Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов

Тромбоциты — это безъядерные клетки крови, основной функцией которых является участие в свертывании крови, процессе, предотвращающем кровопотерю при повреждении кровеносного сосуда. Повреждение кровеносного сосуда приводит к активации системы гемостаза, включающей плазменное и тромбоцитарное звенья. Основные активаторы тромбоцитов это коллаген, высвобождающийся при повреждении сосуда, тромбин, ключевой белок каскада плазменного гемостаза, АДФ и тромбоксан А2, секретируемые тромбоцитами в процессе активации. При активации тромбоцит может изменять форму, подвергаться адгезии в месте повреждения, агрегировать с другими тромбоцитами, секретировать различные вещества, формировать прокоагулянтную поверхность, содержащую фосфатидилсерин, и отделять микровезикулы.

Интактные тромбоциты, как и большинство других клеток человека, поддерживают асимметрию плазматической мембраны. Отрицательно заряженные фосфолипиды фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин АТФ-зависимым образом переносятся с внешнего слоя мембраны на внутренний при помощи специфичных фосфолипидтранслоказ и флипазы. Однако в тромбоцитах эти ферменты не обнаружены. Также существуют указания на то, что в определенных условиях осуществляется обратный АТФ-зависимый перенос отрицательно заряженных фосфолипидов на внешний слой плазматической мембраны, однако фермент, который мог бы быть в этом задействован (уже названый скрамблазой), до сих пор не выявлен.

Способность тромбоцитов экспрессировать фосфатидилсерин на внешнем слое мембраны является чрезвычайно важной для сбалансированного функционирования всей системы гемостаза, поскольку фосфатидилсерин в составе мембраны обеспечивает нормальную работу многих белков плазменного гемостаза, значительно ускоряя их реакции. Пациенты с синдромом Скотта, врожденной патологией тромбоцитов, при которой нарушаются механизмы экспрессии фосфатидилсерина, страдают от кровоточивости. в результате снижения активности теназного и протромбиназного комплексов. Таким образом, изучение процессов внутриклеточной сигнализации, регулирующих экспрессию фосфатидилсерина тромбоцитами, представляется важной и актуальной задачей.

Известно, что только сильные активаторы, такие как тромбин и коллаген, приводят к экспрессии фосфатидилсерина и разделению всех тромбоцитов на две субпопуляции, обладающие различными свойствами. Формируется субпопуляция так называемых укутанных тромбоцитов, которые экспрессируют фосфатидилсерин и связывают различные белки альфа-гранулярного происхождения. Именно укутанные тромбоциты обладают прокоагулянтными свойствами и существенно ускоряют реакции плазменного гемостаза.

Очень мало известно о механизмах формирования субпопуляций тромбоцитов. Показано, что добавление различных активаторов в различных дозах in vitro ведет к формированию разного числа укутанных тромбоцитов, что говорит о том, что гетерогенность тромбоцитов развивается именно в процессе активации. Существует ряд косвенных свидетельств участия различных митохохондриальных процессов и кальциевой сигнализации в экспрессии фосфатидилсерина. Одной важной и загадочной деталью, касающейся укутанных тромбоцитов, является тот факт, что интегрин аПЬрЗа, основной белок, обеспечивающий агрегацию тромбоцитов, в них, в отличие от неукутанных тромбоцитов, не активен. Несмотря на большое количество противоречивых данных об агрегации тромбоцитов различных субпопуляций, в настоящее время появляется все больше указаний на сниженную агрегационную способность укутанных тромбоцитов.

В большинстве работ, посвященных изучению субпопуляций активированых тромбоцитов, использовались достаточно сильно разбавленные препараты тромбоцитов, в которых концентрация тромбоцитов составляла около 1×107/мл, что на порядок ниже их физиологической концентрации. Таким образом, в данный момент существует необходимость детального изучения процессов, происходящих в тромбоцитах при их активации в физиологической концентрации, что, возможно, позволит прояснить ряд противоречий и выявить дополнительные механизмы, ведущие к экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов. В этой связи данная работа посвящена исследованию экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации.

Цель работы: Изучить свойства и механизмы формирования фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов в физиологических концентрациях.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальный внутриклеточный Сафлуорофор, подходящий для достоверной оценки изменений концентраций кальция, характерных для сильной активации тромбоцитов.

2. Исследовать кальциевую сигнализацию в тромбоцитах при использовании различных активаторов.

3. Исследовать зависимость кальциевой сигнализации и экспрессии фосфатидилсерина от концентрации активированных тромбоцитов.

4. Выявить механизмы, регулирующие экспрессию фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации.

Научная новизна. При активации тромбоцитов в физиологических.

Я Я концентрациях (2×10 /мл-4><10 /мл) впервые выявлена гетерогенность среди ФС-положительных тромбоцитов. Помимо известной ранее ФС-положительной субпопуляции с устойчиво повышенной концентрацией внутриклеточного кальция, выявлена новая, также ФС-положительная субпопуляция с низкой концентрацией кальция, не превышающей уровня, характерного для неактивированных тромбоцитов. Для тромбоцитов новой 6.

ФС-положительной субпопуляции характерны высокие значения прямого и бокового светорассеяния, способность связывать фибриноген/фибрин и наличие активного интегрина allb?3a. Показано, что секреция тромбоцитов в процессе активации увеличивает количество тромбоцитов в обеих ФС-положительных субпопуляциях, но не влияет на соотношение между ними. Показано, что тромбоциты новой субпопуляции формируются в результате межклеточных взаимодействий с участием интегрина allb?3a. При снижении у концентрации активируемых тромбоцитов ниже 5×107мл, вновь выявленная вторая ФС-положительная субпопуляция не образуется.

Научно-практическое значение. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на роль активации тромбоцитов в свертывании крови. Тромбоциты вновь открытой субпопуляции, сочетающие прокоагулянтные и агрегационные способности, представляются наиболее важными участниками свертывания крови. Полученные результаты по-новому раскрывают роль межклеточных взаимодействий в процессе активации тромбоцитов. Также результаты, полученные в работе, дают новое представление о возможном дополнительном влиянии на гемостаз антагонистов интегрина allb?3a, использующихся в терапии сердечнососудистых заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1) Концентрации кальция, наблюдаемые в тромбоцитах при сильной активации, находятся в пределах динамического диапазона флуоресцентного Са2±флуорофора Fura Red. В отличие от Calcium Green-1, она может использоваться для исследования кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов крови.

2) Экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами сопровождается продолжительным увеличением концентрации кальция в цитоплазме.

3) При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях формируется новая субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, которая характеризуется: а) низким уровнем внутриклеточного кальция б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных тромбоцитов в) поверхностью, покрытой фибриногеном г) наличием активированного интегрина аПЬрЗ, в отличие от ранее описанных укутанных тромбоцитов.

4) Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через интегрин аПЬрЗ в процессе активации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Тромбоциты.

Тромбоциты — это безъядерные клетки крови, циркулирующие в крови в концентрации 180 000−320 000 мкл" 1. Тромбоциты имеют дисковидную форму с характерным диаметром 2−4 мкм. Тромбоциты формируются в красном костном мозге, отделяясь от клеток-предшественников мегакариоцитов, циркулируют в кровотоке в течение 2−10 дней с момента образования, после чего удаляются из кровотока посредством фагоцитоза в селезенке и печени.

Основной функцией тромбоцитов является препятствование кровопотере при повреждении кровеносного сосуда. Также тромбоциты участвуют в регенерации поврежденных тканей, секретируя факторы роста, стимулирующие рост и деление поврежденных клеток.

Свертывание крови.

Свертывание крови — это комплекс ответов организма, препятствующих кровопотере при повреждении кровеносного сосуда. Этот процесс принято условно разделять на три составляющие: сосудистый гемостаз, обеспечивающий сужение кровеносного сосуда в месте повреждения, тромбоцитарный гемостаз, состоящий в активации тромбоцитов и их адгезии в месте повреждения, и плазменный гемостаз, состоящий в образовании фибринового сгустка.

Плазменный гемостаз представляет собой каскад реакций, в которых принимают участие растворимые белки плазмы крови, сериновые протеиназы, называемые факторами свертывания. Данный каскад реакций инициируется особым трансмембранным белком тканевым фактором, который присутствует на поверхности практически всех клеток организма, за исключением эндотелия, непосредственно контактирующего с кровотоком. Каскад реакций приводит к преобразованию неактивного белка протромбина в тромбин, являющийся центральным элементом плазменного гемостаза. Тромбин расщепляет растворимый белок фибриноген с образованием нерастворимого фибрина, который, полимеризуясь, образует фибриновую сеть, препятствующую кровопотере.

Тромбоцитарный гемостаз состоит в активации тромбоцитов и их адгезии в месте повреждения. Повреждение сосуда приводит к высвобождению коллагена, который является сильнейшим активатором тромбоцитов. Новые тромбоциты, принесеные кровотоком к месту повреждения, участвуют в агрегации, что препятствует кровопотере.

Разделение гемостаза на отдельные составляющие является достаточно условным, все три системы неразрывно связаны друг с другом. Так, тромбин является сильным активатором тромбоцитов, а секреция тромбоцитов в процессе активации способствует сужению просвета сосуда. Кроме того, ключевую роль в плазменном гемостазе играют комплексы внутренней теназы (комплекс факторов 1Ха-ХШа) и протромбиназы (комплекс факторов Ха-Уа), ферментативная активность которых возрастает в 3−5 раз в присутствии мембранной поверхности, предоставляемой активированными тромбоцитами 2. Стоит также отметить, что различные звенья играют более или менее важную роль в гемостазе в зависимости от размера сосуда и скорости кровотока.

Активация тромбоцитов.

В условиях целостности кровеносного сосуда тромбоциты циркулируют в крови в неактивированном состоянии, однако, по своей природе тромбоциты способны реагировать на малейшие нарушения целостности кровеносного русла. Существует огромное количество веществ и факторов, способных переводить тромбоцит в активированное состояние, вплоть до простого механического воздействия или изменения температуры .

Среди многообразия этих факторов можно выделить основные вещества, способные активировать тромбоциты. Выделяют четыре главных активатора тромбоцитов. Наиболее сильные из них — коллаген и тромбин, другие дваэто АДФ и тромбоксан А2. Коллаген — это основной белок соединительной ткани человека, обеспечивающий ее прочность и эластичность. При повреждении кровеносного сосуда волокна коллагена приходят в контакт с кровью, что приводит к адгезии тромбоцитов и их последующей активации. Сериновая протеиназа тромбин представляет собой ключевой элемент всего гемостаза, поскольку соединяет в себе функции главного фермента плазменного свертывания, расщепляющего фибриноген с образованием фибрина, и сильного активатора тромбоцитов. АДФ в высочайшей концентрации содержится в плотных гранулах тромбоцитов и секретируется во внеклеточное пространство в процессе их активации. В крови присутствуют ферменты, которые в дальнейшем расщепляют АДФ до АМФ и, таким образом, предотвращают возможную активацию тромбоцитов вне места повреждения. Тромбоксан А2 синтезируется в тромбоцитах в процессе их активации из арахидоновой кислоты и в дальнейшем выбрасывается во внеклеточное пространство.

Помимо описанных выше физиологических активаторов существует большое количество нефизиологических, которые в основном применяются в экспериментах in vitro. Одно из таких веществ это конвульксин, выделяемый из яда змеи, который способен активировать главный коллагеновый рецептор тромбоцитов гликопротеина VI4. Также существуют пептиды SFLLRN и AY-NH2, активирующие отдельные тромбиновые PAR-рецепторы, стабильный аналог тромбоксана А2 U46619, а также кальциевые ионофоры, вызывающие вход ионов кальция через плазматическую мембрану в цитоплазму тромбоцитов 5″ 7.

Основные виды ответов тромбоцитов при активации.

Активация тромбоцита — это сложный комплекс внутриклеточных сигнальных процессов, которые в конечном счете приводят к тем или иным ответам. Стоит отметить, что различная активация ведет к различным ответам тромбоцитов. Эти ответы можно условно разделить на более и менее значительные: некоторые из этих ответов проявляются и при относительно.

2 ^ слабой активации, а какие-то требуют более сильной активации. При всей условности такой градации, ответы тромбоцитов перечислены ниже в порядке увеличения значимости.

1) Изменение формы. В интактном состоянии тромбоцит имеет характерную дисковидную форму, что обуславливает альтернативное название тромбоцитов «кровяные пластинки», а также их англоязычное название «platelets» (доел, «тарелочки»). Активация тромбоцита приводит к реорганизации актинового цитоскелета, что приводит к изменению формы тромбоцита: из дисковидного он становится шаровидным 8. Более сильная активация приводит к формированию тромбоцитами псевдоподий. Активация тромбоцита в потоке может приводить к его распластыванию по поверхности, к которой происходит адгезия тромбоцитов 9'10.

2) Адгезия в месте повреждения. Первоочередной задачей, которая стоит перед тромбоцитом при повреждении кровеносного сосуда, является адгезия в местуе повреждения. Как было сказано выше, при повреждении сосуда высвобождаются волокна коллагена, к которому способны прикрепляться тромбоциты. Первичное прикрепление тромбоцитов происходит при связывании тромбоцитарного рецептора гликопротеина Ib-IX-V с коллагеном через фактор фон Виллебранда. Считается, что такое связывание практически не вызывает активации тромбоцита, его активация происходит при дальнейшем связывании коллагена с рецептором гликопротеином VI, что обеспечивает более прочную и необратимую адгезию тромбоцита в месте повреждения 3'10−11.

Существует ряд заболеваний, при которых нарушается способность тромбоцитов адгезировать к месту повреждения., что ведет к кровоточивости. Наиболее распространенным из них является болезнь фон Виллебранда, при которой имеет место дисфункция или отсутствие фактора фон Виллебранда, что приводит к кровотечениям. Еще одним, более редким заболеванием является синдром Бернара-Сулье, обусловленный отсутствием или дисфункцией гликопротеина Ib-IX-V, что, как и в случае болезни фон.

Виллебранда, ведет к кровоточивости .

Стоит отметить, что тромбоциты обладают способностью к адгезии на различных поверхностях, что зачастую используется в экспериментах in vitro. В частности, тромбоциты способны прочно и необратимо связываться со стеклянной поверхностью, на которой иммобилизирован фибриноген, что с успехом применяется в экспериментах по изучению тромбоцитов в 9 проточных камерах .

3) Агрегация. Вышеописанный механизм адгезии тромбоцитов к коллагеновым волокнам в сущности позволяет тромбоцитам сформировать монослой в месте повреждения сосуда, чего явно недостаточно для предотвращения кровопотери. После формирования такого монослоя новые тромбоциты приносятся кровотоком, активируются и приобретают способность агрегировать с уже закрепившимися тромбоцитами. Агрегация клеток и взаимодействия между ними происходят благодаря наличию трансмембранных белков, называемых интегринами. Эти белки представляют собой гетеродимеры, состоящие из субъединиц, а и р. Основной интегрин, обеспечивающий агрегацию тромбоцитов, — это интегрин аПЬрЗа, также называемый гликопротеином Ilb-IIIa. Этот интегрин присутствует только в тромбоцитах, и обеспечивает их агрегацию за счет способности связывать фибриноген и другие белки, присутствующие в плазме крови. Активация тромбоцита приводит к активации интегрина аПЬрЗа, которая происходит вследствие изменения его конформации. В результате значительно повышается сродство к фибриногену, и между разными тромбоцитами при участии интегринов образовываются.

13 15 фибриногеновые «мостики» «.

Существует множество заболеваний, при которых нарушается агрегация тромбоцитов. К наиболее распространенным из них относятся тромбастения Гланцмана, заболевание, обусловленное дисфункцией или отсутствием интегрина аПЬрЗа. Еще одним таким заболеванием является афибриногенемия, при которой наблюдается полное или частичное уменьшение количества фибриногена 12.

Вообще, способность тромбоцитов к агрегации в той или иной степени нарушается при множестве заболеваний совершенно различной природы. Способность тромбоцитов к агрегации, наряду с концентрацией тромбоцитов в крови, является наиболее важным клиническим показателем функции тромбоцитов. Способность тромбоцитов к агрегации оценивается в тесте агрегометрии, в котором тромбоциты активируются тем или иным активатором в специальной освещаемой кювете и подвергаются перемешиванию. О способности тромбоцитов к агрегации судят по изменению светопропускания образца 16.

4) Секреция. В тромбоцитах содержатся два типа гранул, клеточных органелл, в которых запасаются различные вещества. Это плотные гранулы, содержащие нуклеотиды (АТФ, АДФ, ГТФ, ГДФ), а также ионы кальция в высокой концентрации, и ос-гранулы, содержащие различные белки, такие как Р-селектин, фактор фон Виллебранта, фибронектин, фибриноген, тромбоспондин, а также некоторые хемокины и факторы свертывания крови. Активация тромбоцита приводит к секреции гранул, то есть выбросу их.

17' 18 содержимого во внеклеточное пространство ' .

Существует ряд нарушений функции тромбоцитов, так или иначе связанных с секрецией. К ним относятся, в частности, описанная выше афибригенемия, а также синдром серых тромбоцитов. При этом заболевании наблюдается снижение количества альфа-гранулярных белков, тромбоциты имеют неестественно крупный размер12.

5) Формирование прокоагулянтной поверхности и везикуляция. Как и большинство клеток организма, тромбоциты в интактном состоянии поддерживают асимметрию плазматической мембраны. Отрицательно заряженные фосфолипиды фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин при участии ферментов флипазы и специфических фосфолипидтранслоказ АТФ-зависимым образом переносятся из внешнего слоя мембраны во внутренний 19,20. Активация тромбоцита приводит к потере асимметрии плазматической мембраны и экспрессии фосфатидилсерина. Мембранные поверхности, содержащие фосфатидилсерин, называются прокоагулянтными, поскольку они критически важны для протекания реакций плазменного гемостаза. В частности они важны для реакции внутренней теназы (комплекс факторов IXa-XIIIa), которая катализирует переход фактора X в активную форму, и протромбиназы (комплекс факторов Xa-Va), которая катализирует переход.

21 '22 протромбина в тромбин '. Описанные выше реакции в присутствии прокоагулянтной поверхности активированных тромбоцитов ускоряются на.

3−5 порядков .

Также тромбоциты в процессе активации могут отщеплять прокоагулянтные микровезикулы, мембранные частицы диаметром до 1 мкм 22,24. Микровезикулы различного происхождения (от тромбоцитов, моноцитов или клеток эндотелия) хорошо охарактеризованы, в экспериментах in vitro убедительно доказано, что микровезикулы могут усиливать генерацию тромбина, а также влиять на формирование и стабильность фибринового сгустка 25. Физиологическая роль везикуляции на данный момент не ясна, однако известно, что микровезикулы различного происхождения могут.

26 28 играть роль в развитии некоторых сердечно-сосудистых заболеваний ". В частности, существуют данные о существенном повышении уровня микровезикул в крови пациентов, склонных к тромботическим осложнениям.

Несмотря на то, что механизмы экспрессии фосфатидилсерина изучены недостаточно хорошо, известна патология, при которой этот процесс существенно нарушен. Это синдром Скотта, при котором за счет нарушения экспрессии фосфатидилсерина описанные выше теназный и протромбиназный комплексы работают недостаточно эффективно, что ведет.

12 к неполной активации фактора X и протромбина .

Рецепторы тромбоцитов и основные пути внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах.

Как было сказано выше, существует огромное число веществ, способных вызывать активацию тромбоцитов. В данном разделе будут более подробным образом изложены основные рецепторы тромбоцитов и сигнальные пути, задействованные в их активации. Общая схема сигнальных путей, задействованных в активации тромбоцитов, изображена на рисунке 1.1.

1) Рецепторы коллагена.

В тромбоцитах существует три основных рецептора коллагена: гликопротеин 1Ь-1Х-У, интегрин а2{31 и гликопротеин VI (СРУ1). Первый взаимодействуют с коллагеном через фактор фон Виллебранта, два последних — непосредственно. Считается, что первые два рецептора отвечают скорее за прикрепление тромбоцита к поврежденной поверхности, чем за его активацию. Сигнализация через эти два рецептора вызывает лишь изменение формы тромбоцита за счет реорганизации цитоскелета, что ведет к его более плотному прикреплению к месту повреждения сосуда.

Рисунок 1.1. Схема основных сигнальных путей, задействованных в активации тромбоцитов.

После прикрепления тромбоцита происходит его активация через гликопротеин VI. Это один из наиболее сильных типов активации тромбоцита, ведущий к проявлению всех характерных для активации ответов, которые удобно исследовать с использованием активатора гликопротеина VI конвульксина. Коллаген вызывает кластеризацию молекул гликопротеина VI, что ведет к кросс-фосфорилированию рецептора и дальнейшему связыванию и активации Syk-киназы. Syk-киназа далее активирует у-изоформу фосфолипазы С (PLC), которая гидролизирует мембранный фосфолипид фосфотодилинозитол 4,5-дифосфат с образованием инозитол 1,4,5-трифосфата (IP3) и диацилглицерола (DAG). Инозитолтрифосфат диссоциирует в цитоплазму, связывается с рецептором на мембране плотных гранул, что вызывает открытие кальциевых каналов, выход ионов кальция в цитоплазму из плотных гранул и дальнейший вток кальция в цитоплазму из внеклеточного пространства. Далее происходит активация различных изоформ протеинкиназы С и активация каскада фосфорилирования 3'п'29″ 31.

2) Рецепторы тромбина.

В тромбоцитах существует два основных рецептора тромбина — это так называемые PARI и PAR4 (PAR от protease activated receptor) рецепторы. Эти рецепторы очень схожи друг с другом по сигнальным путям, которые инициируются их активацией, и по ответам, вызываемым их специфичными пептидами-активаторами. Оба эти рецептора относятся к семейству сопряженных с G-белками рецепторов и, предположительно, оба связаны с белками Gi, Gq и G12/13. Основным существенным отличием этих двух рецепторов является на два порядка различающееся сродство к тромбину (1 и 100 нМ, соответственно), что, вероятно, может предполагать различие в активации тромбоцитов при низких и высоких концентрациях тромбина. Активация тромбоцитов тромбином считается достаточно сильной и, так же как активация через гликопротеин VI, способна вызывать все известные ответы тромбоцитов.

Активация РАЛ-рецепторов происходит посредством отщепления Ы-концевого пептида, что приводит к появлению нового N-концевого пептида, который и является ковалентно привязанным активатором. Являющиеся ГТФ-азами гетеротримерные О-белки, в неактивном состоянии а-субъединицей связывают ГДФ, который при активации меняется на ГТФ, что приводит к диссоциации а-субъединицы. Субъединица Gqa активирует Р-изоформу фосфолипазы С, которая гидролизирует мембранный фосфолипид фосфотодилинозитол 4,5-дифосфат с образованием инозитол 1,4,5-трифосфата и диацилглицерола. Далее происходит выход ионов кальция, активация протеинкиназы С и активация нижележащего каскада фосфорилирования. Субъединица 01а ингибирует фермент аденилатциклазу, катализирующую синтез цАМФ, в результате чего происходит снижение уровня цАМФ и усиление ответа тромбоцита. Субъединица 012/1 За активирует так называемые факторы обмена гуаниновых нуклеотидов.

31 35.

ОЕРз), стимулирующие нижележащие сигнальные процессы " .

3) Рецепторы АДФ.

В тромбоцитах существует два основных рецептора АДФ, называемых пуринэргическими рецепторами. Это рецепторы Р2У1 и Р2У12. Рецепторы Р2У1 и Р2У12 являются, подобно РА11-рецепторам, О-белок связанными рецепторами, однако, в отличие от них, они связаны с различными О-белками. Так, рецептор Р2У1 связан с белком Од, в то время как Р2У12 связан с белком 01. В соответствии с этим, активация тромбоцита через рецептор Р2У1 ведет к активации фосфолипазы С, выбросу кальция и активации протеин киназы С, в то время как активация через рецептор Р2У12.

31 -36 39 ведет к ингибированию аденилатциклазы ' «.

Таким образом, основные начальные этапы сигнализации в тромбоцитах достаточно единообразны. Они состоят либо в активации инозитолтрифосфатного пути различными изоформами фосфолипазы С, либо в ингибировании аденилатциклазы. К сожалению, более поздние этапы сигнализации изучены недостаточно хорошо.

Кальциевая сигнализация в тромбоцитах.

Ионы кальция являются универсальным и исключительно важным сигнальным веществом во многих клетках организма. Как правило, концентрация кальция в цитоплазме клетки поддерживается на исключительно низком уровне благодаря АТФ-зависимому транспорту во внеклеточное пространство и такие органеллы, как эндоплазматический ретикулум и митохондрии. Различные воздействия на клетки организма могут приводить к повышению концентрации кальция в цитоплазме, которое стимулирует те или иные ответы клеток 40. Кальциевый ответ клетки на стимуляцию может быть более сложным, чем простое увеличение его концентрации: иногда наблюдаются колебания или даже волны в изменениях.

41 концентрации цитоплазматического кальция .

В неактивированном тромбоците концентрация кальция поддерживается на уровне десятков нМ 42,42. Активация тромбоцита многими веществами может приводить к быстрому и резкому росту концентрации кальция в цитоплазме благодаря активации фосфолипазы С и синтезу инозитолтрифосфата. Концентрация кальция в цитоплазме тромбоцита в процессе активации может возростать на порядок и составлять десятки мкМ 42,43. Кальциевая сигнализация является важнейшим сигнальным элементом, задействованным в активации тромбоцитов. Огромное количество сигнальных молекул и трансмембранных белков, таких как интегрин аПЬ (ЗЗа, имеют сайты связывания ионов кальция и могут напрямую ими активироваться 13. Эксперименты с использованием кальциевых ионофоров показали, что вход ионов кальция в цитоплазму может напрямую вызывать такие ответы тромбоцита как изменение формы, секреция гранул и формирование прокоагулянтной поверхности 7'8'44. Кроме того известно что, использование кальциевых хелаторов, таких как ВАРТА АМ, может негативно регулировать активацию тромбоцитов45'46.

Существует огромное количество работ, в которых исследовали кальциевую сигнализацию в тромбоцитах 46~50. Для этих целей использовали различные методы: флуориметрию, проточную цитометрию и флуоресцентную микроскопию (более подробно методы исследования кальциевой сигнализации будут ниже). Наибольший интерес представляют работы, в которых изучали кальциевый ответ индивидуальных тромбоцитов, а не всех тромбоцитов суспензии.

•>0П.

K.U т.

A UP ii I h И1 i v 's" V Л ль «/ * 'Д// V’jVV.

IL1JL.

V.

I 1 т so.

Tiriii? *!:•;

I >

Рисунок 1.2. Кальциевые^колебания в тромбоците при активации АДФ. Тромбоциты закреплялись на подложку с иммобилизованным фибриногеном и активировались АДФ. При помощи цифровой видеокамеры фиксировались изменения флуоресценции краски fura-2. Представлена зависимость флуоресценции краски fura-2 от времени. Heemskerk JW, Hoyland J, Mason WT, Sage SO. Biochem J. 1992 Apr 15−283.

Дж. Хеемскерк с коллегами изучали кальциевую сигнализацию в тромбоцитах, прикрепленных к подложке с иммобилизованным фибриногеном, методом флуоресцентной микроскопии 47. Тромбоциты предварительно загружались флуоресцентным красителем fura-2, меняющим интенсивность флуоресценции в зависимости от концентрации внутриклеточного кальция. В данной работе показано, что активация тромбоцитов АДФ приводит к установлению нерегулярных колебаний концентрации цитоплазматического кальция на протяжение по крайней мере нескольких минут. Типичная зависимость флуоресценции fura-2 от времени.

20 представлена на рисунке 1.2. Парадоксальным образом, увеличение концентрации АДФ ведет скорее к росту частоты наблюдаемых колебаний, но не к увеличению их амплитуды. Активация тромбоцитов тромбином приводит к быстрому росту концентрации кальция, колебаний при этом не наблюдается.

Субпопуляции активированных тромбоцитов.

В начале 1990;х годов в литературе впервые появилась информация о том, что не все тромбоциты, формируемые в процессе активации, обладают одинаковыми свойствами. В 1992 году было впервые замечено, что при активации тромбоцитов коллагеном или тромбином с коллагеном только часть тромбоцитов экспрессирует фосфатидилсерин 51. В 1996 году впервые появились косвенные данные о том, что экспрессия фосфатидила частью со тромбоцитов является кальций-зависимым событием. В 1998 году аналогичный феномен деления тромбоцитов на две группы с разными уровнями экспрессии фосфатидилсерина наблюдали в эксперименте по активации тромбоцитов в результате их адгезии на коллагеновую подложку со В 2000 году было показано, что при активации тромбином и конвульксином только часть тромбоцитов приобретает способность связывать фактор V 44. Тогда же авторами был впервые предложен термин COAT platelets (collagen and thrombin induced platelets) для обозначения тромбоцитов, связывающих фактор V 44'54. Впоследствии название таких тромбоцитов несколько трансформировалось, и их стали называть укутанными тромбоцитами (coated platelets), поскольку поверхность таких тромбоцитов покрыта слоем белков альфа-гранулярного происхождения 55.

Итак, любая сильная активация тромбоцитов (тромбином, конвульксином, тромбином с конвульксином, а также пептидами-активаторами PAR-рецепторов) приводит к разделению тромбоцитов на две субпопуляции, называемые укутанными и неукутанными тромбоцитами 44'55. Данный феномен активно изучался в последние десятилетия.

Первым и наиболее важным с точки зрения физиологии свойством укутанных тромбоцитов является экспрессия фосфатидилсерина. Оценка экспрессии фосфатидилсерина производится путем окраски исследуемых клеток флуоресцентно меченным аннексином V, белком, специфично и кальций-зависимо связывающимся с фосфатидилсерином 51. На рисунке 1.3 представлены распределения тромбоцитов по флуоресценции меченного аннексина V до и после активации тромбином с конвульксином 44. Видно, что активированные тромбоциты (серая кривая) разделяются на две группы, лишь одна из которых (регион М2) связывает аннексии V, что говорит об экспрессии фосфатидилсерина такими клетками. Следует отметить, что неукутанные тромбоциты практически не отличаются от неактивированных по уровню связывания аннексина V, в то время как укутанные тромбоциты связывают его на 3 порядка лучше. Таким образом, можно говорить о том, что лишь укутанные тромбоциты, образующиеся в процессе активации, экспрессируют фосфатидилсерин, необходимый для ускорения реакций теназного и протромбиназного комплексов. Данный факт свидетельствует об исключительной физиологической важности укутанных тромбоцитов, способных поддерживать генерацию тромбина в районе места повреждения сосуда.

Укутанные тромбоциты получили свое название вследствие того, что поверхность таких тромбоцитов покрыта слоем белков альфа-гранулярного происхождения. Это было впервые показано в работе 56, в которой тромбоциты активировались тромбином с конвульксином, окрашивались антителами к различным альфа-гранулярным белкам и анализировались при помощи проточной цитометрии. В данной работе показано, что укутанные тромбоциты содержат на своей поверхности такие белки, как фактор V, фибриноген, фактор фон Виллебранта, фибронектин, антиплазмин и тромбоспондин. Существует ряд работ, в которых показана роль серотонина в пришивании альфа-гранулярных белков к поверхности укутанных тромбоцитов 56'57. Показано, что укутанные тромбоциты способны связывать такие факторы плазменного свертывания как факторы IXa, VIII, IX, X и протромбин 45−58−59. Пантелеев М. А. в своих исследованиях продемонстрировал, что укутанные тромбоциты предоставляют сайты связывания для факторов Xla, VIII и X, входящих в состав теназного.

60 комплекса .

Рисунок 1.3. Гетерогенность тромбоцитов. Представлены распределения тромбоцитов по флуоресценции фикоэритрин-меченного антитела на фактор V. Тромбоциты активировали 5 нМ тромбина и 500 нг/мл конвульксина. Черная кривая соответствует распределению неактивированных тромбоцитов, серые областиактивированным.

Dale G. L. et al. Blood. 2000. Mar 1−95(5): 1694−702.

Стоит отметить, что связывание альфа-гранулярных белков на тромбоците происходит только в присутствии тромбина. При активации тромбоцитов конвульксином, пептидами-активаторами РАЯ-рецепторов или кальциевым ионофором формируется субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, но не способных связывать альфа-гранулярные белки 55. Вероятно, связывание альфа-гранулярных белков с поверхностью укутанных тромбоцитов обуславливается ферментативной активностью тромбина, но не сигнальными путями, запускающимися в тромбоцитах в ходе активации. Недавно было показано, что ферменты трансглутаминазы, в частности фактор ХШа, участвуют в формировании укутанных тромбоцитов 56'61. Таким образом, связывание белков с поверхностью тромбоцитов может иметь место в результате работы трансглутаминаз, которые могут ковалентно сшивать белки друг с другом и с поверхностью тромбоцита. Однако, существует альтернативная гипотеза, согласно которой такое связывание может быть обусловлено полимеризацией фибрина на поверхности укутанных тромбоцитов 63.

Еще одной важной особенностью укутанных тромбоцитов является способность отделять прокоагулянтные микровезикулы. Микровезикулыэто мембранные образования менее 1 мкм в диаметре, содержащие фосфатидилсерин во внешнем слое мембраны и обладающие.

23*24 прокоагулянтной активностью '. Показано, что укутанные тромбоциты в процессе активации отделяют до 25 таких микровезикул в результате отшнуровывания псевдоподий 55'64. Источниками микровезикул могут служить и другие клетки организма, в частности клетки эндотелия и моноциты 25'27. Физиологическая роль этих в высшей степени прокоагулянтных частиц не ясна. Микровезикулы циркулируют в крови здоровых доноров в незначительных концентрациях, их уровень может существенно повышаться при различных сердечно-сосудистых заболеваниях, сопровождающихся тромботическими осложнениями.

Еще одной исключительно важной особенностью укутанных тромбоцитов является наличие неактивированного интегрина аПЬрЗа на поверхности таких клеток, впервые продемонстрированное Дж. Дейлом в 2002 году 56. В данной работе тромбоциты окрашивали меченными аннексином V и антителом РАС-1 (антителом к активной изоформе интегрина аПЬрЗа). На рисунке 1.4 представлена типичная точечная диаграмма флуоресценции антитела РАС-1 (ось абсцисс) и аннексина V (ось ординат). Из рисунка видно, что укутанные тромбоциты (выделенные на рисунке в квадратный регион) связывают антитело РАС-1 в значительной степени хуже, чем неукутанные тромбоциты. Таким образом, интегрин аПЬрЗа, важнейший белок, обеспечивающий агрегацию тромбоцитов, неактивен на поверхности укутанных тромбоцитов. Этот факт наводит на гипотезу о том, что укутанные тромбоциты обладают пониженной способностью вовлекаться в тромбоцитарные агрегаты, чем неукутанные тромбоциты. Существуют противоречивые данные об агрегации субпопуляций активированных тромбоцитов, и четкого ответа на данный вопрос в сейчас не существует 65'66. Стоит отметить, что активация интегрина аПЬрЗа и последующая агрегация является относительно слабым ответом тромбоцитов, имеющая место, например, при активации тромбоцитов АДФ. Таким образом, физиологическая роль укутанных тромбоцитов в гемостазе представляется противоречивой. С одной стороны, такие тромбоциты обладают прокоагулянтными свойствами, необходимыми для нормальной генерации тромбина, но, с другой стороны, дезактивация интегрина аПЬрЗа позволяет предположить, что такие тромбоциты в меньшей степени локализуются в месте повреждения кровеносного сосуда, поскольку не участвуют в формировании тромбоцитарного агрегата.

Механизмы внутриклеточной сигнализации, приводящие к разделению тромбоцитов на две субпопуляции, изучены недостаточно хорошо. Самым очевидным предположением о механизме такого разделения может состоять в том, что гетерогенность тромбоцитов берет свое начало в процессе их формирования в костном мозге. Другими словами, согласно такой гипотезе, конкретный тромбоцит еще до активации принадлежит к той или иной субпопуляции, что проявляется в тех или иных его ответах в ходе активации. Однако эта гипотеза не находит подтверждения, поскольку используя различные дозы и сочетания активаторов, можно варьировать численность субпопуляции укутанных тромбоцитах в пределах от 0% до 100% от общего числа тромбоцитов. Таким образом, разделение тромбоцитов на субпопуляции — процесс, происходящий именно в ходе активации, в соответствии с теми физиологическими условиями, в которые помещаются тромбоциты. in 102 mm цПкям ~ ¦ -a m., , * * «» / г ." % %i * «.

1G1 102 103 FL1-H.

Рисунок 1.4. Неактивный интегнин allb/ЗЗа на поверхности укутанных тромбоцитов. Представлена типичная точечная диаграмма распределения тромбоцитов, активированных тромбином с конвульксином, по флуоресценции атитела РАС-1 (ось абсцисс) и аннексина V (ось ординат). Dale GL et al. Nature. 2002:415:175−179.

В последние годы, в том числе в нашей лаборатории, активно изучался вклад различных механизмов внутриклеточной сигнализации в формировании укутаннных тромбоцитов. Котова Я. Н. в своих экспериментах при помощи различных фармакологических ингибиторов изучала роль сигнальных путей, в том числе киназных, в формировании укутанных тромбоцитов. Было показано, что аденилатциклазный, фосфоинозитид 3-киназный, 8гс тирозин киназный пути, но не МАРК киназный путь, в значительной степени задействованы в формировании укутанных тромбоцитов. Описанные выше пути регулируют формирование укутанных тромбоцитов, однако ни один из них не является контролирующим. Точные сигнальные механизмы, ведущие к формировании гетерогенности тромбоцитов, на данный момент неизвестны.

Также Котова Я. Н. анализировала вклады различных положительных обратных связей, обусловленных секрецией тромбоцитов в процессе активации, в формировании укутанных тромбоцитов. Было показано, что секреция АДФ, но не тромбоксана А2, положительно регулирует формирование укутанных тромбоцитов, увеличивая численность этой субпопуляции. Используя активаторы и ингибиторы отдельных пуринэргических рецепторов, Котова Я. Н. показала, что АДФ регулирует формирование укутанных тромбоцитов посредством сигнализации через рецептор Р2У1, но не Р2У12 67. Также, используя различные комбинации ингибиторов и активаторов тромбиновых РАЯ-рецепторов, Котова Я. Н. показала, что оба РАЯ-рецептора вносят существенный вклад в формирование укутанных тромбоцитов.

В работе П. Уолша было показано, что при активации ЗБЫЛШ важную роль в формировании тромбоцитарных субпопуляций вносит кальциевая сигнализация 45. Активация 8Р1ХЮЧ является нефизиологической, к тому же, как известно, активация БРЫЛЫ ведет к формированию субпопуляции тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, но не способных связывать альфа-гранулярные белки. Поэтому, вопрос о роли кальциевой сигнализации в формировании укутанных тромбоцитов изучен недостаточно хорошо.

В последние годы все чаще обсуждается возможная связь формирования укутанных тромбоцитов с процессами клеточной гибели — апоптозом и некрозом 68−69. Апоптоз — это процесс программируемой клеточной гибели, приводящий к деградации и удалению фагоцитозом поврежденных или состарившихся клеток. Апоптоз может индуцироваться множеством различных внутрии внеклеточных факторов, таких как гипоксия, нарушение клеточного цикла, активация соответствующих рецепторов, разрыв внешней мембранны митохондрий. Происходит активация каскада белков каспаз, что в конечном итоге приводит к деградации клетки, ее распаду на апоптотические тельца и последующему фагоцитозу макрофагами или окружающими клетками. Одним из маркеров апоптоза является нарушение асимметрии плазматической мембраны и экспрессия фосфатидилсерина, позволяющая макрофагам распознать апоптотические клетки. В отличие от апоптоза, некроз — более драматический процесс, обусловленный влиянием различных неблагоприятных факторов, в результате которого происходят необратимые изменения клеточного метаболизма, приводящие к гибели клетки. Апоптоз и некроз имеют большое количество общих черт, в частности, они оба характеризуются экспрессией фосфатидилсерина, также имеющей место при формировании укутанных тромбоцитов. В последние годы появилось несколько работ, в которых обнаружена связь процессов, характерных для клеточной гибели, с формированием укутанных тромбоцитов 69. В частности, было показано, что укутанные тромбоциты характеризуются потерей целостности митохондриальной мембраны 70. Добавление активаторов и ингибиторов открывания митохондриальной поры (mPTP — mitochondrial permeability transition роге), также как и активных форм кислорода, влияет на количество формируемых укутанных.

П1 тромбоцитов. Кроме того, опыты с использованием загрузки тромбоцитов кальцеином показали, что плазматическая мембрана укутанных тромбоцитов может теряеть целостность. Таким образом, связь формирования укутанных тромбоциов с апоптозом и некрозом представляется весьма вероятной. Однако детальные механизмы, обуславливающие формирование укутанных тромбоцитов, до сих пор не выяснены.

Следует отметить, что поддержание асимметрии плазматической мембраны, так же как и потеря этой асимметрии в ходе описанных выше процессов клеточной гибели является универсальным феноменом, характерным для клеток эукариот. Отрицательно заряженные фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин АТФ-зависимым образом переносятся во внутренний слой мембраны при помощи ферментов транслоказы и флиппазы. Потеря асимметрии плазматической мембраны.

72*73 осуществляется при помощи фермента, называемого скрамблазой '. Этот фермент до сих пор не найден, несмотря на то что обнаружен ряд белков, задействованных в данном процессе 73'74. Несмотря на то, что конкретный фермент до сих пор не найден, считается, что он производит перенос фосфолипидов по градиенту их концентраций, нарушая тем самым асимметрию плазматической мембраны 74. Считается, что данный фермент активируется ионами кальция, кроме того хорошо известно, что повышение концентрации внутриклеточного кальция приводит к экспрессии фосфатидилсерина. Стоит отметить, что в последние годы появилась информация о существовании двух различных механизмов экспрессии фосфатидилсерина в тромбоцитах: один из них связан с повышением концентрации внутриклеточного кальция, а другой — с активацией каспаз и.

75 белков семейства Вак/Вах .

В последние годы появилось несколько работ, в которых показано влияние количества укутанных тромбоцитов на течение различных патологий 76−78. В частности, было показано существенное снижение количества укутанных тромбоцитов у пациентов, склонных к внутричерепным кровотечениям 79. Обнаружено существенное повышение количества укутанных тромбоцитов у пациентов, подвергающихся процедуре гемодиализа 80. Показано, что больные тяжелой формой гемофилии А, имеющие различный клинический фенотип, также имеют различные уровни укутанных тромбоцитов 81. Так, у пациентов, имевших более 6 эпизодов кровотечения (в среднем 14±4.9) за 6 месяцев, предшествовавших исследованию, количество укутанных тромбоцитов при активации тромбином с конвульксином было существенно больше, чем у пациентов с более легким течением болезни (в среднем 1.6±1.2 эпизода кровотечения).

Методики изучения субпопуляций активированных тромбоцитов.

Поскольку тромбоциты разных субпопуляций отличаются друг от друга наличием тех или иных поверхностных антигенов, их исследование проводят при помощи специфичных флуоресцентно меченых антител. Те или иные антитела коньюгируются с подходящими флуоресцентными метками, антитела добавляются к суспензии активированных тромбоцитов, и, таким образом, происходит окраска тех клеток, которые содержат на своей поверхности исследуемый антиген. Общепринятым маркером на фосфатидилсерин является белок аннексии V, специфично связывающийся с фосфатидилсерином в присутствии ионов кальция.

Для возбуждения и детекции флуоресценции исследуемых клеток применяют различные подходы: флуориметрию, флуоресцентную микроскопию, проточную цитометрию Флуориметрия — наиболее простой из подходов, позволяет исследовать характерную суммарную флуоресценцию всех клеток суспензии, при этом информация о возможной гетерогенности исследуемого образца оказывается утерянной. Поскольку при активации тромбоциты разделяются на субпопуляции, имеющие принципиально различные свойства, данный подход не подходит для изучения этих процессов.

Еще одним подходом, часто используемым для изучения свойств образцов флуоресцентно окрашенных клеток, является флуоресцентная микроскопия. Этот подход успешно применяется для изучения активации тромбоцитов, в том числе для изучения субпопуляций активированных тромбоцитов. Как правило, используется следующая методика исследования 47,61'66. Фибриноген или коллаген иммобилизуют на поверхности покровного стекла, собирают проточную камеру, в которую помещают исследуемые тромбоциты. Не связавшиеся тромбоциты отмывают, и проточную камеру помещают под объектив флуоресцентного микроскопа. Далее наслаивают антитела и вещества-активаторы, и при помощи цифровой камеры детектируют флуоресценцию исследуемых антител. В последние годы появилось большое количество новых подходов в микроскопии, таких как конфокальная микроскопия и микроскопия дифференциально-интерференционного контраста (Б1С). Эти подходы позволяют получать высококачественные изображения изучаемых клеток как в видимом свете, так и в о флуоресцентных каналах.

Микроскопия является методом, прекрасно подходящим для изучения отдельных клеток суспензии. Этот подход позволяет детально изучать морфологические особенности различных клеток, в том числе тромбоцитов разных субпопуляций. Благодаря развитию средств цифровой фототехники стало возможно изучение в реальном времени процессов, происходящих в тромбоцитах при активации. Важно отметить, что микроскопия не требует особенного приготовления образца, в частности фиксации, что позволяет изучать прижизненные события в исследуемых клетках.

Однако, данный подход имеет ряд ограничений и неудобств. Во-первых, процедура проведения одного эксперимента достаточно продолжительна, что не позволяет анализировать большое количество образцов. Во-вторых, она плохо подходит для оценки численности той или иной клеточной субпопуляции, такая процедура в рамках микроскопии требует ручного анализа нескольких изображений (полей зрения). Таким образом, изучение регуляции численности субпопуляций активированных тромбоцитов при помощи флуоресцентной микроскопии представляется крайне неудобным.

Наиболее часто используемым подходом для анализа сложных клеточных популяций является проточная цитометрия, которая позволяет проводить быстрый анализ отдельных клеток исследуемой суспензии. Принципиальная схема устройства проточного цитометра представлена на рисунке 1.5. Исследуемая суспензия клеток под давлением прокачивается через капилляр, через коаксиальный капилляру канал прокачивается так называемая обжимающая жидкость. Канал с жидкостью сужается, и пропорционально сужается область, в которой протекают клетки, таким образом клетки в потоке выстраиваются одна за другой. Такой принцип пространственного разделения исследуемых клеток называется гидродинамической фокусировкой. Клетки далее освещаются сфокусированным лазерным лучом, который рассеивается на клетках и возбуждает флуоресценцию меченых антител. Световой поток при помощи системы дихроических зеркал и оптических фильтров разделяется, и свет различных длин волн попадает на соответствующие детекторы (фотоэлектронные умножители). Сигнал фототока с детекторов попадает в ЭВМ, где происходит его оцифровка и формирование файла, являющегося результатом измерения.

Лазерный луч Поток клеток.

ЭВМ.

Детекторы.

Рисунок 1.5. Схема устройства проточного цитометра.

Результатом анализа в проточной цитометрии является файл, представляющий собой таблицу, строки которой соответствуют клеткам суспензии (они в проточной цитометрии называются событиями), а столбцы содержат информацию об измеренных параметрах этих клеток. В проточной цитометрии анализируются следующие параметры клеток. 1) Прямое или малоугловое светорассеяние (forward scattering, FSC) — это параметр, характеризующий размер исследуемых клеток. Детектор FSC установлен на линии лазерного луча за потоком клеток, на него попадает свет, рассеянный клетками на углы 2−10°. 2) Боковое светорассеяние (side scattering, SSC) — это параметр, характеризующий так называемую гранулярность, то есть, условно говоря, сложность внутреннего строения клеток. На детектор SSC попадает свет, рассеянный клетками на угол 90°. Стоит отметить, что параметры светорассеяния не несут глубокого биологического смысла, они используются для отделения различных клеток друг от друга, а также от клеточного мусора (так, используя диаграмму светорассеяния, можно.

разделять лимфоциты, моноциты и гранулоциты, не используя антитела). 3) Параметры флуоресценции (Fil, F12, F13) характеризуют интенсивность флуоресценции антител, которыми окрашены исследуемые клетки. Три канала флуоресценции имеют различные полосы пропускания (530±15 нм для F11, 585±21 нм для F12, >670 нм для F13), антитела подбираются таким образом, чтобы спектры эмиссии флуоресцентных меток попадали в полосы пропускания разных каналов флуоресценции.

Для обработки данных проточной цитометрии используются специальное программное обеспечение. Такие программы позволяют строить гистограммы распределения событий по тому или иному параметру, а также точечные диаграммы, на которых каждая точка соответствует определенному событию и имеет соответствующие координаты. В итоге оценивается относительная численность клеточных субпопуляций, а также средняя флуоресценция тех или иных флуоресцентных меток.

Итак, проточная цитометрия является методом, позволяющим производить очень быстрый анализ сложных клеточных популяций, изучать численность различных субпопуляций, а также определять характерные для них поверхностные антигены. Именно проточная цитометрия является методом, с использованием которого был открыт феномен разделения тромбоцитов на субпопуляции в процессе активации, а также получена большая часть информации о свойствах тромбоцитарных субпопуляций и механизмах их формирования.

В последние десятки лет помимо окраски флуоресцентно мечеными антителами появилась масса дополнительных возможностей для анализа биологических процессов, происходящих в живых клеток in vitro. Одним из таких методов является загрузка клеток флуоресцентными красителями, интенсивность флуоресценции которых меняется при изменении.

82 концентрации кальция в цитоплазме исследуемых клеток. Это хелаторы Са2+, аналогичные EDTA, способные проникать в клетки, в цитоплазме которых эфирная группа красителей гидролизуется неспецифичными эстеразами, в результате чего теряются их способность к обратному выходу из клеток.

Основными характеристиками таких красителей являются спектры.

82*83 возбуждения и эмиссии, а также константы связывания ионов кальция '. Константы связывания ионов кальция определяют скорость их связывания с красителем и диапазон концентраций кальция, в пределах которого флуоресценция красителя зависит от концентрации кальция. На рисунке 1.6. представлены графики зависимости флуоресценции красок Calcium Green-1 и Fura Red от концентрации кальция. Видно, что флуоресценция красок меняется в определенном диапазоне концентраций кальцияв областях высоких и низких концентраций кальция имеется область плато. Таким образом, для изучения кальциевой сигнализации в клетках требуется предварительный подбор флуоресцентной краски исходя из концентраций кальция, характерных для изучаемого объекта.

D: Calcium Green-1 F: Fu га-Red.

1.0 0.8 ts и ш с.

Ф e?

SS (J.

1 Ё * и о о s.

2? fe.

0,4 0.2.

0.0 i i ¦ л i «i.

8 7 6 5 4 3 2.

6.0 5.0.

3.0 2.0 1.0 0.0 J.

Iii i i i i.

8 7 6 5 4 3 2.

Рисунок 1.6. Сравнение флуоресцентных красок Calcium Green-1 и Fura Red. Зависимость флуоресценции красок Calcium Green-1 (слева) и Fura Red (справа) от концентрации кальция в цитоплазме. Lipp Р. et al. Cell Calcium. 2000 Oct-28(4):213−23.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Цель работы: Изучить свойства и механизмы формирования фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов в физиологических концентрациях.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальный внутриклеточный Са2±флуорофор, подходящий для достоверной оценки изменений концентраций кальция, характерных для сильной активации тромбоцитов.

2. Исследовать кальциевую сигнализацию в тромбоцитах при использовании различных активаторов.

3. Исследовать зависимость кальциевой сигнализации и экспрессии фосфатидилсерина от концентрации активированных тромбоцитов.

4. Выявить механизмы, регулирующие экспрессию фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы. В работе использовались следующие материалы: человеческий тромбин (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT, USA) — конвульксин (Pentapharm, Basel, Switzerland) — простагландин El (MP Biochemicals, Irvine, CA, USA) — аннексии V, коньюгированный с фикоэритрином и аллофикоцианином,.

94внутриклеточные Caфлуорофоры Fura Red и Calcium Green-1 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) — аннексии V, коньюгированный с флуоресцеинизотиоцианатом (Biovision, Mountain View, CA, USA) — антитело PAC-1, коньюгированное с флуоресцеином (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) — поликлональное антитело к фибриногену, коньюгированное с флуоресцеиом (Lab Vision, Fremont, CA, USA) — пептид AYPGKF (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, USA) — PPACK (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, USA) — пептид SFLLRN (AnaSpec, San Jose, CA, USA);

HEPES, бычий сывороточный альбумин, Сефароза CL-2B, апираза, АДФ, кальциевый ионофор А23 187 (Sigma-Aldrich).

Антагонист гликопротеина Ilb-IIIa монафрам был любезно предоставлен профессором A.B. Мазуровым (Российский кардиологический научно-производственный комплекс, Москва, Россия).

Коллаген-ассоциированный пептид был любезно предоставлен профессором Р. В. Фарндейлом (Университет Кембриджа, Кембридж, Великобритания).

Буфер, А содержал 150 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0.4 мМ NaE^PO/t, 20 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 0.5% бычий сывороточный альбумин, pH 7.4.

Цитратный буфер содержал 3,8% цитрата натрия, pH 5,5.

Выделение тромбоцитов.

Методика выделения тромбоцитов при помощи центрифугирования и гель-фильтрации хорошо описана в литературе 84. Тромбоциты выделяли из крови здоровых доноров мужского пола не старше 40 лет. Кровь собирали в пробирки с 3,8% цитратом натрия (х5,5 Н20, pH 5,5) (в соотношении 9:1, соответственно), немедленно добавляли простагландин El (1 мкМ) и апиразу (0.1 ед./мл) для предотвращения преждевременной активации тромбоцитов. Кровь центрифугировали 8 минут при 100 g для получения богатой тромбоцитами плазмы. Плазму отбирали, дополнительно добавляли 3,8% цитрата (в соотношении цитрат: плазма 1:3) для предотвращения агрегации тромбоцитов в процессе центрифугирования. Богатую тромбоцитами плазму центрифугировали в течение 5 минут при 400 g, супернатант удаляли, тромбоциты аккуратно ресуспензировали в 300 мкл буфера, А (содержащего 150 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0.4 мМ NaH2P04, 20 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 0.5% бычий сывороточный альбумин, pH 7.4). Для отделения от белков плазмы тромбоциты подвергали гель-фильтрации на колонке с гелем Сефароза CL-2B, уравновешенной буфером А. Концентрацию тромбоцитов в полученной суспензии определяли на гематологическом анализаторе.

Загрузка тромбоцитов внутриклеточными Caфлуорофорами.

Для изучения кальциевой сигнализации тромбоциты загружали флуоресцентными красителями, чувствительными к концентрации кальция (Са2±флуорофорами). В данной работе использовали два таких красителяCalcium Green-1 и Fura Red. Загрузку тромбоцитов этими красителями производили инкубацией в присутствии 10 мкМ флуорофоров в течение 30 минут с добавлением простагландина El (1 мкМ) и апиразы (0.1 ед./мл) перед гель-фильтрацией.

Окраска тромбоцитов мечеными антителами.

Для анализа свойств тромбоцитарных субпопуляций использовался метод флуоресцентного мечения. В работе использовались следующие типы окраски.

1) Окраска FITC-, РЕи АРСмеченым аннексином V. Аннексии V — это белок семейства аннексинов, способный специфически связываться с фосфатидилсерином в присутствии ионов кальция. Окраска меченым аннексином V позволяет судить о наличии фосфатидилсерина во внешнем слое плазматической мембраны. Окраска производилась путем добавления в пробу 1% (объемная доля) аннексина V непосредственно перед активацией тромбоцитов. Ранее нами было показано, что наличие аннексина в пробе не влияет на изучаемые процессы, происходящие во время активации тромбоцитов.

2) Окраска FITCмеченым антителом РАС-1. РАС-1 — это антитело, способное специфически связываться с активированным гликопротеином Ilb-111а (интегрином аПЬрЗа Поскольку связывание этого антитела могло влиять на процессы, происходящие при активации тромбоцита, окраска данным антителом производилась после активации тромбоцитов путем инкубации в течение 3 минут (объемная концентрация антитела 10%) непосредственно перед измерением. Ранее было показано, что за 3 минуты связывание молекул РАС-1 достигает насыщения.

3) Окраска FITCмеченым поликлональныым антителом к фибриногену. Аналогично окраске антителом РАС-1, окраска антителом к фибриногену производилась путем инкубации с антителом в течение 3 минут (объемная концентрация антитела 5%) после активации, непосредственно перед измерением.

Активация тромбоцитов.

Активацию тромбоцитов производили следующим образом. Готовили две пробирки одинакового объема. Первая содержала тромбоциты, СаС12 и аннексии V, растворенные в буфере А, вторая содержала активатор, растворенный в буфере Аактивация производилась путем добавления содержимого второй пробирки в первую. Конечная концентрация тромбоцитов была различной в разных экспериментах (точные концентрации указаны в подписях к рисункам), концентрация СаС12 составляла 2,5 мМ, концентрация аннексина Y составляла 1%, как описано в предыдущем разделе. В работе использовались следующие типы активации: а) 10 нМ тромбина и 100 нг/мл конвульксина. б) 100 нМ тромбина. в) 150 мкМ SFLLRN и 100 нг/мл конвульксина. г) 150 мкМ SFLLRN. д) 300 мкМ AYPGKF. е) 10 мкМ ионофора А23 187.

Проточная цитометрия, настройка параметров прибора.

В данной работе для анализа свойств тромбоцитарных субпопуляций был выбран метод проточной цитометрии, основные принципы которого описаны в обзоре литературы.. Исследования производили на приборе FACSCalibur (BD Bioscience).

Для каждой пары флуоресцентных красителей перед началом работы требовалось настроить параметры прибора для оптимальной и корректной детекции флуоресценции. Красители выбирались таким образом, чтобы их спектры флуоресценции попадали в полосы пропускания разных каналов цитометра (каналы Fll, F12 итд) и, по возможности, не перекрывались. Для примера рассмотрим процедуру настройки прибора для красителей FITC (канал флуоресценции F11) и R-PE (F12). Готовили образец с клетками, заведомо экспрессировавшими тот или иной антиген, окрашенными соответствующим антителом. В данном случае тромбоциты активировали ионофором А23 187 и окрашивали FITC-аннексином V. Из данных литературы известно, что такая активация ведет к экспрессии фосфотидилсерина всеми клетками популяции. Далее настраивали чувствительность детектора в канале флуоресценции, соответствующему данному красителю, с целью получить максимально большое, но не зашкаливающее значение флуоресценции в этом канале.

Поскольку за счет перекрывания спектров часть света от этого красителя попадала на детекторы других каналов флуоресценции, требовалось произвести так называемую процедуру компенсации.

Для этого сравнивали сигналы флуоресценции от неактивированных и активированных ионофором А23 187 тромбоцитов, окрашенных FITC-меченным аннексином V, в канале флуоресценции F12. Сигнал флуоресценции активированных тромбоцитов был выше, чем у неактивированных за счет попадания части флуоресценции FITC в пределы полосы пропускания канала F12. Значение флуоресценции в канале F12 корректировали согласно следующей формуле: F12(c)=F12(u)-a*Fll, где F11 -флуоресценция в канале Fil, F12(u) — значение флуоресценции в канале F12 до компенсации, F12(c) — скорректированное значение флуоресценции в канале F12, а — параметр компенсации. Процедура состояла в подборе коэффициента, а таким образом, чтобы средние значения флуоресценции в канале F12 активированных и неактивированных тромбоцитов совпали друг с другом.

Аналогичную процедуру настройки чувствительности и компенсации производили для каждой пары флуоресцентных меток, использовавшихся в работе.

Изучение кинетики формирования субпопуляций.

Тромбоциты загружали флуоресцентными красителями Fura Red и Calcium Green-1, окрашивали меченным аннексином V и активировали, как описано выше. Через заданные промежутки времени из образца отбирали пробы по 20 мкл, разбавляли в 10 раз буфером, А с 2,5 мМ СаС12, и полученную пробу немедленно анализировали на проточном цитометре.

Изучение роли секреции в формировании субпопуляций i РОССИЙСКАЯ i.

ГОСУДАРСТВЕННАЯ j БИБЛИ О ТЕ К AJ.

Для изучения роли секреции АДФ в формировании субпопуляций в пробу, содержащую активатор, дополнительно добавляли АДФ или апиразу в различных концентрациях.

Для изучения роли секреции в формировании субпопуляций, тромбоциты,.

8 1 8 1 загруженные Fura Red, в концентрации 2×10 мл" или 0,2×10 мл", окрашивали FITC-аннексином V, активировали 100 нМ тромбином в течение.

20 минут и анализировали на проточном цитометре. Аналогичную пробу с.

8 1 тромбоцитами в концентрации 2×10 мл" после 15 минут активации центрифугировали в течение 5 минут при 400 g для осаждения тромбоцитов. К супернатанту, содержащему тромбин и вещества, секретированные тромбоцитами, добавляли неактивированные тромбоциты до концентрации 0,2×108 мл" 1, через 20 минут пробу анализировали на проточном цитометре. О роли секреции судили по изменению соотношения между тромбоцитами разных субпопуляций.

Изучение роли межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций.

Для изучения роли межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций тромбоциты, загруженные Fura Red, в концентрациях 0,2×108 мл" 1 или 2×108 мл" 1, окрашивали меченным аннексином V, активировали 100 нМ тромбином в течение 15 минут, как описано выше. Для ингибирования межклеточных взаимодействий через гликопротеин Ilb-IIIa к тромбоцитам перед активацией добавляли его селективный ингибитор монафрам (300 мкг/мл). Для увеличения вероятности взаимодействия тромбоцитов друг с другом, пробу, содержавшую тромбоциты в концентрации 0,2×108 мл" 1, в процессе активации подвергали перемешиванию на шейкере со скоростью 300 об/мин.

Обработка полученных результатов.

Для обработки данных, полученных в результате анализа на проточном цитометре, использовали программу WinMDI 2.9. (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, США). На первом этапе обработки строилась так называемая диаграмма светорассеяния, представляющая сооои точечную диаграмму прямого и бокового светорассеяния. Типичная диаграмма светорассеяния представлена на рисунке 2.1 А. Как было ранее показано при помощи окраски специфическими антителами к антигенам тромбоцитов, тромбоциты на данной диаграмме хорошо отделяются от остальных событий и попадают в регион Ш, изображенный на рисунке 2.1.А. Остальные точки на приведенной диаграмме имеют место из-за наличия в пробе клеточного мусора и микровезикул, а также из-за электронного шума прибора. Параметры светорассеяния тромбоцитов несколько видоизменяются в процессе активации, а также несколько варьируются от донора к донору, поэтому регион Я1 выбирали отдельно для каждой проанализированной пробы. Дальнейший анализ производили только для событий, попавших в регион Ш. ю.

FSC-Height.

101 1С.

FL2-Height.

Рис. 2.1. Принцип обработки данных проточной цитометрии. А — типичечная точечная диаграмма распределения тромбоцитов по прямому (ось абсцисс) и боковому (ось ординат) светорассеянию. Выделенный регион соответствует тромбоцитам, остальные точки отражают клеточный мусор и электронный шум прибора. Б — типичная точечная диаграмма флуоресценции фикоэритрин-меченного аннексина V (ось абсцисс) и краски Calcium Green-1 (ось ординат). Выделенные регионы соответствуют укутанным и неукутанным тромбоцитам.

На следующем этапе анализа строили точечную диаграмму флуоресценции антител и красителей, которыми окрашивали тромбоциты. На рисунке 2.1.Б в качестве примера представлена типичная точечная диаграмма флуоресценции РЕ-аннексина V (ось абсцисс) и Са2±флуорофора Fura Red (ось ординат). На данной диаграмме хорошо видны две субпопуляции тромбоцитов — укутанные тромбоциты (фиолетовые точки) и неукутанные тромбоциты (синие точки). Мерой количества тромбоцитов той или иной субпопуляции считался процент событий, попавших в соответствующий регион, от общего числа событий. Также вычисляли среднее значение флуоресценции того или иного красителя для тромбоцитов различных субпопуляций.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Подбор оптимального Са2±флуорофора.

Для выбора оптимального Са2±флуорофорапровели сравнительный анализ Calcium Green-1 и Fura Red. Тромбоциты загружали красками Calcium Green-1 или Fura Red перед гель-фильтрацией. Тромбоциты в концентрации 0,2×10 мл" 1 окрашивали FITC-меченым (в случае Fura Red) или РЕ-меченым (в случае Calcium Green-1) аннексином V, активировали смесью тромбина и конвульксина либо ионофором А23 187 и анализировали на проточном цитометре. Также анализировались неактивированные тромбоциты, окрашенные аннексином V. Неактивированные тромбоциты служили отрицательным контролем, так как имели минимальный уровень внутриклеточного кальциятромбоциты, активированные ионофором А23 187 служили положительным контролем. Производили сравнение флуоресценции Са2±флуорофоров в укутанных и неукутанных тромбоцитах с флуоресценцией Са2±флуорофоров в неактивированных тромбоцитах и тромбоцитах, активированных ионофором А23 187. На рисунках ЗЛА и 3.1 Б представлены типичные гистограммы распределений тромбоцитов разных субпопуляций по флуоресценции Са2±флуорофоров Calcium Green-1 (А) и Fura Red (Б). В случае использования Calcium Green-1 оказалось, что флуоресценция как в укутанных, так и в неукутанных тромбоцитах совпадает с флуоресценцией в тромбоцитах, активированных ионофором А23 187 (рис ЗЛА, зеленые, синие и красные кривые). Это означает, что концентрации кальция, характерные как для укутанных, так и для неукутанных тромбоцитов, лежат вне пределов динамического диапазона Caфлуорофора Calcium Green-1. На рисунке 3.1Б приведены аналогичные кривые для Са2±флуорофора Fura Red (стоит отметить, что этот краситель является «инвертированной»: чем выше концентрация кальция, тем ниже его флуоресценция). Как и для Calcium Green-1, флуоресценция Fura Red в укутанных тромбоцитах совпадает с флуоресценцией Fura Red в тромбоцитах, активированных ионофором А23 187. Парадоксальным образом, флуоресценция в укутанных тромбоцитах даже несколько ниже, что, вероятно, объясняется их маленьким размером, обусловленным отделением микровезикул. Флуоресценция Fura Red в неукутанных тромбоцитах (зеленая кривая) при этом лежит в промежутке между флуоресценцией в неукутанных тромбоцитах и в тромбоцитах, активированных ионофором А23 187. Это означает, что концентрации кальция, характерные для неукутанных тромбоцитов, лежат в пределах динамического диапазона Са2'-флуорофора Fura Red. Таким образом, именно этот краситель оказался более подходящим для изучения кальциевой сигнализации в тромбоцитах при их сильной активации, и все дальнейшие эксперименты производились с использованием именно его.

Рис. 3.1. Выбор оптимального Ca2*-флуорофора. Тромбоциты (0,2×10® мл" 1) загружали флуоресцентными красками Calcium Green-1 (А) и Fura Red (Б), окрашивали FITCили РЕ-меченым аннексином V, оставали интактными, либо активировали 100 нг/мл конвульксина и 10 нМ тромбина, либо 10 мкМ ионофора А23 187 в течение 10 минут и анализировали на проточном цитометре. Представлены гистограммы распределения флуоресценции красок в следующих субпопуляциях тромбоцитов: неактивированные тромбоциты (черные кривые), неукутанные тромбоциты (зеленые кривые), укутанные тромбоциты (синие кривые) и тромбоциты, активированные ионофором А23 187 (красные кривые). Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Кинетика изменения концентраций внутриклеточного кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов.

Для исследования кинетики кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов производился следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Са2±флуорофором Fura Red, взятые в концентрации 0,2×10* мл" ', окрашивали FITC-меченым аннексином V и активировали различными веществами. Через заданные промежутки времени часть пробы отбиралась, разбавлялась в 10 раз и анализировалась на проточном цитометре. На рисунке 3.2. представлены типичные точечные диаграммы флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и Fura Red (ось ординат) в тромбоцитах, активированных тромбином и конвульксином (активатором гликопротеина VI). В неактивированных тромбоцитах (рис. 3.2.А) наблюдается низкий уровень кальция, количество аннексин-положительных тромбоцитов не превышает 1,5% (это число служит в качестве контроля качества выделения тромбоцитов). Активация тромбоцитов приводит к быстрому (0,25 мин, рис. 3.2.Б) росту уровня кальция во всех тромбоцитах. Далее начинается разделение тромбоцитов на субпопуляции (рис. 3.3.В), которое продолжается до 8 минуты эксперимента (рис. 3.3.Г). s г л ц.

Экспрессия фосфатидилсерина.

Рис. 3.2. Кинетика формирования субпопуляций активированных тромбоцитов.

Тромбоциты (0,2×108 мл" 1) загружали краской Fura Red, окрашивали FITC-меченым аннексином V и активировали 100 нг/мл конвульксина и 10 нМ тромбина. Через интервалы времени 0 мин (А, до активации), 0,25 мин (Б), 2 мин (В) и 8 мин (Г) часть пробы отбиралась и анализировалась на проточном цитометре. Представлены точечные диаграммы флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и краски Fura Red (ось ординат). Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Кинетика изменения концентраций внутриклеточного кальция в субпопуляциях тромбоцитах зависит от используемого вещества-активатора. В данной работе тромбоциты активировались тромбином (рис. 3.3.А), активатором тромбинового PAR-1 рецептора SFLLRN (рис. 3.3.Б), смесью.

46 тромбина и активатора коллагенового рецептора гликопротеина VI конвульксина (рис. 3.3.В), а также смесью SFLLRN и конвульксина (рис. 3.3.Г). На данных графиках представлены временные зависимости флуоресценции Fura Red в тромбоцитах до разделения на субпопуляции (черные кривые), укутанных тромбоцитах (синие кривые) и неукутанных тромбоцитах (синие кривые). При любом типе активации наблюдается быстрый (рис. З.З.А-Г, черные кривые) рост уровня кальция во всех тромбоцитах. Далее начинается разделение тромбоцитов на субпопуляции. При любом типе активации в укутанных тромбоцитах устанавливается высокий и стабильный уровень кальция (рис. З.З.А-Г, синие кривые). Кинетика кальция в неукутанных тромбоцитах зависит от используемого вещества-активатора. При активации тромбоцитов тромбином или SFLLRN уровень кальция в неукутанных тромбоцитах возвращается к исходному значению соответственно за 10 или 4 минуты (рис. З.З.А, Б, красные кривые) — при активации смесью тромбина с конвульксином или SFLLRN с конвульксином в неукутанных тромбоцитах происходит стабилизация уровня кальция на промежуточном уровне (рис. 3.3. В, Г). Кинетика формирования укутанных тромбоцитов также зависит от типа активации. На рисунке 3.3.Д представлены типичные графики зависимости количества укутанных тромбоцитов от времени с момента активации. При любом типе активации количество укутанных тромбоцитов наиболее быстро растет в течение первых 4 минут после активации, к 10 минуте эксперимента формирование укутанных тромбоцитов завершается. Общее количество укутанных тромбоцитов зависит от типа активации: при активации тромбином или SFLLRN формируется 5−10% укутанных тромбоцитов, в то время как при активации смесью тромбина с конвульксином или SFLLRN с конвульксином формируется до 70% укутанных тромбоцитов. На рисунке 3.3.Е представлены гистограммы распределения флуоресценции Fura Red в неактивированных тромбоцитах (черный столбец), укутанных тромбоцитах (синие столбцы) и неукутанных тромбоцитах (красные столбцы).

Представлены средние значения ± стандартные отклонения для экспериментов, выполненных на образцах крови различных доноров. Таким образом, в укутанных тромбоцитах устанавливается высокий и стабильный уровень кальция, уровень кальция в неукутанных тромбоцитах зависит от типа активации.

4 30 ф с 25 о >" к 20 х з 15.

110 | 5 ео.

Ч 25 время, мин В з" 60.

§ 50 0.

1 40 0.

0).

J 20.

1, 0−1.

5. о время, мин.

— SFLLRNтромбин.

SFLLRN+конвульксин — тромбин+конвульксин.

4 6 8 время, мин.

Рис. 3.3. Кинетика изменения внутриклеточных концентраций кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов. Тромбоциты (0,2×108 мл" 1) загружали краской Fura Red, окрашивали FITC-меченым аннексином V и активировали 150 мкМ SFLLRN (А), 100 нМ тромбина (Б), 10 нг/мл конвульксина и 150 мкМ SFLLRN (В), 100 нг/мл конвульксина и 10 нМ тромбина (Г). Представлены зависимости от времени средней флуоресценции Fura Red для тромбоцитов до разделения на субпопуляции (черные кривые), укутанных тромбоцитов (синие кривые) и неукутанных тромбоцитов (красные кривые). Д — кинетика формирования укутанных тромбоцитов при разной активации. Представлены данные типичного эксперимента (п=3). Е — средняя флуоресценция Fura Red в субпопуляциях тромбоцитов после 10 мин активации. Представлены средние величины между экспериментами, выполненными на образцах крови различных доноров. п=3.

Существование третьей субпопуляции активированных тромбоцитов.

Во всех вышеописанных опытах тромбоциты активировались в.

8 1 концентрации 0,2×10 мл", что на порядок ниже их физиологической концентрации. Оказалось, что при повышении концентрации тромбоцитов до 2×108 мл" 1, помимо известных субпопуляций укутанных и неукутанных тромбоцитов формируется третья, ранее не описанная субпопуляция тромбоцитов.

Экспрессия фосфатидилсерина.

Рис. 3.4. Существование третей субпопуляции активированных тромбоцитов.

Тромбоциты в концентрациях 0,2×108 мл" 1 (А) и 2×108 мл'1 (Б) загружали краской Fura Red, окрашивались FITC-меченым аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 10 мин и анализировали на проточном цитометре. Представлены типичные точечные диаграммы флуоресценции FITC-меченого аннексина V (ось абсцисс) и краски Fura Red (ось ординат). При активации тромбоцитов в концентрации 2×108 мл" 1 мкл" 1 наблюдается три субпопуляции тромбоцитов: неукутанные тромбоциты (красные точки), укутанные тромбоциты (зеленые точки) и тромбоциты третьей субпопуляции (синие точки).

На рисунке 3.4. изображены точечные диаграммы флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и Fura Red (ось ординат) в тромбоцитах, активированных в концентрациях 0,2×108 мл" ' (А) и 2×108 мл" 1 (Б) 100 нМ тромбина в течение 10 минут. При активации тромбоцитов в концентрации 0,2×108 мл" 1 (рис. 3.4.А) наблюдаются две вышеописанные субпопуляции тромбоцитов: укутанные тромбоциты (зеленые точки), экспрессирующие фосфатидилсерин и имеющие высокий уровень внутриклеточного кальция, и неукутанные тромбоциты (красные точки), не экспрессирующие фосфатидилсерин и имеющие сравнительно низкий уровень внутриклеточного кальция. Количество событий, не относящихся к этим двум группам, не превышает 1%. При активации же тромбоцитов в концентрации 2×10s мл" 1 (рис. 3.4.Б) помимо двух вышеописанных субпопуляций формируется третья субпопуляция активированных тромбоцитов (синие точки), которая, как и укутанные тромбоциты, характеризуется экспрессией фосфатидилсерина, однако отличается низким уровнем внутриклеточного кальция.

Кинетика формирования субпопуляций активированных тромбоцитов.

Для исследования кинетики формирования субпопуляций тромбоциты, загруженные Са" -флуорофором Fura Red, взятые в концентрации 2×10' мл", окрашивали FITC-меченым аннексином V и активировали 100 нМ тромбина. Через заданные промежутки времени часть пробы отбиралась, разбавлялась в 10 раз и анализировалась на проточном цитометре. На рисунке 3.5. изображены точечные диаграммы флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и Fura Red (ось ординат) до активации (А), а также через 0,25 мин (Б), 1 мин (В), 2 мин (Г), 4 мин (Д), 8 мин (Е), 16 мин (Ж) и 40 мин (3) после активации. Процесс формирования субпопуляций начинается примерно через минуту после активации и далее продолжается вплоть до 40 минуты эксперимента. На рисунке 3.5.И, К представлены графики зависимости численности субпопуляций тромбоцитов от времени. Тромбоциты активировали 100 нМ тромбина в концентрациях 0,2×10ь мл" 1 (рис. 3.5.И) 2×108 мл" 1 (рис. 3.5.К), оценивалась численность укутанных тромбоцитов (зеленые кривые), тромбоцитов третьей субпопуляции (синие кривые) и общего числа аннексин-положительных тромбоцитов (коричневые кривые). При активации о i тромбоцитов в концентрации 0,2×10 мл" формирование аннексин-положительных тромбоцитов происходит только за счет формирования укутанных тромбоцитов, тромбоциты третьей субпопуляции практически не о 1 образуются. При активации тромбоцитов в концентрации 2×101 мл" происходит образование укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляцииформирование укутанных тромбоцитов прекращается примерно через 5 минут после активации, в то время как тромбоциты третьей субпопуляции продолжают формироваться вплоть до 40 минуты эксперимента. При этом общее количество аннексин-положительных тромбоцитов в описанных случаях зависит от времени очень похожим образом.

О 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 время, мин.

Рис. 3.5. Кинетика формирования субпопуляций активированных тромбоцитов.

Тромбоциты (2×108 мл" 1) загружали краской Fura Red, окрашивали FlTC-меченым аннексином V и активировали 100 нМ тромбина. Через интервалы времени 0 мин (А, до активации), 0,25 мин (Б), 1 мин (В), 2 мин (Г), 4 мин (Д), 8 мин (Е), 15 мин (Ж) и 40 мин (3) часть пробы отбиралась и анализировалась на проточном цитометре. Представлены точечные диаграммы флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и краски Fura Red (ось ординат). И, 3 — временные зависимости количества укутанных тромбоцитов (зеленые кривые), тромбоцитов третьей субпопуляции (синие кривые), а также общего числа аннексин-положительных тромбоцитов (коричневые кривые) для тромбоцитов, активированных в концентрациях 20 000 мкл" 1 (И) и 200 000 мкл" 1 (3). Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Исследование свойств тромбоцитарных субпопуляций Для исследования свойств тромбоцитарных субпопуляций выполнялся следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Са2±флуорофором Fura Red, взятые в концентрации 2×1 О* мл" 1, окрашивали АРС-меченым аннексином V, а также либо FITC-меченым антителом к фибриногену, либо FITC-меченым антителом РАС-1 (антитело к активированной изоформе интегрина аНЬрЗа), активировали 100 нМ тромбина в течение 10 минут и анализировали на проточном цитометре. На рисунке 3.6.А представлена точечная диаграмма флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и Fura Red (ось ординат). Данная диаграмма используется для отделения неукутанных тромбоцитов (красный регион), укутанных тромбоцитов (зеленый регион) и тромбоцитов третьей субпопуляции (синий регион). Дальнейший анализ проводится отдельно для тромбоцитов разных субпопуляций. На рисунках 3.6. Б-Ж представлены точечные диаграммы распределения тромбоцитов по прямому светорассеянию (рис. 3.6. Б, В, ось абсцисс), флуоресценции антитела к фибриногену (рис. 3.6. Г, Д, ось абсцисс) и антитела РАС-1 (рис. 3.6. Е, Ж, ось абсцисс). По оси ординат на рисунках 3.6.Б-Ж отложена флуоресценция Fura Red. На левых панелях (рис. 3.6. Б, Г, Е) представлены диаграммы для неукутанных тромбоцитов, на правых (рис. 3.6. В, Д, Ж) — для укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции. Из рисунка 3.6. Б, В видно, что укутанные тромбоциты и тромбоциты третьей субпопуляции существенным образом отличаются по параметру прямого светорассеяния, в то время как неукутанные тромбоциты сильно распределены по этому параметру. Это может говорить о различиях в структуре и размерах между тромбоцитами разных субпопуляций. Из рисунка 3.6. Г, Д видно, что укутанные тромбоциты и тромбоциты третьей субпопуляции, в отличие от неукутанных тромбоцитов, одинаково хорошо связывают антитело к фибриногену. Из рисунка 3.5. Е, Ж видно, что укутанные тромбоциты и тромбоциты третьей субпопуляции существенно различаются по значениям флуоресценции антитела РАС-1. Тромбоциты третьей субпопуляции связывают антитело РАС-1 так же хорошо, как и неукутанные тромбоциты, в отличие от укутанных тромбоцитов. Эти данные могут свидетельствовать о том, что укутанные тромбоциты, имеющие дезактивированный интегрин аПЬрЗа, обладают сниженной способностью к агрегации по сравнению с неукутанными тромбоцитами и тромбоцитами третьей субпопуляции. Таким образом, тромбоциты третьей субпопуляции отличаются по параметру прямого светорассеяния от укутанных тромбоцитов. Тромбоциты третьей субпопуляции покрыты фибриногеном или фибрином), что роднит их с.

006Eio6-lnpie, 4t-contiol Oate PI прямое светорассеяние.

0Ю8 93- Fg Pale. Pi e"epl (R7inP1) антитело к фибриногену.

607 S2 ¦ РАС I Oate pi e"epl (R7inPl).

1 11IBW" I I 1131 I 1111 ¦ I I llll.

J ?

FL1-A антитело РАС-1 укутанными тромбоцитами, однако имеют активный интегрин а11ЬрЗа, что роднит их с неукутанными тромбоцитами.

Рис. 3.6. Свойства субпопуляций активированных мкл" тромбоцитов.

Тромбоциты (2×108 мл" 1) загружали краской Fura Red, окрашивали АРС-меченым аннексином V и активировали 100 нМ тромбина. За 2 мин до анализа на проточном цитометре тромбоциты окрашивались FITC-меченым антителом к фибриногену или FITC-меченым антителом РАС-1. А — точечная диаграмма флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и Fura Red (ось ординат). Представлены точечные диаграммы флуоресценции Fura Red (Б-Ж, ось ординат) и прямого светорассеяния (Б, В, ось абсцисс), флуоресценции антитела к фибриногену (Г, Д, ось абсцисс) и антитела РАС-1 (Е, Ж, ось абсцисс) для субпопуляций неукутанных тромбоцитов (Б, Г, Е), а также укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции (В, Д, Ж). Представлены данные типичного эксперимента. п=3.

Исследование роли секреции АДФ в формировании субпопуляций Известно, что секреция АДФ может регулировать формирование аннексин-положительных тромбоцитов в процессе активации, поэтому была исследована роль секреции АДФ в формировании трех субпопуляций активированных тромбоцитов. Для этого был проведен следующий опыт. Тромбоциты, загруженные Са2±флуорофором Fura Red, взятые в концентрации 2×10Ь мл" 1, окрашивали FITC-меченым аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 10 минут в присутствии различных концентраций апиразы (фермента, расщепляющего АДФ), и анализировали на проточном цитометре. На рисунке 3.7.А представлен график зависимости количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации апиразы. Представлены средние значения ± стандартные отклонения для экспериментов, выполненных на образцах крови различных доноров (п=3). Видно, что добавление апиразы приводит к дозо-зависимому снижению как количества укутанных тромбоцитов, так и тромбоцитов третьей субпопуляции. Таким образом, секреция АДФ регулирует формирование обоих аннексин-положительных субпопуляций, но не переключение между ними. На рисунке 3.7.Б представлен график зависимости количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации, в которой активировались тромбоциты. Видно, что при увеличении концентрации тромбоцитов количество укутанных тромбоцитов практически не меняется, в то время как количество тромбоцитов третьей субпопуляции монотонно возрастает. Можно предположить, что в формировании тромбоцитов третьей субпопуляции задействованы процессы, имеющие место после изначальной активации, такие как секреция или межклеточные взаимодействия. На рисунке 3.7.В представлен график зависимости количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации, в которой активировались тромбоциты (этот график является комбинацией двух вышеописанных). Видно, что количество укутанных тромбоцитов не зависит от концентрации тромбоцитов, но это количество меняется при добавлении апиразы или АДФ. Количество тромбоцитов третьей субпопуляции монотонно растет при повышении концентрации тромбоцитов и также меняется при добавлении апиразы или АДФ, Таким образом, секреция АДФ регулирует формирование обеих субпопуляций аннексин-положительных тромбоцитов, однако не способна объяснить феномен образования третьей субпопуляции тромбоцитов при их активации в высокой концентрации. ш о ь S ZS о ю г, а Iо со ь о 3.

7 5 С О.

12 10 8.

6 т.

4 2 А укутанные тромбоциты ¦ тромбоциты третьей субпопуляции.

3=5:

0.0 0.4 0,8 1.2 1.6 2,0 концентрация апиразы, ед.акт./мл.

16 о*. т* 0.

1 12 1 2 а.

Г 8 О со укутанные тромбоциты г тромбоциты третьей субпопуляции.

200 концентрация тромбоцитов, Х10 мкл' о о н.

S 3 о ю S, а к о ш >и.

0J т S.

§ укутанныетретья субпопуляция ¦укутанные (+апирзза) -третья субпопуляция (+апирааа) -укутанные (+АДФ) -третья субпопуляция (+АДФ) В.

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 концентрация тромбоцитов, Х103 мкл'1.

Рис. 3.7. Роль секреции АДФ в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов. Тромбоциты (2×108 мл'1) загружали краской Fura Red, окрашивали FITC-меченым аннексином V и активировали 100 нМ тромбина в течение 10 мин. А — зависимость количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации апиразы. Бзависимость количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации тромбоцитов в пробе. Представлены средние величины между экспериментами, выполненными на образцах крови различных доноров. п=3. В — зависимость количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации тромбоцитов в пробе при добавлении апиразы или АДФ. Представлены данные типичного эксперимента. п=3.

Исследование роли секреции в формировании субпопуляций Поскольку секреция АДФ не является механизмом, объясняющим феномен образования третьей субпопуляции тромбоцитов, была выдвинута гипотеза о роли секреции какого-либо другого вещества в формировании тромбоцитов третьей субпопуляции. количество тромбоцитов, %.

0 5. 10. 15. 20. 25, 30. контроль.

2x108ml1.

0,2×108тГ1.

0,2×108тГ1 + супернатант укутанные тромбоциты тромбоциты третьей субпопуляции.

Рис. 3.8. Роль секреции в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов.

Тромбоциты загружали краской Fura Red, окрашивали FITC-меченым аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 20 мин в концентрациях 0,2×108 мл" 1 и 2×108 мл" 1, и анализировали на проточном цитометре. Проба, содержащая тромбоциты, активированные в концентрации 2×108 мл' 1, центрифугировалась при 400 g в течение 5 мин. Отбирался супернатант, к нему добавляли тромбоциты в концентрации 0,2×108 мл" 1, инкубировали в течение 20 мин и анализировали на проточном цитометре. Представлены средние значения количеств укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции между экспериментами, выполненными на крови различных доноров. п=3.

Для проверки данной гипотезы был выполнен следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Сафлуорофором Fura Red, взятые в концентрациях 2×108 мл" 'или 0,2×108 мл" 1, окрашивали FÍ-TC-меченым аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 20 минут и анализировали на проточном цитометре. Также готовилась аналогичная о | проба, содержащая тромбоциты, активированные в концентрации 2×101 мл". Тромбоциты осаждались при помощи центрифугирования на 400 g в течение 5 минут, отбирался супернатант, содержащий тромбин и вещества, секретированные тромбоцитами в процессе активации. К супернатанту далее добавляли тромбоциты в концентрации 0,2×108 мл" 1, через 20 минут проба анализировалась на проточном цитометре.

На рисунке 3.8. представлена гистограмма распределения количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции при различной активации. Видно, что при активации тромбоцитов в концентрации 0,2×10″ мл" 1 супернатантом, а не тромбином, происходит пропорциональное увеличение как количества укутанных тромбоцитов, так и количества тромбоцитов третьей субпопуляции. Вещества, секретируемые тромбоцитами в процессе активации, увеличивают количество тромбоцитов обеих аннексин-положительных субпопуляций. Таким образом, секреция тромбоцитов в процессе активации не способна объяснить феномен существования третьей субпопуляции тромбоцитов при их активации в высокой концентрации.

Исследование роли межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций.

Поскольку секреция не способна объяснить формирование третьей субпопуляции тромбоцитов при их активации в высокой концентрации, была выдвинута гипотеза о роли межклеточных взаимодействий в формировании третьей субпопуляции активированных тромбоцитов. Для проверки этой гипотезы был выполнен следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Са2-флуорофором Fura Red, взятые в концентрациях 2×108 мл" 1 или 0,2×108 мл" 1, окрашивали FITC-меченым аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 10 минут и анализировали на проточном цитометре.

X 1.

Аналогичная проба, содержащая тромбоциты в концентрации 0,2×10' мл", подвергалась перемешиванию на шейкере на 300 об/мин для увеличения количества межклеточных контактов. Также готовилась проба, подвергавшаяся перемешиванию в присутствии селективныого блокатора интегрина аНЬрЗа монафрама. количество тромбоцитов, %.

5. 10 Г 15, 20,.

Неактивированны.

2x108тГ1.

0.2×10 Йт1.

0.2×108тГ1, тряск 0.2×108тГ1, монафра.

0.2×10?тГ1, тряска + монафра укутанные тромбоциты Iтромбоциты третьей субпопуляции.

Рис. 3.9. Роль межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов. Тромбоциты загружались краской Fura Red, окрашивались FITC-меченым аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 10 мин в концентрациях 0,2×108 мл" 1 и 2×108 мл'1 и анализировались на проточном цитометре. В пробу, содержащую тромбоциты в концентрации 0,2×108 мл" ' добавлялся монафрам и/или проба подвергалась встряхиванию на шейкере при 300 об/мин в процессе активации. Представлены средние значения количеств укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции между экспериментами, выполненными на крови различных доноров. п=3.

На рисунке 3.9. представлена гистограмма распределения количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции при различной активации. Видно, что перемешивание тромбоцитов в процессе активации приводит к перераспределению тромбоцитов между субпопуляциями: число укутанных тромбоцитов снижается, а количество тромбоцитов третьей субпопуляции возрастает. Поскольку перемешивание способствует увеличению количества столкновений между клетками суспензии, данный результат свидетельствует о роли межклеточных контактов в формировании третьей субпопуляции активированных тромбоцитов. Из рисунка 3.9. также видно, что добавление монафрама полностью блокирует эффект перераспределения тромбоцитов между субпопуляциями. Данный результат свидетельствует о роли сигнализации через интегрин а11Ь (ЗЗа в формировании тромбоцитов третьей субпопуляции. Таким образом, межклеточные взаимодействия через интегрин аПЬрЗа в процессе активации приводят к формированию тромбоцитов третьей субпопуляции активированных тромбоцитов при их активации в высокой концентрации.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Целью данной работы было изучение свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов. Была разработана методика детекции кальция в цитоплазме сильно активированных тромбоцитов, изучена кинетика кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов. Также в работе было показано существование третьей субпопуляции активированных тромбоцитов, изучены ее свойства и механизмы формирования.

Для изучения кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов при их сильной активации было произведено сравнение красок Calcium Green-1 и Fura Red. Данные краски были выбраны для сравнения, поскольку имелись литературные данные о преимуществах использования краски Calcium Green-1 для изучения кальциевой сигнализации в тромбоцитах, а также данные Walsh, который в своей работе также изучал кальциевую сигнализацию в субпопуляциях тромбоцитов и использовал краску Fura Red 45'83. Выяснилось, что краска Calcium Green-1, хорошо зарекомендовавшая себя в опытах по слабой активации тромбоцитов АДФ или тромбоксаном А2, не подходит для исследования кальциевой сигнализации в сильно активированных тромбоцитах. Данная краска не способна различить концентрации кальция, появляющиеся в тромбоцитах, активированных через PAR-рецепторы или гликопротеин VI. Стоит отметить, что краска Fura Red также не способна полностью различить концентрации кальция, наблюдаемые в сильно активированных тромбоцитах: концентрации кальция, характерные для укутанных тромбоцитов, приводят к насыщению ее флуоресценции (см. рис. З.1.).

В данной работе изучалась кинетика кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов. Использовалось несколько типов активации. Активация тромбином — наиболее физиологичный способ изучения субпопуляций активированных тромбоцитов. Концентрация тромбина во всех опытах составляла 100 нМ, столь высокая концентрация тромбина может локально иметь место в процессе тромбообразования. Активация ЗБЫЛШ приводит к формированию субпопуляции тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, но не связывающих альфа-гранулярные белки, поэтому было интересно изучить кальциевую сигнализацию при таком типе активации тромбоцитов. Активация тромбином с конвульксином и тромбином с БРЫЛШ моделирует активацию тромбоцитов в начальной фазе тромбообразования, когда тромбоциты активируются в результате взаимодействия с обнаженными волокнами коллагена. Данный тип активации также приводит к формированию наибольшего числа укутанных тромбоцитов, за исключением нефизиологичной активации кальциевыми ионофорами.

Любой из использовавшихся типов активации приводил к формированию укутанных тромбоцитов, имевших высокий и стабильный уровень внутриклеточного кальция. Данный результат находится в хорошем согласии с литературными данными о кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов, а также с представлением о том, что экспрессия фосфатидилсерина вызывается ростом концентрации кальция 45. Известно, что асимметрия клеточной мембраны в клетках человека достигается за счет АТФ-зависимой работы ферментов транслоказ и флиппаз, переносящих фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин с внешнего слоя мембраны во внутренний. Предполагается, что нарушение такой ассиметрии достигается за счет работы фермента скрамблазы, катализирующего перенос фосфолипидов по градиенту их концентрации. Несмотря на то, что такой фермент до сих пор не был обнаружен, в литературе господствует представление о том, что процесс нарушения асимметрии клеточной мембраны активируется ионами кальция 72'74.

Надо заметить, что длительное повышение концентрации кальция в укутанных тромбоцитах не обязательно означает, что экспрессия фосфатидилсерина в таких клетках является следствием повышения концентрации кальция. В последние годы в литературе появились данные о том, что укутанные тромбоциты теряют целостность плазматической мембраны в ходе активации и, таким образом, возможно, являются некротическими клетками. В пользу этой гипотезы свидетельствуют также данные об утрате разности потенциалов в митохондриях укутанных тромбоцитов 10,11. Таким образом, существует несколько гипотез относительно последовательности событий, имеющих место при формировании укутанных тромбоцитов. Согласно первой из них, активация тромбоцитов приводит к росту уровня внутриклеточного кальция, сбое в работе митохондрий и экспрессии фосфатидилсерина. Согласно второй из них, активация тромбоцита ведет к исчерпанию запасов АТФ и последующей пермиабилизации плазматической мембраны и втоку кальция из внеклеточного пространства.

Традиционными методами изучения субпопуляций активированных тромбоцитов являются проточная цитометрия и флуоресцентная микроскопия. В подавляющем большинстве работ, в которых субпопуляции активированных тромбоцитов изучались с использованием проточной цитометрии, концентрация тромбоцитов при их активации не превышала 20 000 мкл" 1, что примерно на порядок ниже их физиологической концентрации 56,61. Использование столь низкой концентрации тромбоцитов позволяет существенно упростить экспериментальную модель, сведя к минимуму эффекты, обусловленные секрецией тромбоцитов и межклеточными взаимодействиями. К тому же, это позволяет избежать множества возможных артефактов, связанных с формированием тромбоцитарных агрегатов. В исследованиях с использованием флуоресцентной микроскопии тромбоциты как правило прикрепляются к подложке с нанесенным фибриногеном и активируются в проточной камере. Фактически, тромбоциты формируют монослой, что также сводит к минимуму эффекты секреции и межклеточных взаимодействий.

В данной работе показано, что активация тромбоцитов в концентрации 200 000 мкл" 1 приводит к формированию новой, ранее не описанной субпопуляции тромбоцитов. Тромбоциты этой субпопуляции экспрессируют фосфатидилсерин, не имея повышенного содержания внутриклеточного кальция. Тромбоциты третьей субпопуляции характеризуются большими, в сравнении с укутанными тромбоцитами, значениями светорассеяния, что говорит о различиях в размере и/или морфологии между клетками этих субпопуляций. Тромбоциты третьей субпопуляции, как и укутанные тромбоциты, связывают фибриноген/фибрин, однако, как и неукутанные тромбоциты, содержат активированный интегрин (ХцъРзаВ работе показано, что формирование третьей субпопуляции тромбоцитов происходит вследствие межклеточных взаимодействий через интегрин (ХцьРза.

Приведенные данные находятся в хорошем согласии с данными, полученными коллегами в нашей лаборатории. Якименко А. О. в своей работе изучала агрегационные свойства субпопуляций активированных тромбоцитов. В своих опытах она активировала тромбоциты и далее подвергала их встряхиванию для формирования агрегатов. Вывод об агрегационных способностях тромбоцитов разных субпопуляций делался из сравнения количеств тромбоцитов разных субпопуляций до и после встряхивания. Результаты этих экспериментов представлены на рисунке 4.1. А-Г. Из рисунка видно, что встряхивание пробы, содержащей активированные тромбоциты, приводит к существенному снижению количества неукутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции, но не укутанных тромбоцитов. Таким образом, укутанные тромбоциты обладают существенно сниженными агрегационными способностями по сравнению с неукутанными тромбоцитами и тромбоцитами третьей субпопуляции. Эти данные находятся в хорошем согласии с данными о состоянии интегрина а11Ьр3а в тромбоцитах разных субпопуляций (рис. З.6.).

Пантелеев М.А. изучал формирование субпопуляций активированных тромбоцитов у пациентов с различными врожденными патологиями тромбоцитов. На рисунке 4.1.Д представлена зависимость отношения количества тромбоцитов третьей субпопуляции к количеству укутанных тромбоцитов от концентрации тромбоцитов в пробе. Представлены данные для здоровых доноров (п=4), двух пациентов с тромбастенией Гланцмана (генетически обусловленным отсутствием интегрина (ХцьРза)" пациента с дефицитом киндлина-1 (важнейшего сигнального вещества, задействованного во внутриклеточной сигнализации от интегрина ацЬ|Зза) и пациента с синдромом Бернара-Сулье (генетически обусловленным отсутствием рецептора 1Ь-1Х и рецепторов фактора фон Виллебранда). Из рисунка видно, что тромбоциты третьей субпопуляции не формируются у больных с тромбастенией Гланцмана и дефицитом киндлина-1, в то время как у больных синдромом Бернара-Сулье тромбоциты третьей субпопуляции формируются нормальным образом. Эти данные являются дополнительным доказательством того факта, что тромбоциты третьей субпопуляции формируются вследствие межклеточных взаимодействий через интегрин апьрза в процессе активации.

До встряхивания.

После встряхивания в $.

Прямое светорассеяние ег.

— Нормальные доноры (п=3) Тромбастения Гланцмана 1 Тромбастения Гланцмана 2 -Дефицит киндлина-1 -Синдром Бернара-Сулье.

0.0 0.5 1.0 1.5 концентрация тромбоцитов, {10!гпГ).

Аннексии V.

Рис. 4.1. Агрегация субпопуляций активированных тромбоцитов и формирование субпопуляций у больных с различными патологиями. А-Г: Тромбоциты (100 000 мкл" 1) окрашивались флуоресцеин-меченным аннексином V и активировались 100 нМ тромбина и подвергались (Б, Г) или не подвергались (А, В) встряхиванию на шейкере (600 об./мин.) в течение 2 мин через 10 мин после активации. Данные Якименко А. О. Д: Тромбоциты здоровых доноров или пациентов с указанными патологиями активировались в различных концентрациях и анализировались на проточном цитометре. Данные Пантелеева М.А.

Экспрессия фосфатидилсерина — физиологически важный ответ тромбоцитов на активацию. Экспрессия фосфатидилсерина обеспечивает прокоагулянтную поверхность, необходимую для сборки комплексов факторов плазменного свертывания. Существует ряд заболеваний, таких как синдром Скотта, при которых нарушение в экспрессии фосфатидилсерина тромбоцитами приводит к кровоточивости. В данной работе показано, что при активации формируется две фосфатидилсерин-экспрессирующие субпопцляции тромбоцитов. Первая из них — это хорошо описанная субпопуляция укутанных тромбоцитов, в которых экспрессия фосфатидилсерина сопряжена со значительным и стабильным повышением уровня внутриклеточного кальция. Вторая из них — это третья субпопуляция активированных тромбоцитов, клетки которой парадоксальным образом сочетают экспрессию фосфатидилсерина и низкий уровень внутриклеточного кальция. Эта субпопуляция продолжает формироваться даже через 40 минут после активации, в то время как уровень кальция в неукутанных тромбоцитах уже возвращается к исходному уровню. Это позволяет предположить существование двух различных механизмов экспрессии фосфатидилсерина: один напрямую связан с уровнем внутриклеточного кальция, другой от него не зависит. Эта гипотеза также встречается в литературных источниках. Экспрессия фосфатидилсерина — это признак клеточной смерти в процессах некроза и апоптоза. Как именно связаны процессы формирования укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции с этими процессами, неизвестно. Высокий уровень внутриклеточного кальция, дезактивация интегрина амьр3а, а также потеря целостности плазматической мембраны позволяют предположить, что укутанные тромбоциты являются некротическими. Ответ на вопрос, как связан процесс формирования тромбоцитов третьей субпопуляции с апоптозом или некрозом, предстоит найти в будущем.

Интегрин ацьрза — это уникальный трансмембранный белок, присутствующий только на поверхности тромбоцитов. От других членов семейства интегринов он отличается тем, что может участвовать в двух типах сигнализации. Первый тип активации интегрина направлен изнутри клетки наружу, этот тип сигнализации приводит к активации интегрина и обеспечивает агрегацию тромбоцитов. Второй тип сигнализации, уникальный для интегрина ацьрза" запускает сигнал внутрь тромбоцита при связывании лиганда и модулирует его дальнейшую активацию. Известно, что этот тип сигнализации играет важную физиологическую роль: генетические дефекты в мышах, связанные с этим типом сигнализации, приводят к дефектам в гемостазе и сниженной стабильностью формирующихся тромбов 86″ 88. Данные, полученные в настоящей работе, позволяют по-новому взглянуть на физиологическую роль этого типа сигнализации, так как она обеспечивает формирование тромбоцитов третьей субпопуляции, экспрессирующих фосфатидилсерин и способных к агрегации. Также полученные данные позволяют по-новому взглянуть на проблему антитромбоцитарной терапии блокаторами интегрина амьр3аТакая терапия может, помимо агрегации тромбоцитов, влиять на их прокоагулянтные свойства, снижая количество тромбоцитов третьей субпопуляции. снижение^{неукутанныи} уровня // тромбоцит тромбоцит третьей субпопуляции неактивированныи тромбоцит экспрессия фосфатидилсерина укутанный повышенный'^ тромбоцит уровень экспрессия кальция '/фосфатидилсерина формирование микровезикул формировании.

Рис. 4.2. Схема регуляции формирования субпопуляций активированных тромбоцитов.

Обобщенные представления о формирования субпопуляций активированных тромбоцитов представлены в виде схемы, изображенной на рисунке 4.2. Неактивированный тромбоцит поддерживает асимметрию плазматической мембраны, интегрин ацЬр3а находится в неактивном состоянии, уровень кальция поддерживается на низком уровне. Добавление активатора приводит к быстрому выбросу кальция в цитоплазму тромбоцита, происходит активация интегрина ацЬ (33а. Через 1−2 минуты после активации начинается разделение тромбоцитов на субпопуляции. Тромбоцит может пойти по трем путям:

— в нем происходит снижение концентрации кальция до начального уровня, и он становится неукутанным тромбоцитом, сохраняя активность интегрина^иьРза и асимметрию плазматической мембраны.

— в «ем происходит снижение концентрации кальция, благодаря межклеточным взаимодействиям запускаются сигнальные пути от интегрина «пьРза* приводящие к экспрессии фосфатидилсерина, и он становится тромбоцитом третьей субпопуляции.

— в нем происходит рост концентрации кальция, нарушение целостности плазматической мембраны, экспрессия фосфатидилсерина и дезактивация интегрина аПьРза, таким образом он становится укутанным тромбоцитом.

Стоит отметить, что ничего не известно о возможности перехода отдельных тромбоцитов из одной субпопуляции в другую. Весьма вероятной кажется необратимость перехода тромбоцита в состояние укутанного тромбоцита. Также, поскольку тромбоциты третьей субпопуляции активно формируются в течение большого промежутка времени после активации, и поскольку экспрессия фосфатидилсерина представляется необратимым процессом, переход тромбоцита в состояние тромбоцита третьей субпопуляции также кажется необратимым. Вообще, метод проточной цитометрии, в котором исследуются множества клеток суспензии, не подходит для ответа на вопрос о судьбе отдельных клеток суспензии. Чтобы лучше понять процессы, происходящие в отдельных тромбоцитах в процессе активации, необходимо применение подхода флуоресцентной микроскопии. Этот подход также поможет ответить на вопрос о морфологических особенностях тромбоцитов той или иной субпопуляции.

Все результаты, изложенные в работе, были получены в экспериментах in vitro с использованием отмытых тромбоцитов. Тем не менее, условия, в которых было обнаружено существование третьей субпопуляции тромбоцитов, гораздо более близки к физиологическим, нежели те условия, при которых эта субпопуляция не обнаруживается. Концентрация тромбоцитов в крови человека близка к той, что использовалась в изложенных экспериментах, а локальная концентрация тромбоцитов вблизи места повреждения может быть еще более высокой. Также, в процессе формирования тромба, закрывающего место повреждения кровеносного сосуда, в условиях потока, эффекты от столкновений тромбоцитов могут быть гораздо более значимыми, чем в экспериментах in vitro. Обнаруженная третья субпопуляция активированных тромбоцитов обладает уникальными для гемостаза свойствами. В отличие от неукутанных тромбоцитов, способных прикрепляться к растущему тромбу, но неспособных поддерживать генерацию тромбина, и укутанных тромбоцитов, способных поддерживать генерацию тромбина, но неспособных прикрепляться к растущему тромбу, тромбоциты третьей субпопуляции сочетают в себе два этих свойства. Все вышеперечисленное указывает на исключительную важность тромбоцитов третьей субпопуляции в гемостазе и тромбозе, эти тромбоциты представляется наиболее активными участниками этих процессов.

ВЫВОДЫ.

1) Концентрации кальция, наблюдаемые в тромбоцитах при сильной активации, находятся в пределах динамического диапазона флуоресцентного Са2±флуорофора Fura Red. В отличие от Calcium Green-1, она может использоваться для исследования кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов крови.

2) Экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами сопровождается продолжительным увеличением концентрации кальция в цитоплазме.

3) При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях формируется новая субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, которая характеризуется: а) низким уровнем внутриклеточного кальция б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных тромбоцитов в) поверхностью, покрытой фибриногеном г) наличием активированного интегрина allb?3, в отличие от ранее описанных укутанных тромбоцитов.

4) Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через интегрин allb?3 в процессе активации.

1. Пантелеев М. А. АФИ. Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология 200 850−62.

2. Heemskerk JW, Bevers ЕМ, Lindhout Т. Platelet activation and blood coagulation. Thromb.Haemost. 2002;88:186−193.

3. Clemetson KJ, Clemetson JM. Platelet collagen receptors. Thromb.Haemost. 2001;86:189−197.

4. Polgar J, Clemetson JM, Kehrel BE et al. Platelet activation and signal transduction by convulxin, a C-type lectin from Crotalus durissus terrificus (tropical rattlesnake) venom via the p62/GPVI collagen receptor. J.Biol.Chem. 1997;272:13 576−13 583.

5. Ceruso MA, McComsey DF, Leo GC et al. Thrombin receptor-activating peptides (TRAPs): investigation of bioactive conformations via structure-activity, spectroscopic, and computational studies. Bioorg.Med.Chem. 1999;7:2353−2371.

6. Kattelman EJ, Venton DL, Le Breton GC. Characterization of U46619 binding in unactivated, intact human platelets and determination of binding site affinities of four TXA2/PGH2 receptor antagonists (13-АРА, BM 13.177, ONO 3708 and SQ 29,548). Thromb.Res. 1986;41:471−481.

7. Pressman BC. Biological applications of ionophores. Annu.Rev.Biochem. 1976;45:501−530.

8. Fox JE. Cytoskeletal proteins and platelet signaling. Thromb.Haemost. 2001;86:198−213.

9. Lee D, Fong KP, King MR, Brass LF, Hammer DA. Differential dynamics of platelet contact and spreading. Biophys.J. 2012;102:472−482.

10. Saelman EU, Nieuwenhuis HK, Hese KM et al. Platelet adhesion to collagen types I through VIII under conditions of stasis and flow is mediated by GPIa/IIa (alpha 2 beta 1-integrin). Blood 1994;83:1244−1250.

11. Robert K. Andrews lMCBlaJAL. The Glycoprotein Ib-IX-V Complex. In: Alan D. Michelson, ed. Platelets, Second edition. 2007:145−165.

12. Alan T. Nurden and Paquita Nurden. Inherited Disorders of Platelet Function. In: Alan D. Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:10 291 051.

13. Edward F. Plow MMPaY-QM. Integrin allbb3. In: Alan D. Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:165−179.

14. Shattil SJ, Newman PJ. Integrins: dynamic scaffolds for adhesion and signaling in platelets. Blood 2004;104:1606−1615.

15. Prevost N, Kato H, Bodin L, Shattil SJ. Platelet integrin adhesive functions and signaling. Methods Enzymol. 2007;426:103−115.

16. Lisa K. Jennings and Melanie McCabe White. Platelet Aggregation. In: Alan D. Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:495−509.

17. Guy L.Reed. Platelet Secretion. In: Alan D. Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:431−445.

18. Flaumenhaft R. Molecular basis of platelet granule secretion. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2003;23:1152−1160.

19. Zwaal RF, Schroit AJ. Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells. Blood 1997;89:1121−1132.

20. Zwaal RF, Comfurius P, Bevers EM. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim.Biophys.Acta 1998;1376:433−453.

21. van DG, Tans G, Rosing J, Hemker HC. The role of phospholipid and factor Villa in the activation of bovine factor X. J.Biol.Chem. 1981;256:3433−3442.

22. Rosing J, Tans G, Govers-Riemslag JW, Zwaal RF, Hemker HC. The role of phospholipids and factor Va in the prothrombinase complex. J.Biol.Chem. 1980;255:274−283.

23. Rienk Nieuwland and Augueste Sturk. Platelet-Derived Microparticles. In: Alan D. Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:403−415.

24. Siljander PR. Platelet-derived microparticles — an updated perspective. Thromb.Res. 2011; 127 Suppl 2: S30-S33.

25. Aleman MM, Gardiner C, Harrison P, Wolberg AS. Differential contributions of monocyteand platelet-derived microparticles towards thrombin generation and fibrin formation and stability. J.Thromb.Haemost. 2011;9:2251−2261.

26. Fontana V, Jy W, Ahn ER et al. Increased procoagulant cell-derived microparticles (C-MP) in splenectomized patients with ITP. Thromb.Res. 2008;122:599−603.

27. Baran J, Baj-Krzyworzeka M, Weglarczyk K et al. Circulating tumour-derived microvesicles in plasma of gastric cancer patients. Cancer Immunol.Immunother. 2010;59:841−850.

28. Zwicker JI, Trenor CC, III, Furie BC, Furie B. Tissue factor-bearing microparticles and thrombus formation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2011;31:728−733.

29. Nieswandt B, Watson SP. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor? Blood 2003;102:449−461.

30. Quinter PG, Dangelmaier CA, Quinton TM, Kunapuli SP, Daniel JL. Glycoprotein VI agonists have distinct dependences on the lipid raft environment. J.Thromb.Haemost. 2007;5:362−368.

31. Kenneth J. Clemetson and Jeannine M.Clemetson. Platelet Receptors. In: Alan D. Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:117−145.

32. Wadie F.Bahou. Thrombin Receptors. In: Alan D. Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:179−201.

33. Brass LF. Thrombin and platelet activation. Chest 2003;124:18S-25S.

34. Covic L, Gresser AL, Kuliopulos A. Biphasic kinetics of activation and signaling for PARI and PAR4 thrombin receptors in platelets. Biochemistry 2000;39:5458−5467.

35. Dorsam RT, Tuluc M, Kunapuli SP. Role of protease-activated and ADP receptor subtypes in thrombin generation on human platelets. J.Thromb.Haemost. 2004;2:804−812.

36. Marco Cattaneo. The Platelet P2 Receptors. In: Alan D. Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:201−221.

37. Woulfe D, Yang J, Brass L. ADP and platelets: the end of the beginning. J.Clin.Invest 2001; 107:1503 -1505.

38. Jin J, Daniel JL, Kunapuli SP. Molecular basis for ADP-induced platelet activation. II. The P2Y1 receptor mediates ADP-induced intracellular calcium mobilization and shape change in platelets. J.Biol.Chem. 1998;273:2030;2034.

39. Oury C, Toth-Zsamboki E, Vermylen J, Hoylaerts MF. The platelet ATP and ADP receptors. Curr.Pharm.Des 2006;12:859−875.

40. Sargeant P, Sage SO. Calcium signalling in platelets and other nonexcitable cells. Pharmacol.Ther. 1994;64:395−443.

41. Jaffe LF. Fast calcium waves. Cell Calcium 2010;48:102−113.

42. Merritt JE, McCarthy SA, Davies MP, Moores KE. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2+. Biochem.J. 1990;269:513−519.

43. Davies TA, Drotts DL, Weil GJ, Simons ER. Cytoplasmic Ca2+ is necessary for thrombin-induced platelet activation. J.Biol.Chem. 1989;264:19 600−19 606.

44. Alberio L, Safa O, Clemetson KJ, Esmon CT, Dale GL. Surface expression and functional characterization of alpha-granule factor V in human platelets: effects of ionophore A23187, thrombin, collagen, and convulxin. Blood 2000;95:1694−1702.

45. London FS, Marcinkiewicz M, Walsh PN. PAR-1-stimulated factor IXa binding to a small platelet subpopulation requires a pronounced and sustained increase of cytoplasmic calcium. Biochemistry 2006;45:7289−7298.

46. Mason MJ, Mahaut-Smith MP. Measurement and manipulation of intracellular Ca2+ in single platelets and megakaryocytes. Methods Mol.Biol. 2004;273:251−276.

47. Heemskerk JW, Hoyland J, Mason WT, Sage SO. Spiking in cytosolic calcium concentration in single fibrinogen-bound fura-2-loaded human platelets. Biochem.J. 1992;283 (Pt 2):379−383.

48. Hussain JF, Mahaut-Smith MP. Reversible and irreversible intracellular Ca2+ spiking in single isolated human platelets. J. Physiol 1999;514 (Pt 3):713−718.

49. Kuwahara M, Sugimoto M, Tsuji S, Miyata S, Yoshioka A. Cytosolic calcium changes in a process of platelet adhesion and cohesion on a von Willebrand factor-coated surface under flow conditions. Blood 1999;94:1149−1155.

50. Jennings LK, Dockter ME, Wall CD, Fox CF, Kennedy DM. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood 1989;74:2674−2680.

51. chary-Prigent J, Freyssinet JM, Pasquet JM, Carron JC, Nurden AT. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: a flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood 1993;81:2554−2565.

52. Pasquet JM, chary-Prigent J, Nurden AT. Calcium influx is a determining factor of calpain activation and microparticle formation in platelets. Eur.J.Biochem. 1996;239:647−654.

53. Alberio L, Dale GL. Flow cytometric analysis of platelet activation by different collagen types present in the vessel wall. Br.J.Haematol. 1998;102:1212−1218.

54. Batar P, Dale GL. Simultaneous engagement of thrombin and Fc gamma RIIA receptors results in platelets expressing high levels of procoagulant proteins. J. Lab Clin.Med. 2001;138:393−402.

55. Dale GL. Coated-platelets: an emerging component of the procoagulant response. J.Thromb.Haemost. 2005;3:2185−2192.

56. Dale GL, Friese P, Batar P et al. Stimulated platelets use serotonin to enhance their retention of procoagulant proteins on the cell surface. Nature 2002;415:175−179.

57. Szasz R, Dale GL. Thrombospondin and fibrinogen bind serotonin-derivatized proteins on COAT-platelets. Blood 2002;100:2827−2831.

58. Bevers EM, Janssen MP, Comfurius P et al. Quantitative determination of the binding of beta2-glycoprotein I and prothrombin to phosphatidylserine-exposing blood platelets. Biochem.J. 2005;386:271−279.

59. Kempton CL, Hoffman M, Roberts HR, Monroe DM. Platelet heterogeneity: variation in coagulation complexes on platelet subpopulations. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2005;25:861 -866.

60. Panteleev MA, Ananyeva NM, Greco NJ, Ataullakhanov FI, Saenko EL. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. J.Thromb.Haemost. 2005;3:2545−2553.

61. Kulkarni S, Jackson SP. Platelet factor XIII and calpain negatively regulate integrin alphallbbeta3 adhesive function and thrombus growth. J.Biol.Chem. 2004;279:30 697−30 706.

62. Szasz R, Dale GL. COAT platelets. Curr.Opin.Hematol. 2003;10:351−355.

63. Phillips JE, Lord ST, Gilbert GE. Fibrin stimulates platelets to increase factor Villa binding site expression. J.Thromb.Haemost. 2004;2:1806−1815.

64. Dale GL, Remenyi G, Friese P. Quantitation of microparticles released from coated-platelets. J.Thromb.Haemost. 2005;3:2081;2088.

65. Munnix IC, Cosemans JM, Auger JM, Heemskerk JW. Platelet response heterogeneity in thrombus formation. Thromb.Haemost. 2009; 102:11 491 156.

66. Munnix IC, Kuijpers MJ, Auger J et al. Segregation of platelet aggregatory and procoagulant microdomains in thrombus formation: regulation by transient integrin activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2007;27:2484−2490.

67. Kotova YN, Ataullakhanov FI, Panteleev MA. Formation of coated platelets is regulated by the dense granule secretion of adenosine 5'diphosphate acting via the P2Y12 receptor. J.Thromb.Haemost. 2008;6:1603−1605.

68. Jackson SP, Schoenwaelder SM. Procoagulant platelets: are they necrotic? Blood 2010;116:2011;2018.

69. Dale GL, Friese P. Bax activators potentiate coated-platelet formation. J.Thromb.Haemost. 2006;4:2664−2669.

70. Remenyi G, Szasz R, Friese P, Dale GL. Role of mitochondrial permeability transition pore in coated-platelet formation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2005;25:467−471.

71. Jobe SM, Wilson KM, Leo L et al. Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis. Blood 2008; 111:1257−1265.

72. Wolfs JL, Comfurius P, Rasmussen JT et al. Activated scramblase and inhibited aminophospholipid translocase cause phosphatidylserine exposure in a distinct platelet fraction. Cell Mol. Life Sei. 2005;62:1514−1525.

73. Smrz D, Lebduska P, Draberova L, Korb J, Draber P. Engagement of phospholipid scramblase 1 in activated cells: implication for phosphatidylserine externalization and exocytosis. J.Biol.Chem. 2008;283:10 904−10 918.

74. Bevers EM, Williamson PL. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 2010;584:2724−2730.

75. Schoenwaelder SM, Yuan Y, Josefsson EC et al. Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function. Blood 2009;114:663−666.

76. Prodan CI, Vincent AS, Dale GL. Coated-platelet levels are elevated in patients with transient ischemic attack. Transl.Res. 2011;158:71−75.

77. Prodan CI, Ross ED, Vincent AS, Dale GL. Rate of progression in Alzheimer’s disease correlates with coated-platelet levels~a longitudinal study. Transl.Res. 2008;152:99−102.

78. Norgard NB, Saya S, Hann CL et al. Clopidogrel attenuates coated-platelet production in patients undergoing elective coronary catheterization. J.Cardiovasc.Pharmacol. 2008;52:536−539.

79. Prodan CI, Vincent AS, Padmanabhan R, Dale GL. Coated-platelet levels are low in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage. Stroke 2009;40:2578−2580.

80. Valaydon ZS, Lee P, Dale GL et al. Increased coated-platelet levels in chronic haemodialysis patients. Nephrology.(Carlton.) 2009;14:148−154.

81. Saxena K, Pethe K, Dale GL. Coated-platelet levels may explain some variability in clinical phenotypes observed with severe hemophilia. J.Thromb.Haemost. 2010;8:1140−1142.

82. Thomas D, Tovey SC, Collins TJ et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium 2000;28:213−223.

83. Lee SK, Lee JY, Lee MY, Chung SM, Chung JH. Advantages of calcium green-1 over other fluorescent dyes in measuring cytosolic calcium in platelets. Anal.Biochem. 1999;273:186−191.

84. Timmons S, Hawiger J. Isolation of human platelets by albumin gradient and gel filtration. Methods Enzymol. 1989; 169:11−21.

85. Hemker HC, Al DR, De SE, Beguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb.Haemost. 2006;96:553−561.

86. Shcherbina A, Cooley J, Lutskiy MI et al. WASP plays a novel role in regulating platelet responses dependent on alphallbbeta3 integrin outside-in signalling. Br.J.Haematol. 2010;148:416−427.

87. Goschnick MW, Lau LM, Wee JL et al. Impaired «outside-in» integrin alphallbbeta3 signaling and thrombus stability in TSSC6-deficient mice. Blood 2006;108:1911;1918.

88. Law DA, DeGuzman FR, Heiser P et al. Integrin cytoplasmic tyrosine motif is required for outside-in alphallbbeta3 signalling and platelet function. Nature 1999;401:808−811.