Разработка системы функциональных молекулярно-генетических маркеров на основе инсерций ALU-ретроэлементов

Одной из важнейших задач, стоящих перед современной функциональной геномикой, является поиск молекулярно-генетических факторов, вовлеченных в формирование различных комплексных фенотипов, проявляющихся при нормальных и особенно при патологичных состояниях организма. Наиболее остро стоит вопрос о молекулярных механизмах и факторах, лежащих в основе возникновения и развития социально значимых многофакторных и мультигенных заболеваний. Типичными представителями таковых являются патологии онкологического профиля.

По данным Американского онкологического общества рак по уровню смертности среди пациентов продолжает занимать одну из лидирующих позиций среди всех болезней человека (http://www.cancer.org/), оставаясь одним из самых опасных на настоящий момент заболеваний. Однако во многих случаях негативное воздействие на организм способно оказывать не только само заболевание, но и терапевтические подходы, обладающие значительными побочными эффектами. Особого внимания заслуживает терапия детских онкологических заболеваний, поскольку отдельные методы лечения могут приводить к необратимым нарушениям развития молодого организма (рис.1). Успехи последнего времени в области качества терапии рака во многом обязаны повышению понимания молекулярных и клеточных механизмов канцерогенеза, а также прогрессу в сфере разработки систем диагностики и прогноза развития рака.

Рисунок 1. Однояйцевые близнецы в возрасте 26 лет. Сестра, стоящая справа, перенесла в 4-х летнем возрасте острый лимфобластный лейкоз, прошла несколько этапов терапии, включая облучение. Дано по (.ЫИег, 2011).

Согласно современным представлениям, опухолевая трансформация клеток происходит в результате ступенчатого процесса накопления и отбора соматических мутаций. Часть мутаций, не являющихся нейтральными, приводит к активации генов позитивного контроля клеточного деления (онкогенов) и инактивации генов негативного контроля (онкосупрессоров). Такие мутации дают опухолевому клону пролиферативное преимущество перед клетками-предшественниками и соседними здоровыми клетками. В результате происходит бесконтрольный рост и формирование опухолевой ткани, имеющей нередко гетерогенную структуру с одним или несколькими доминирующими клонами. Несмотря на то, что ведущая роль в малигнизации клеток принадлежит соматическим мутациям, некоторые существующие в популяции аллели онкозначимых генов и их сочетания могут являться факторами предрасположенности к развитию новообразования и иметь прогностическое значение, оказывая влияние на различные стадии канцерогенеза и определяя, таким образом, путь дальнейшего развития опухоли.

Инсерции ретроэлементов, благодаря сохраняющейся ретропозиционной активности, являются богатым источником новых аллелей генов и одновременно одной из причин возникновения соматического мозаицизма. Вместе с тем, инсерционный полиморфизм ретроэлементов считается одним из важнейших факторов вариабельности генома. Соматические инсерции ретроэлементов можно рассматривать в качестве селективных молекулярно-генетических маркеров опухолевых клонов, а некоторые полиморфные в популяциях человека инсерции как факторы предрасположенности к развитию онкологических заболеваний.

Наиболее многочисленной группой ретроэлементов в геноме человека является семейство Alu-повторов. Из более миллиона копий /¿-/¿-/-элементов около 2000 представляют собой полиморфные инсерции. Известно 25 de novo-инсерций Alu, участвующих в развитии различных генетических заболеваний. Интеграции в кодирующие области генов разрушают экзоны и приводят к сдвигу рамки считывания. Подобные инсерции являются причинами возникновения болезни Дента, гемофилии А, наблюдаются при некоторых семейных случаях рака яичников и рака молочной железы. Ряд интронных инсерций может при созревании транскрипта вызывать пропуск близлежащего экзона, в том числе со сдвигом рамки считывания. С этим явлением связана причина возникновения синдрома Аперта и нейрофиброматоза. Последовательности Л/и-элементов являются сайтами гомологичных рекомбинаций, которые нередко приводят к появлению протяженных делеций, способных захватывать один или несколько экзонов, нарушая целостность генов. Подобные делеции наблюдаются при таких заболеваниях, как наследственная копропорфирия и дефицит фактора V свертывания крови. Инсерции в интроны и З'-нетранслируемые области способны менять профили экспрессии соответствующих генов.

Имеются косвенные данные в пользу участия J/w-элементов в опухолевом патогенезе. Показано, что плотность инсерций Alu в известных онкосупрессорах значительно выше, чем в протоонкогенах. Кроме того, при многих онкологических заболеваниях инсерции Alu-элементов оказываются деметилированы. В некоторых случаях это приводит к повышению уровня транскрипции J/и-элементов, что, в свою очередь, может способствовать увеличению частоты соматических ретропозиций Alu.

Ретропозиционная активность, способность модулировать экспрессию генов, а также вовлеченность в процесс опухолевого патогенеза, делает «мастер-гены» и некоторые полиморфные инсерции Л/м-элементов подходящими объектами для создания на их основе тест-систем для диагностики предрасположенности к онкологическим заболеваниям, прогноза их развития и выбора адекватной терапии. Кроме того, возможности полиморфных у4/м-маркеров в области идентификации личности позволяют в перспективе создать представительный набор функциональных молекулярно-генетических маркеров, одновременно являющийся генетическим паспортом пациента. Это является важным шагом в направлении развития персонифицированной медицины.

Актуальной задачей молекулярной биотехнологии в таком контексте становится создание надежной, информативной и методически доступной системы функциональных молекулярно-генетических маркеров, способной найти применение в медицинской практике.

Целью данной работы является разработка системы функциональных молекулярно-генетических маркеров на основе полиморфных инсерций, А /м-ретроэлемснтов для диагностики риска развития острого лимфобластного лейкоза.

Для достижения поставленной цели решались следующие экспериментальные задачи: разработка биоинформатического алгоритма для идентификации ретропозиционно активных инсерций, А /м-ретроэлементов в геноме человекабиоинформатический поиск полиморфных инсерций ^4/и-ретроэлементов в интронах генов человека, продукты которых могут являться потенциальными участниками малигнизации кроветворных клетоксоздание системы ПЦР-адаптированных молекулярно-генетических маркеров на основе выбранных инсерций Л/ы-элементов и сравнительное генотипирование образцов геномной ДНК здоровых доноров и пациентов с острым лимфобластным лейкозомпроведение сравнительного анализа транскрипции аллельных пар генов в образцах, гетерозиготных по инсерциям/4/м-ретроэлементов на уровне первичных транскриптовизучение эффектов, затрудняющих интерпретацию результатов функционального анализа Alu, и поиск путей совершенствования подхода для осуществления функционального анализа инсерций Alu-элементов.

выводы.

1. Разработан алгоритм для биоинформатической идентификации инсерций Ä-lu-ретроэлементов, обладающих ретропозиционной активностью («мастер-генов»). С помощью предложенного алгоритма впервые идентифицировано 12 инсерций «мастер-генов» в семействах AluYa5 и AluYbS.

2. Проведен полногеномный биоинформатический поиск полиморфных инсерций Alu-ретроэлементов в интронах генов, продукты которых являются потенциальными участниками малигнизации кроветворных клеток. Создана серия ПЦР-адаптированных молекулярно-генетических маркеров, включающая 53 пары уникальных праймеров, фланкирующих сайты интеграции выявленных инсерций.

3. Проведено исчерпывающее генотипирование геномных ДНК здоровых доноров и пациентов с OJIJI по 53 Л/и-маркерам. Впервые определены частоты встречаемости 53 инсерций Alu у городского населения московского региона, 10 инсерций — в четырех этнических группах населения России.

4. Впервые показаны достоверные различия частот встречаемости 5 инсерций Alu-ретроэлементов у пациентов с острым лимфобластным лейкозом и здоровых доноров.

5. Осуществлен массированный функциональный анализ 31 полиморфной инсерции Alu-ретроэлементов в лимфоидных клетках здоровых доноров и пациентов с OJUI. Показано выраженное снижение количества транскриптов Alu-содержащих аллелей 22 генов.

6. Предложены пути совершенствования подхода для функционального анализа полиморфных инсерций Aluразработана тест-система для мониторинга эффекта «смены матрицы» при обратной транскрипции in vitro.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Амосова А. Л., Комков А. Ю., Устюгова С. В., Мамедов И. 3., Лебедев Ю. Б. Ретропозоны в эволюции генома современного человека. Биоорганическая химия. 2009. Т.35. № 6. С.779−788.

2. Комков А. Ю., Лебедев Ю. Б., Швец В. И. Разработка тест-системы для анализа эффекта «смены матрицы» при обратной транскрипции in vitro. Вестник МИТХТ. 2011. Т.6. № 6. С.77−83.

3. Комков А. Ю., Масчан М. А., Швец В. И., Лебедев Ю. Б. Функциональный анализ полиморфных инсерций ^/м-ретроэлементов при остром лимфобластном лейкозе. Биоорганическая химия. 2012. Т.38. № 3. С.282−289.

4. Комков А. Ю., Амосова А. Л., Лебедев Ю. Б. Влияние полиморфных инсерций Alu-элементов на экспрессию генов человека. «Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина» и «V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров». Москва, 21−28 июня 2009 (Тезисы докладов, часть II, стр. 62).

5. Лебедев Ю. Б., Комков А. Ю., Устюгова С. В., Амосова А. Л., Мамедов И. 3. Разработка систем функциональных маркеров для прогнозирования и индивидуальной терапии онкологических заболеваний крови. «Фундаментальные науки — медицине». Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2009 году. М.: Фирма «Слово», 2009, стр. 56.

6. Лебедев Ю. Б., Комков А. Ю., Мамедов И. 3., Амосова А. Л., Устюгова С. В., Разработка систем функциональных маркеров для прогнозирования и индивидуальной терапии онкологических заболеваний крови. «Фундаментальные науки — медицине». Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2010 году. М.: Фирма «Слово», 2010, стр. 66.

7. Комков А. Ю., Швец В. И., Лебедев Ю. Б. Создание молекулярно-генетических маркеров на основе полиморфных инсерций, А /и-ретроэлементов. Московская международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов». Москва, 15−17 марта 2010 (Материалы конференции, стр. 461−462).

8. Комков А. Ю., Лебедев Ю. Б. Функциональный анализ полиморфных инсерций Alu ретроэлементов в геноме человека. Международная конференция «Проблемы популяционной и общей генетики». Москва, 14−16 ноября 2011 (Сборник тезисов, стр. 140−141).

9. Лебедев Ю. Б., Комков А. Ю., Масчан М. А., Курносов А. А., Мамедов И. 3. Функциональный анализ полиморфных Alu-ретроэлементов при остром лимфобластном лейкозе. «Фундаментальные науки — медицине». Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2011 году. М.: Фирма «Слово», 2011, стр. 77.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает благодарность Инюшкиной Е. В. (МООД, Балашиха), Мальцевой М. А (МДГКБ, Москва), Масчану М. А. (РДЬСБ, Москва) за помощь в создании выборки образцов лимфоидных клеток пациентов с ОЛЛ и Артамоновой И. И. (ИППИ РАН, Москва) за помощь при биоинформатическом анализе кластеров молодых Л/м-элементов.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» и РФФИ 11−04−1 159а.