Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика дисрегенераторных изменений эпителия легкого человека

Актуальность темы

.

Проблема ранней онкологической патологии для рака легкого имеет первостепенное значение в связи с тем, что в последние годы рак легкого вышел на первое место в мире по заболеваемости и смертности, обогнав рак желудка. Показатели смертности от рака легкого по среднестатистическим данным во многих странах повышаются примерно на 10% каждые 5 лет. В странах бывшего Советского Союза с 1981 рак легкого является самой часто встречающейся карциномой у мужчин, на долю которой приходится 14,6% всех злокачественных опухолей (17). Рак легкого среди других злокачественных опухолей выделяется большими трудностями своевременной диагностики, обилием морфологических форм, ранним и многообразным метастазированием и плохими результатами лечения. Несмотря на успехи современной медицины, рак легкого, как правило, диагностируется на поздних стадиях, когда радикальное лечение бывает малоэффективным. Рассчитывать на 5 лет жизни могут только 5% заболевших (23). Начальные этапы канцерогенеза протекают скрыто и клинически, как праршо, не выявляются. По данным А.Х. Трахтен-берга и И. В. Кузьмина (1985 г.) ни один больной центральным раком легкого не был выявлен в доклиническом периоде заболевания и при флюорографическом обследовании, в то время как диагностика рака легкого на стадии предрака и раннего рака — основной путь улучшения результатов лечения и прогноза.

Обширная литература, касающаяся разных аспектов этой болезни века общеизвестна, но сведения о предраке довольно скудны. Нет единого понимания терминологии, отсутствуют выработанные морфологические критерии предрака легкого и общепринятые всеобъемлющие классификации, мало изучены ранние структурные и молекулярно-генетические признаки предраковых изменений легкого. В классификации ВОЗ опухолей легких 1981 г. выделяют единственный вариант предрака — «дисплазия эпителия бронхов». В классификации ВОЗ опухолей легких 1999 г. рубрика предраковых изменений легочного эпителия расширена и включает: 1) плоскоклеточную дисплазию и карциному на месте- 2) атипическую аденоматозную гиперплазию- 3) гиперплазию нейроэндокринных клеток. Однако, помимо перечисленных изменений, рядом авторов (Е.А. Коган и соавт., 1991; А.Ь.ЗшИЬ и соавт., 1979; К. МиНег, 1979) описываются и другие дисрегенераторные процессы в эпителии бронхов, бронхиол и альвеол, злокачественный потенциал которых пока неизвестен. Кроме того, практически не изучен вопрос о возможной роли атрофиче-ских изменений легочного эпителия в развитии рака.

Параллельно с ростом заболеваемости раком легкого отмечается увеличение числа хронически воспалительных заболеваний легких, являющихся фоновыми для развития рака, которые могут быть названы предраковыми состояниями. К таким заболеваниям могут прежде всего быть отнесены хронические обструктивные болезни легких, идиопа-тический фиброзирующий альвеолит, туберкулез легких, пневмокониозы различной этиологии (19,34,35,79,105,118,119).

В настоящее время наряду с традиционными морфологическими подходами к диагностике предраковых процессов ведется активный поиск новых методов ранней диагностики онкологической патологии, позволяющих выявить изменения в системах, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток (онкогенов, генов-супрессоров опухоли, факторов роста, адгезивных молекул и т. д.). Особый интерес представляет изучение биомолекулярных опухолевых маркеров при различных дисрегенераторных изменениях легочного эпителия при хронических воспалительных заболеваниях легких.,.

Целью настоящей работы явилось изучение морфологических, цитогенетических и молекулярно-биологических особенностей гиперпластических, метапластических, дис-пластических и атрофических изменений легочного эпителия при хронических воспалительных заболеваниях и в ткани легкого, окружающей рак, и оценка их злокачественного потенциала.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Дать морфологическую характеристику различных видов диерегенераторных изменений легочного эпителия.

2. Охарактеризовать цитогенез различных видов диерегенераторных изменений легочного эпителия.

3. Определить нозологическую специфичность этих изменений.

4. Изучить иммуногистохимию онкомаркеров рака легкого (Кл-67, РСЫА, Ьс1−2, р53, с-тус, ЮР-р) в различных видах диерегенераторных изменений легочного эпителия.

5. Оценить злокачественный потенциал каждого вида изменений легочного эпителия по содержанию биомолекулярных опухолевых маркеров.

6. Сравнить экспрессию различных онкомаркеров в эпителиальных клетках в диерегенераторных изменениях при хронических воспалительных заболеваниях легких и в ткани легкого, окружающей рак.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования уточнена природа диерегенераторных изменений легочного эпителия: к гиперпластическим процессам в легочном эпителии следует относить бокаловидноклеточную гиперплазию, базальноклеточную гиперплазию, нейроэндокринную гиперплазию, аденоматозную гиперплазию и гиперплазию эпителия в овальных и щелевидных структурах, к метапластическим процессам — плоскоклеточную метаплазию, которая может встречаться как в эпителии бронхов и бронхиол, так и в участках аденоматозной гиперплазии и в овальных и щелевидных структурах в очагах фиброза .

Расширен спектр диспластических процессов в легком, к которым следует относить не только дисплазию метаплазированного многослойного плоского эпителия, но и атипическую базалыюклеточную гиперплазию, атипическую аденоматозную гиперплазию и атипические овальные и щелевидные структуры.

Группа дисрегеиераториых процессов в легком расширена за счет атрофии эпителия, которая обнаруживалась в виде атрофии бронхиального эпителия и атрофии эпителия овальных и щелевидных структур.

Выявлены нозологические особенности дисрегенераторных процессов в легком, заключающиеся в различной частоте их возникновения при разных заболеваниях. Установлено, что при хроническом абсцессе наиболее часто встречаются базальноклеточная гиперплазия без и с признаками атипии, плоскоклеточная метаплазия в сочетании с дис-плазией эпителия, аденоматозная гиперплазия и атрофия эпителия бронховпри бронхо-эктатической болезни — базальноклеточная гиперплазия и атрофия бронхиального эпителияпри туберкулезе — базальноклеточная гиперплазия без и с признаками атипии, плоскоклеточная метаплазия в сочетании с дисплазией, овальные и щелевидные структуры без и с признаками атипии, атрофия бронхиального эпителияпри идиопатическом фибрози-рующем альвеолите — аденоматозная гиперплазия и атипическая аденоматозная гиперплазия.

Показано, что при всех вариантах дисрегенераторных изменений легочного эпителия иммуногистохимически регистрируется перестройка в работе биомолекулярных опухолевых маркеров: Кл-67, РСИА, Ьс1−2, р53, с-тус, ТСР-р, уровень экспрессии которых увеличивается при нарастании признаков клеточной атипии.

Установлено, что наибольшим злокачественным потенциалом, судя по экспрессии онкомаркеров, обладают дисплазия 3 бронхиального эпителия, атипическая базальноклеточная гиперплазия, атипическая аденоматозная гиперплазия и атипические овальные и щелевидные структуры структуры, которые могут считаться предраковыми процессами в легких. Показано, что в этих же процессах отмечается усиление репарации ДНК как одного из основных механизмов антибластомной резистентности.

Вывалено, что атрофия эпителия возникает не только в бронхах, но и в бронхиолах и альвеолах без и фоне фиброза (в овальных и щелевидных структурах). Наличие экспрессия КН>7 и р53 в очагах атрофии может свидетельствовать об интенсификации в них пролиферации и апоптоза в ответ на повреждение ДНК с преобладанием последнего, т. е. можно считать, что процесс атрофии эпителия является активным процессом, развивающимся при наличии пролиферации клеток, в сочетании, вероятно, с увеличением их гибели путем апоптоза.

Дисрегенераторные изменения в ткани легкого, окружающей рак, характеризуются более интенсивной экспрессией Кл-67, РСЫА, Ьс1−2, р53, с-шус, ТСР-р по сравнению с дисрегенераторными изменениями при хронических воспалительных заболеваниях легких.

Практическая значимость работы.

Полученные данные могут быть использованы в проведении морфологической дифференциальной диагностики дисрегенераторных процессов в легком, в диагностике опухолей легкого на стадии предрака, что поможет в предупреждении развития рака легкого, а также в разработке новых подходов к профилактике предрака и рака легкого, лечению и прогнозированию течения заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту Положение 1.

В легких обнаруживается широкий спектр цитогенетических вариантов дисрегенераторных изменений эпителия, отличающихся своей природой. Более выраженное разнообразие дисрегенераторных процессов в бронхиолах и альвеолах по сравнению с бронхами свидетельствует о более высокой пластичности клеток-предшественниц в этих структурах. В соответствии с морфологической природой, все варианты дисрегенераторных процессов в эпителии легких можно разделить на гиперпластические, метапластические, диспластические и атрофические.

Положение 2.

Различные онтогенетические варианты дисрегенераторных изменений легочного эпителия отличаются между собой не только морфологически, но и по накоплению в эпителиальных клетках продуктов экспрессии онкомаркеров: Кд-67, РСЫА, Ьс1−2, р53, с-шус, ТСГ-р, что свидетельствует о различиях в их злокачественном потенциале. Наибольшим злокачественным потенциалом, судя по морфологическим признакам и экспрессии онкомаркеров обладают дисплазия 3 бронхиального эпителия, атипическая базальноклеточная гиперплазия, атипическая аденоматозная гиперплазия и атипические овальные и щеле-видные структуры, которые могут считаться предраковыми процессами в легких. В дис-пластических процессах активизируются механизмы антибластомной резистентности, судя по маркерам репарации ДНК и апоптоза (Д=%РСЫА — %Кл-67, р53).

Положение 3.

Дисренераторные изменения в ткани легкого, окружающей рак, характеризуются более интенсивным накоплением белковых продуктов реакции Кл-67, РСЫА, Ьс1−2, р53, с-шус, ТСР-Р по сравнению с дисрегенераторными изменениями при хронических воспалительных заболеваниях легких. Таким образом, можно предположить, что легочный эпителий по молекулярно-биологическим особенностям в окружающей рак ткани частично уподобляется первичной опухоли.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами по темам онкоморфологии и хронических воспалительных-заболеваний легких на кафедре патологической анатомии, а также в работе биопсийной лаборатории ММА им. И. М. Сеченова и патологоанатомического отделения ГКБ № 61.

Апробация работы.

Апробация работы проводилась 1 апреля 2003 г. на заседании кафедры патологической анатомии ММА им. И. М. Сеченова.

Материалы работа представлены на научных конференциях кафедры патологической анатомии ММА им. И. М. Сеченова (апрель 1999, май 2002), X и XI Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (1−4 ноября 2000 г., Санкт-Петербург- 9−13 ноября 2001 г., Москва), XI Конгрессе Европейского респираторного общества (22−26 сентября 2001 г., Берлин, Германия).

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых три тезиса доклада опубликованы в European Respiratory Journal (1999, 2001,2002 гг.), 5 — в материалах Всероссийских конференций, 1 статья принята в центральную печать (Архив патологии, Ш 4,2003).

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Текст диссертации изложен на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирован И таблицами, 16 рисунками, в том числе 7 монтажами цветных микрофотографий. Библиографический указатель включает 132 источника литер i гуры, в том числе 41 отечественный.

Выводы.

1. Хронические воспалительные заболевания легких характеризуются широким спектром цитогенетических вариантов дисрегенераторных изменений эпителия бронхов, бронхиол и альвеол, что, вероятно, обусловлено разнообразием и пластичностью клеток-предшественниц, а также характером основного заболевания. Помимо известных дисрегенераторных процессов в легком, следует выделять атрофию эпителия.

2. «Бокаловидноклеточная трансформация» является результатом гиперплазии бокаловидных клеток, характеризуется низкой экспрессией онкомаркеров и может быть названа бокаловидноклеточной гиперплазией.

3. Атипическая базальноклеточная гиперплазия является вариантом дисплазии бронхиального эпителия, судя по наличию клеточной атипии и усилению экспрессии онкомаркеров Ьс1−2, р53, Ю-67, РСЫА.

4. Атрофия эпителия возникает не только в бронхах, но и в бронхиолах и альвеолах без и на фоне фиброза (в овальных и щелевидных структурах). Наличие экспрессии К1−67 и р53 в очагах атрофии может свидетельствовать об интенсификации в них пролиферации и апоптоза в ответ на повреждение ДНК с преобладанием последнего.

5. Дисрегенераторные процессы представлены: гиперпластическими процессамибокаловидноклеточной гиперплазией, базальноклеточной гиперплазией, нейроэндокрин-ноклеточной гиперплазией, аденоматозной гиперплазией и гиперплазией эпителия в овальных и щелевидных структурахметапластическим процессом — плоскоклеточной метаплазиейдиспластическими процессами — дисплазией, атипической базальноклеточной гиперплазией, атипической нейроэндокринноклеточной гиперплазией, атипической аденоматозной гиперплазией, атипическими овальными и щелевидными структурамиатро-фическими процессами — атрофией бронхиального эпителия и эпителия в овальных и щелевидных структурах.

6. Наибольшим злокачественным потенциалом, судя по экспрессии онкомаркеров, обладают дисплазия 3 ст. бронхиального эпителия, атипическая базальноклеточная гиперплазия, атипическая аденоматозная гиперплазия и атипические овальные и щелевидные структуры, которые могут считаться предраковыми процессами в легких.

7. Диспластические процессы в легком, отнесенные нами к предраковым, характеризуются активацией механизмов антибластомной резистентности, связанных с репарацией ДНК и, вероятно, апоптоза, о чем свидетельствует выраженная разница в экспрессии РСИА и К1−67 и усиление экспрессии р53.

8. Дисрегенераторные изменения в ткани легкого, окружающей рак, характеризуются более высокой экспрессией Кь67, РС^, Ьс1−2, р53, с-шус, ТСЕ-Р по сравнение • с дисрегенераторными изменениями при хронических воспалительных заболеваниях легких. Таким образом, можно предположить, что легочный эпителий по молекулярно-биологическим особенностям в окружающей рак ткани частично уподобляется первичной опухоли.

Заключение

.

Рак легкого — одно из самых распространенных онкологических заболеваний. В последние годы рак легкого вышел на первое место в мире по заболеваемости и смертности, обогнав рак желудка. Кроме того, рак легкого среди других злокачественных опухолей выделяется большими трудностями своевременной диагностики, обилием морфологических форм, ранним и многообразным метастазированием и плохими результатами лечения. Параллельно с ростом рака данной локализации отмечается увеличение числа хронических воспалительных заболеваний легких, являющихся фоновыми для развития рака легкого, таких как хронические обструктивные болезни легких, идиопатический фибрози-рующий альвеолит, туберкулез легких. В связи с этим, проблема ранней онкологической патологии для легкого приобретает первостепенное значение.

В настоящее время морфологическая диагностика предраковых процессов в легких затруднена. Отсутствуют выработанные морфологические критерии предрака легкого и общепринятые всеобъемлющие классификации, мало изучены ранние структурные и мо-лекулярно-генетические признаки предраковых изменений легкого. В классификации ВОЗ опухолей легких 1999 г. выделяют три типа предраковых изменений:

1) плоскоклеточная дисплазия и карцинома на месте,.

2) атипическая аденоматозная гиперлазия,.

3) гиперплазия нейроэндокринных клеток.

Однако, помимо перечисленных изменений в легочном эпителии описываются и другие дисрегенераторные процессы, злокачественный потенциал которых не известен.

В настоящее время наряду с традиционными морфологическими подходами к диагностике предраковых процессов ведется активный поиск новых методов ранней диагностики онкологической патологии, позволяющих выявить изменения в системах, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток (онкогенов, генов-супрессоров опухоли, факторов роста, адгезивных молекул и т. д.). Достижения последних десятилетий в области изучения стволовых клеток расширили наши представления о возможных цитогене-тических источниках развития различных опухолей, в том числе и рака легкого. Известно, что стволовые и полустволовые клетки вовлекаются в паюлогические процессы, сопровождающиеся регенерацией поврежденных тканей, метаплазией и дисплазией эпителия. Несомненно их участие и в развитии опухолей. При этом в легких в условиях патологии наблюдается многообразие морфологических вариантов дисрегенераторных процессов, отличающихся пролиферативной активностью, цитогенетической дифференцировкой клеток и их локализацией. Поэтому можно предположить, что изучение цитогенеза регенераторных, метапластических и дисрегенераторных изменений эпителия в условиях патологии может расширить наши представления о клетках-предшественницах и их пластичности. В то же время, данный подход к изучению регенераторных, метапластических и дисрегенераторных изменений эпителия в легких позволит охарактеризовать их цитоге-нетические варианты. Изучение же онкомаркеров в этих процессах может помочь в оценке их злокачественного потенциала.

Целью работы явилось изучение морфологических, цитогенетических и молеку-лярно-биологических особенностей гиперпластических, метапластических, диспластиче-ских и атрофических изменений легочного эпителия при хронических воспалительных заболеваниях и в ткани легкого, окружающей рак, и оценка их злокачественного потенциала.

Работа выполнена на операционном архивном материале удаленных легких и их частей (75) и открытых биопсий (19) от 94 больных с диагнозами хронический абсцесс (12), бронхоэктатическая болезнь (13), туберкулез (7), идиопатический фиброзирующий альвеолит (10), исследовалась также ткань легкого, окружающая рак (52). Больные находились на лечении в ПСБ № 61 и клинике факультетской хирургии им. H.H. Бурденко ММА им. И. М. Сеченова. И. М. Сеченова с 1990 по 1998 гг. Среди пациентов преобладали мужчины (69 человек): соотношение мужчин и женщин 3:1. Возраст больных колебался от 18 до 75 лет.

Изучали макропрепараты и залитые в парафин, предварительно фиксированные в 10% забуференном формалине кусочки легочной ткани. С каждого блока делались серийные срезы толщиной 4 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, альциановым синим, пикрофуксином по ван Гизону, ставилась PAS-реакция по общепринятым методикам.

Иммуногистохимические реакции с целью выявления биомолекулярных опухолевых маркеров Ki-67, PCNA, bcl-2, р53, с-шус, TGF-p и хромо1ранинаА проводились на депарафинированных срезах (Janice А., 1983). Демаскировка антигена осуществлялась путем инкуе дни срезов в течение 20 минут в микроволновой печи при мощности 600 Вт в растворе 10 тМ цтратаого буфера с РН 6.0. Эндогенная пероксидаза блокировалась при обработке срезов в течение 20 мин в 0,3% перекисью водорода на метаноле.

В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к Ki-67 (DAKO, в концентрации 1:100), PCNA (DAKO, в концентрации 1:100), bcl-2 (DAKO, в концентрации 1:80), р-53 (DAKO, в концентрации 1:40), c-myc (Novocastra, в концентрации 1:100), TGF-p (BIOSOURCE international, California, в концентрации 1:100), хромога-нину-А (DAKO, в концентрации 1:100). Ставились контрольные реакции: позитивный контроль — с тканью мелкоклеточного рака легкого с известной положительной экспрессией биомолекулярных маркеров, негативный контроль — без первичных антител. В качестве вторичных антител использовались биотинилированные иммуноглобулины мыши и кролика (DAKO, в концентрации 1: 200). В качестве фонового докрашивания использо-вапся гематоксилин.

Результаты иммуногистохимических реакций оценивались в баллах от 0 до 6 (сюус, TGF-p, хромогранин-А) методом полуколичественного анализа с учетом количества окрашенных клеток: 1 балл — до 10% окрашенных клеток, 2 балла — до 20% окрашенных кшок, 4 балла — 20−50% окрашенных клеток, 6 баллов — более 50% окрашенных клеток,.

94 отсутствие окраски — 0 баллов. В случаях слабой реакции (bcl-2), а также при ядерной локализации продуктов реакции (Ki-67, PCNA, Р53) подсчитывали процент окрашенных клеток и ядер (на 300 клеток) из разных участков препарата.

Проводили корреляционный анализ уровней экспрессии изученных онкомаркеров с расчетом коэффициента Пирсона, определяли стандартную ошибку средней с использованием программы SPSS for Windows, version 10.0.5 (27 Nov 1999), СШАуровней экспрессии отдельных онкомаркеров. Вычисляли доверительный интервал методом дисперсионного анализа (ANOVA).

В результате морфологического исследования все изученные дисрегенераторные процессы были разделены на две группы: изменения эпителия бронхов и изменения эпителия бронхиол и альвеол. Изменения эпителия в бронхах были представлены: бокало-видноклеточной гиперплазией, базальноклеточной гиперплазией, атипической базальнок-леточной гиперплазией, плоскоклеточной метаплазией, дисплазией 1−3 ст., гиперплазией нейроэндокринных клеток без и с атипией, атрофией эпителия. Все вышеописанные процессы, обнаруживаемые в бронхах развиваются также в бронхиолах и альвеолах в условиях патологии. Кроме гого, в эпителии бронхиол и альвеол могут встречаться также такие дисрегенераторные изменения как: аденоматозная гиперплазия без атипии, атипическая аденоматозная гиперплазия, овальные и щелевидные структуры на фоне фиброза без и с признаками атипии, а также с атрофией эпителия.

Бокаловидноклеточная гиперплазия, по нашим данным, чаще всего встречалась при бронхоэктагической болезни, хроническом абсцессе и в ткани легкого, окружающей рак. Она характеризовалась замещением реснитчатых клеток бокаловидными, отличающимися гиперпродукцией слизи. Единичные пролиферирующие Ki-67-положительные клетки были представлены, в основном, слизистыми клетками. Согласно данным литературы (26, 67), бокаловидные клетки являются полустволовыми клетками-предшественницами, т.к. способны к пролиферации и участвуют в регенерации эпителиальной выстилки воздухопроводящих путей. Отсюда можно предположить, что т.н. бока-ловидноклеточная трансформация является результатом пролиферации слизистых клеток и, возможно, какой-то части базальных клеток с их последующей дифференцировкой в слизистые клетки. Следовательно, исходя из этих данных, описанный патологический процесс правильнее называть бокаловидноклеточной гиперплазией, а не бокаловиднокле-точной трансформацией, которая цитогенетически связана прежде всего со слизьпродуци-рующей клеткой-предшественницой. При иммуногистохимическом исследовании в очагах бокаловидноклеточной гиперплазии отмечалось слабое накопление белковых продуктов всех изученных онкомаркеров, в несколько большем количестве — с-шус и ТСР-р.

Базальноклеточная гиперплазия и атипическая базадьноклеточная гиперплазия чаще всего обнаруживалась у больных хроническим абсцессом, бронхоэктатической болезнью и по периферии рака. Уровень экспрессии Кл-67 составил 1,9%, а при появлении признаков атипии 4,1%. К>67-положительные клетки локализовались, в основном, в базаль-ной и парабазальной областях, а при выраженной пролиферации и атипии базальных клеток обнаруживались во всех отделах эпителиального пласта. По данным ряда исследователей (26, 50), базальные клетки являются одними из прогенеторных клеток бронхиального эпителия, следовательно, базальноклеточная гиперплазия и атипическая базальноклеточная гиперплазия цитогенетически связаны с нарушением пролиферации и дифферен-цировки базальных клеток. При этом атипическая базальноклеточная гиперплазия может расцениваться как вариант дисплазии бронхиального эпителия. При иммуногистохимическом исследовании в участках базальноклеточной гиперплазии бронхиального эпителия преимущественно аккумулируются РС^, с-шус и р53, экспрессия которых усиливается при появлении признаков клеточной атипии. В очагах атипической базальноклеточной гиперплазии, кроме этого отмечается усиление экспрессии Ьс1−2.

Нейроэндокринная гиперплазия на светооптическом уровне не отличалась от базальноклеточной гиперплазии, при этом в клетках иммуногистохимически выявлялся хромогранин-А, а КЙ>7-положительные клетки, в основном, соответствовали хромогра-нин-положительным клеткам и располагались в базальных и парабазальных зонах, т. е. ци-тогенетически, вероятнее всего, связаны с клетками Кульчицкого бронхиальной стенки. Дифференцировка нейроэндокринной гиперплазии с базальноклеточной гиперплазией на светооптическом уровне была возможна лишь при реакции на выявление хромогранина-А.

Плоскоклеточная метаплазия бронхиального эпителия, по нашим данным, чаще всего встречалась при хроническом абсцессе и в окружающей рак ткани. Уровень экспрессии КН>7 был довольно низким, Кл-67- положительные клетки выявлялись, в основном, в базальных отделах эпителиального пласта, что позволяет предположить наличие цитогенетической связи плоскоклеточной метаплазии с базальным эпителием. В очагах плоскоклеточной метаплазии преимущественно накапливались продукты реакции РСОД и в небольших количествах р53, с-тус и ТСИ-р.

Дисплазия 1−2 ст. многослойного плоского эпителия чаще всего обнаруживалась у больных хроническим абсцессом, а дисплазия 3 ст. — в ткани легкого, окружающей раковую опухоль. Уровень экспрессии Ю-67 в очагах дисплазии 1−2 ст. составил 7,3%, диспла-зии 3 ст. — 9%. В участках дисплазии эпителия 1−2 ст. выявлялась экспрессия всех изученных онкомаркеров, при этом наибольшая экспрессия была характерна для РСЫА и р53, уровни которой значительно возрастали в очагах тяжелой дисплазии.

Атрофия эпителия бронхов встречалась при всех заболеваниях, однако чаще всего при хроническом абсцессе, бронхоэктатической болезни и туберкулезе. В участках атрофии бронхиального эпителия выявлялась слабая экспрессия всех изученных онкомаркеров. Уровень экспрессии гена-супрессора р53 составил 2,6%, Кл-67 — 2,7%, а РСЫА, отвечающего за процессы репарации ДНК — 19,2%, что позволяет предположить, что процесс атрофии является активным процессом, развивающимся при наличии пролиферации клеток, в сочетании, вероятно, с увеличением их гибели путем апоптоза.

Все вышеописанные процессы, обнаруживаемые в бронхах, развиваются также в бронхиолах и альвеолах в условиях патологии. Кроме того, в эпителии бронхиол и альвеол могут встречаться такие дисрегенераторные изменения как: аденоматозная гиперплазия без атипии, атипическая аденоматозная гиперплазия, овальные и щелевидные структуры на фоне фиброза без и с признаками атипии, а также с атрофией эпителия. Источником описанных процессов, по данным ряда авторов (26, 50), считаются секреторные клетки Клара, альвеолоциты 2-го типа и нейроэндокринные клетки-предшественницы (альвеоло-циты 3-го типа).

Оба варианта аденоматозной гиперплазии чаще всего обнаруживались нами при идиопатическом фиброзирующем альвеолите, в сотовом легком, при хроническом абсцессе и в ткани легкого, окружающей раковальные и щелевидные структуры — в легочной ткани больных туберкулезом. Уровень экспрессии Кл-67 в участках аденоматозной гиперплазии и атипической аденоматозной гиперплазии составил 2,7% и 6,4% соответственно, в овальных и щелевидных структурах без атипии — 2%, а при появлении признаков клеточной атипии — 5,3%. Очаги аденоматозной гиперплазии, также как и овальные и щелевидные структуры характеризовались накоплением продуктов экспрессии РСЫА, с-шус, Ь-ТОР, а также в небольших количествах р-53. Очень часто в этих участках обнаруживались хромогранин-положительные эпителиальные клетки. При появлении атипии клеток уровень экспрессии онкогенов и гена-супрессора р53 возрастал. В овальных и щелевидных структурах с признаками атрофии клеток отмечалось накопление продуктов экспрессии РСЫА, КЫ>7, с-шус, ТСР-Р и в небольших количествах — р53.

Таким образом, КЬ67-положительные клетки в нашем исследовании встречались как в очагах аденоматозной гиперплазии, так и в участках локализации овальных и щелевидных структур и, судя по данным литературы, должны соответствовать пролифери-рующим клеткам Клара, нейроэндокринным клеткам и альвеолоцитам 2-го типа.

Итак, спектр пролиферирующих клеток в условиях патологии в периферических отделах легкого был значительно шире, чем в крупных бронхах и цитогенетически может быть связан не только с клетками Клара и альвеолоцитами 2-го типа, но и с базальными, нейроэндокринными клетками и, вероятно, более ранними клетками-предшественницами.

Сравнивая цитогенетические варианты дисрегенераторных изменений легочного эпителия, следует отметить наличие более широкого спектра дисрегенераторных изменений на периферии легкого, что говорит о большей пластичности и разнообразии прогене-юрных клеток в этой области. Не исключено также, что эта пластичность связана с особым микроокружением периферических отделов легкого, особенно в условиях хронического воспаления, накопления эмбриональных типов коллагена (8,10,13).

Анализируя экспрессию онкомаркеров при различных видах дисрегенераторных изменений легочного эпителия при хронических воспалительных заболеваниях легких, мы попытались ответить на вопрос: существуют ли молекулярно-биологические особенности тех или иных патологических процессов в эпителии легкого, объясняющие различия в их злокачественном потенциале.

По нашим данным, уровни экспрессии онкомаркеров при одних и тех же дисрегенераторных процессах в разных нозологиях воспалительной природы мало отличались друг от друга. Поэтому дальнейший анализ уровней экспрессии онкомеркеров по каждому дисрегенераторному процессу мы провели в совокупности, без учета нозологии.

Экспрессии Ьс1−2 в целом, была очень низкой и достигала максимум 2,7% при атипической базальноклеточной гиперплазии. Продукт экспрессии Ьс1−2 выявлялся в цитоплазме отдельных базальных клеток бронхиального эпителия как в норме, так и при бока-ловидноклеточной гиперплазиив несколько большем количестве клеток — в отдельных случаях дисплазии эпителия бронхов, аденоматозной гиперплазии и в овальных и щеле-видных структурах. Более высокие уровни экспрессии Ьс1−2 выявлялись в очагах атипической базальноклеточной гиперплазии эпителия, что может подтверждать цитогенетическую связь базальноклеточной гиперплазии с базальной клеткой бронхиального эпителия, а также с мелкоклеточным раком легкого, для которого наиболее характерна экспрессия Ьс1"2.

Уровень экспрессии гена-супрессора р53 также в целом был невысокий. Продукт экспрессии р53 обнаруживался в ядрах базальных, слизистых, нейроэндокринных клеток, клеток Клара и альвеолоцитах 2-го типа при всех вариантах дисрегераторных изменений легочного эпителия. В очагах бокаловидноклеточной гиперплазии, плоскоклеточной метаплазии и в овальных и щелевидных структурах без атипии выявлялись единичные р53-положительные клетки (0,3%). Уровень экспрессии р53 в участках базальноклеточной ги-. ¿-рплазии и адепоматозной гиперплазии без атипии составил 1,5% и 2,4% соответственно. При атрофии бронхиального эпителия р53 экспрессировался 2,6% клеток. Наибольшая экспрессия р53 отмечалась в очагах атипической базальноклеточной гиперплазии (4,7%), атипической аденоматозной гиперплазии (5,4%) и тяжелой дисплазии эпителия (10%).

Таким образом, результаты нашего исследования совпадают с данными литературы, согласно которым изменения в работе гена-супрессора р53 возникают на ранних стадиях канцерогенеза (54, 86), при этом, согласно последним исследованиям (Wakamatsu К. и соавт., 1999), в эпителиальных клетках очагов дисрегенераторных изменений определяется накопление преимущественно «дикого» типа р53, что может иметь защитную функцию, а мутации гена р53 могут быть более поздним событием легочного канцерогенеза. Подтверждением этому являются экспериментальные данные Cai D.W. и соавт. (1993) и Takahkshi Т. и соавт. (1992), которые показали, что при активации «дикого» типа р53 происходит замедление роста и развивается апоптоз, что может привести к реверсии злокачественного фенотипа и может являться эффективным механизмом антибластомной резистентности. Обращает на себя внимание наличие экспрессии р53 в очагах атрофии, что также подтверждает выдвинутое предположение о выявлении нами «дикого» типа белка и может свидетельствовать об интенсификации в очагах атрофии апоптоза в ответ на повреждение ДНК.

Экспрессия с-тус и ТОР-Р обнаруживалась при всех видах дисрегенераторных изменений легочного эпителия, при этом наиболее высокая экспрессия отмечалась в очагах аденоматозной гиперплазии на фоне интерстициального фиброза, как правило, на более высоком уровне при появлении признаков клеточной атипии (5,7 балла и 4,2 балла соответственно). Полученные данные демонстрируют участие эпителиальных клеток в развитии фиброза в легком через синтез факторов, стимулирующих коллагеногенез клетками стромы, в то же время, избыточное разрастание соединительной ткани является фоном для дальнейшей опухолевой трансформации эпителиальных клеток, приводя к развитию «рака в рубце», что доказано многими исследованиями (4,7,8,11,13,23).

Уровень экспрессии Кь67 колебался от 1 до 9%. Продукт реакции локализовался в ядрах базальных, бокаловидных клеток, клеток Клара, альвеолоцитов 2-го типа, нейроэн-докринных клеток. Таким образом, судя по экспрессии Кь67 и данных литературы, мы убедились, что в условиях хронического воспаления в легком пролиферируют следующие клетки: слизистые (бокаловидные), базальные, нейроэндокринные, клетки Клара и альвео-лоциты 2-го типа. В очагах бокаловидноклеточной гиперплазии, базальноклеточной гиперплазии, плоскоклеточной метаплазии и в овальных и щелевидных структурах без атипии уровень экспрессии К1−67 составил 1−2%. Экспрессия К1−67 была выше при процессах, сопровождающихся атипией эпителия. Наиболее высокая экспрессия была обнаружена при атипической базальноклеточной гиперплазии, атипических овальных и щелевидных структурах, атипической аденоматозной гиперплазии, дисплазии 1−2 и 3 ст. В очагах атрофии бронхиального эпителия и эпителия овальных и щелевидных структур уровень экспрессии К1−67 превышал 2%.

Экспрессия РСИА обнаруживалась при всех вариантах дисрегенераторных изменений легочного эпителия и была значительно выше, чем К1−67. Это объясняется тем, что, по данным литературы (94,110), РСЫА в отличии от Ш-67 выявляется не только в проли-ферирующих клетках, но и в клетках с репарацией ДНК. Наиболее высокая экспрессия РСМА отмечалась в очагах атипической базальноклеточной гиперплазии (25,6%), атипической аденоматозной гиперплазии (32%) и тяжелой дисплазии (37,5%). В участках атрофии бронхиального эпителия уровень экспрессии РСЫА составил 19,2%, а при атрофии эпителия в овальных и щелевидных структурах — 4,3%.

Таким образом, различия в экспрессии К1−67 и РС^ в очагах дисрегенераторных изменений легочного эпителия свидетельствуют о сохранении способности в этих участках к репарации поврежденной ДНК. При оценке разности между экспрессией РСЫА и Кь67 (дельты), (которая, вероятно, показывает процент клеток, репарирующих ДНК), мы установили, что в очагах с атипией клеток эта дельта выше по сравнению с нормой и очагами бокаловидноклеточной гиперплазии и базальноклеточной гиперплазии без атипии. Высокая репарация может свидетельствовать о повреждении ДНК с увеличением количества мутированных клеток, что вызывает активацию механизмов антибластомной резистентности. Наличие экспрессии К1−67 и РСЫА в очагах атрофии эпителия позволяет предположить, что процесс атрофии является активным процессом, развивающимся при наличии пролиферации клеток, в сочетании, вероятно, с увеличением их гибели путем апоптоза.

Таким образом, наибольшим злокачественным потенциалом, судя по экспрессии онкомаркеров, обладают дисплазия 3 бронхиального эпителия с усилением экспрессии Кь 67, РСЫА и р53, атипическая базальноклеточная гиперплазия с усилением экспрессии Кь 67, РСЫА и Ьс1−2, атипическая аденоматозная гиперплазия с усилением экспрессии К1−67, РСЫА, с-шус и ТОР-(3 и атипические овальные и щелевидные структуры с усилением экспрессии Кь67, РС^ и с-тус, которые могут считаться предраковыми процессами в легких. В этих же процессах нами отмечено усиление репарации ДНК как одного из основных механизмов антибластомной резистентности.

Наличие экспрессии Кл-67 и р53 в очагах атрофии может свидетельствовать об интенсификации в них пролиферации и апоптоза в ответ на повреждение ДНК с преобладанием последнего.

При сравнительном анализе уровней экспрессии КЬ67, РС1МА, Ьс1−2, р53, с-шус и ТОР-р в дисрегенераторных изменениях легочного эпителия при хронических воспалительных заболеваниях и в ткани легкого, окружающей рак, установлено, что уровни экспрессии изученных инкомаркеров при всех видах дисрегенераторных изменений в окружающей рак ткани были выше таковых при хронических воспалительных заболеваниях легких. Таким образом, можно предположить, что легочный эпителий по молекулярно-биологическим особенностям в окружающей рак ткани частично уподобляется первичной опухоли.