillingJ.W., Lehrer R.I. Primary structures of three human neutrophil defensins. // J. Clin. Invest. 1985. V. 76. № 4. P. 1436−1439.
Selsted M.E., Novotny M.J., Morris W.L., Tang Y.Q., Smith W., Cullor J.S. Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 7. P. 4292−4295.
Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1462. № 1−2. P. 1−10.
Yang L., Weiss T.M., Lehrer R.I., Huang H.W. Crystallization of antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin. // Biophys. J. 2000. V. 79. № 4. P. 2002−2009.
Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1462. № 1−2. P. 55−70.
Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. // Nature. 2002. V. 415. № 6870. P. 389−395.27.28,2930,31,32,33,34,35,36.37,38.

Заполнить форму текущей работой