Разработка технологии и нормирование качества жидкого и сухого экстрактов травы стальника полевого

Актуальность темы

В настоящее время по ассортиментному составу группа слабительных фитосредств в своем большинстве представлена лекарственными препаратами, содержащими антрагликозиды. Однако, использование последних ограничено по ряду причин, к числу которых относятся быстрое к ним привыкание, развитие кишечной непроходимости, кровотечения, циститы, геморрой в стадии обострения, беременность, а также раздражающее действие на слизистую кишечника. Более того, в некоторых странах гидроксипроизвод-ные антрахинона запрещены и/или не рекомендованы к применению в связи с их канцерогенными свойствами. В этой связи, становится очевидным, что актуальным является поиск новых сырьевых источников, не содержащих производные антрацена, но являющихся основой для создания лекарственных препаратов слабительного действия.

С этой точки зрения особое место занимает корень стальника и получаемая из него настойка, поскольку они не содержат антрагликозиды и лишены указанных выше противопоказаний. Важно отметить, что корень стальника и настойка из него обладают эффективным противогеморроидальным действием. По мнению ряда авторов, наибольший вклад в фармакологическую активность этих лекарственных препаратов стальника вносят две группы полифеноловпроизводные флавона и изофлавона. В народной медицине наряду с корнем используется и трава стальника. Химический состав надземной части растения практически не отличается от корня.

Исходя из этого, представляется целесообразным исследование травы стальника полевого как дополнительного источника для получения слабительных лекарственных средств. К тому же, такой подход очевиден с точки зрения комплексного использования лекарственного растительного сырья и разработки ресурсосберегающих технологий.

Все изложенное выше свидетельствует об актуальности исследований по фармакогностическому изучению травы стальника, разработке технологии фитопрепаратов на ее основе и обоснованию применения в медицинской практике.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась разработка технологии и нормирование качества жидкого и сухого экстрактов травы стальника полевого.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— провести фармакогностическое изучение и стандартизировать траву стальника;

— разработать технологию жидкого экстракта травы стальника с учетом фар-макохимических исследований;

— предложить нормы качества для разработанного жидкого экстракта, изучить условия и сроки его хранения;

— разработать технологию и предложить нормы качества для сухого экстракта травы стальника, изучить условия и сроки его хранения;

— обосновать состав, разработать технологию твердых капсул сухого экстракта травы стальника;

— провести стандартизацию разработанных твердых капсул сухого экстракта травы стальника, изучить условия и сроки их хранения.

Научная новизна. Впервые изучена динамика накопления флавоноидов, изофлавоноидов, фенолкарбоновых кислот по фазам вегетации травы стальника полевого и установлено, что максимальное содержание этих соединений наблюдалось в конце цветения — начале плодоношения. Для селективного количественного определения флавоноидов, изофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве стальника полевого использованы прямая и дифференциальная спектрофотометрия. Установлено, что в траве стальника полевого содержание водорастворимых полисахаридов составляет в среднем 6,6%, пектиновых веществ — 8,3%, гемицеллюлозы, А — 2,1%, гемицеллюлозы В — 3,9%, органических кислот — 2,1%. Из макрои микроэлементов преобладающими являются калий и железо. На основе анатомо-морфологических исследований травы стальника уточнены диагностические признаки сырья. Осуществлены исследования по стандартизации и предложены нормы качества травы стальника полевого.

С учетом проведенных химических и фармакологических исследований обоснован выбор экстрагента для получения жидкого и сухого экстрактов. Выявлена зависимость количественного содержания флавоноидов и изофлаво-ноидов в извлечениях из травы стальника полевого от способа экстракции. Установлено, что максимальное их содержание наблюдалось в первых двух сливах, получаемых вакуум-фильтрационным методом.

Фармакологический скрининг полученных извлечений выявил выраженное слабительное и желчегонное действие, превосходящее действие настойки из корня, а также наличие умеренного обезболивающего свойства. Наибольшая активность характерна для извлечения с использованием 70% спирта этилового.

Разработана технология, обоснованы и нормированы показатели качества жидкого и сухого экстрактов, определены условия и сроки хранения. Предложены состав и технология твердых капсул сухого экстракта травы стальника полевого, проведена их стандартизация, установлены условия и сроки хранения.

Практическая значимость результатов исследования. Полученные уточненные и расширенные сведения о фитохимическом составе травы стальника свидетельствуют о целесообразности ее использования в качестве дополнительного источника новых фитопрепаратов слабительного и желчегонного действия.

Разработанная методика количественной оценки присутствующих совместно в траве стальника и ее фитопрепаратах флавоноидов, изофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот позволяет в одной пробе и раздельно определять содержание этих трех групп БАВ.

Установленные в ходе проведенного морфолого-анатомического исследования характерные диагностические признаки травы стальника позволяют идентифицировать это сырье в измельченном виде.

Установленное слабительное и желчегонное действие наряду с умеренным обезболивающим эффектом для извлечения из травы стальника является обоснованием для разработки на его основе суммарных фитопрепаратов.

Предложенная технология жидкого экстракта (1:2) с использованием вакуум-фильтрационного способа позволяет извлечь из травы стальника около 85% суммы БАВ, что гарантирует 2,5% концентрацию действующих веществ в целевом продукте. Разработанная технология имеет несомненные преимущества по сравнению с используемыми на фармацевтических фабриках ускоренной дробной мацерации и реперколяции, поскольку повышает выход БАВ в среднем на 40% и 37%.

Для переработки травы стальника в условиях крупносерийного фармацевтического производства в более прогрессивный вид суммарного фитопрепарата предложена технология сухого экстракта с 25% содержанием действующих веществ. Разработан состав и технология капсул с сухим экстрактом и предложена методика их стандартизации.

Степень внедрения. По результатам исследований разработано два проекта ФСП: «Трава стальника» (акт внедрения ООО «Кубаньлектравы» от 05.12.06 гзаключение по экспертизе проекта ФСП от КГУ «Центр по контролю качества и сертификации лекарственных средств Краснодарского края» от 01.02.2007 г) — и «Жидкий экстракт стальника» (акт внедрения ЗАО «Роскар-фарм» от 18.12.06 г). Разработанная методика количественного определения фла-воноидов, изофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве стальника внедрена в НИР Северо-Кавказской ЗОС РАСХН (акт внедрения от 20.12.06 г). Методики оценки качества травы стальника полевого и жидкого экстракта апробированы в отделах контроля качества ООО «Кубаньлектравы» (акт от 22.11.06 г) и ЗАО «Роскарфарм» (акт от 11.12.06 г). Технология производства жидкого экстракта травы стальника апробирована в условиях ЗАО «Роскарфарм» (акт апробации 07.12.06 г).

Материалы диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармации ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (акт внедрения от 28.09.06 г).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно — исследовательских работ ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (№ гос. регистрации 0120.500 289).

Основные положения, выносимые на защиту:

— результаты фитохимического, морфолого-анатомического исследования и стандартизации травы стальника полевого;

— данные по выбору оптимального экстрагента для получения фитопрепаратов из травы стальника полевого;

— итоги исследования по разработке технологии жидкого и сухого экстрактов, изучению их химического состава и установлению норм их качества;

— обоснование и результаты исследования по разработке состава, технологии и норм качества твердых капсул сухого экстракта травы стальника полевого.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы доложены на II, IV региональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов Краснодарского края «Медицинская наука и здравоохранение» (г. Анапа, 2004, 2006гг) — на 60-й региональной научной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2005г) — Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фармацевтической науки и практики» (г. Запорожье, 2006г).

По теме диссертации опубликовано 7 научных статей.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 173 страницах машинописного текстасодержит 51 таблицу, иллюстрирована 21 рисунком и изложена в пяти главах.

Список литературы

включает 200 библиографических источников, из них 35 иностранных авторов.

В первой главе (обзор литературы) приведены сведения, отражающие современное состояние исследований в области химии, фармакологии и применения стальника полевого. Дается информация об ассортименте слабительных средств растительного происхождения. Во второй главе охарактеризованы объекты, а также перечислены материалы и методики исследования. В третьей главе представлены результаты фармакогностического изучения травы стальника полевого. Четвертая глава посвящена разработке технологии и стандартизации жидкого экстракта травы стальника полевого. Пятая глава включает исследования по разработке технологии и стандартизации сухого экстракта и его капсу-лированной формы.

Выражаем искреннюю благодарность директору ГУП «Институт аллергии и астмы» профессору P.A. Ханферяну за организацию и проведение фармакологических и биологических исследований (отчет по их результатам приложен к диссертационной работе).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Осуществлен химический анализ полисахаридов травы стальника, позволивший установить наличие водорастворимых полисахаридов до 6,6%, пектиновых веществ — 8,3%, гемицеллюлозы, А — 2,1% и В — 3,9%, дубильных веществ — 5,1%, органических кислот — 2,1%, флавоноидов — 1,0%, изофлавоноидов — 1,9%, фенолкарбоновых кислот — 4,3%, сапонинов -1,8%, макрои микроэлементов — 7,3%.

2. Разработана методика количественного определения изофлавоноидов, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве стальника полевого с использованием прямой и дифференциальной спектрофотометрии. С помощью этой методики изучена динамика накопления фенольных соединений и установлено, что их максимальное содержание соответствует фазе — конец цветения — начало плодоношения. На этой основе определены сроки сбора сырья.

3. На основании морфолого-анатомического исследования листьев и их черешков, цветков, стеблей травы стальника выявлены характерные признаки, позволяющие осуществлять диагностику сырья (извилистые клетки эпидермиса, наличие на всех частях растения многоклеточных простых волосков и многоклеточных железистых волосков, анизоцитный и аномоцитный тип устьичного аппарата), а также определены числовые показатели: содержание изофлавоноидов не менее 1,8%, флавоноидов не менее 0,9% и фенолкарбоновых кислот не менее 4,0%.

4. Установлен оптимальный экстрагент — 70% спирт этиловый для получения экстракционных препаратов из травы стальника полевого. Экстракция биологически активных веществ данным экстрагентом с использованием вакуум — фильтрационного метода обеспечивает максимальный переход изофлавоноидов и флавоноидов из сырья в первые два слива.

5. Разработана технология жидкого экстракта (1:2) с использованием вакуум — фильтрационного способа, позволяющая извлечь из травы стальника около 85% суммы биологически активных веществ, что значительно эффективнее по сравнению с используемыми методами на фармацевтических фабриках — ускоренной дробной мацерации или реперколяции.

6. Предложена технология сухого экстракта травы стальника и проведено нормирование его качества с учетом установленной общей суммы действующих веществ — изофлавоноидов, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в пределах 25%, органических кислот- 12%, дубильных веществ-17%, тритерпеновых сапонинов — 6%, макро — и микроэлементов — 8%.

7. Разработан состав, технология и нормы качества твердых капсул сухого экстракта из травы стальника полевого. Содержание флавоноидов в них должно быть не менее 0,015 г, изофлавоноидов не менее 0,034 г, фенолкарбоновых кислот не менее 0,068 г.

8. Фармакологическим скринингом доказано слабительное, желчегонное и обезболивающее действие экстрактов травы стальника полевого, что создает предпосылки для ее использования в качестве дополнительного сырьевого источника лекарственных средств.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ.

Анализ научных данных по исследованию стальника полевого показал, что основными действующими веществами этого растения являются изофлавоноиды, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты. Наряду с этим было выявлено, что качественный их состав достаточно и подробно изучен, чего нельзя сказать о количественном содержании и фазе их максимального накопления в траве стальника. Кроме того, не были исследованы присутствующие в траве стальника полевого полигликаны, органические кислоты, сапонины. Также не обнаружено полноценных данных о морфолого — анатомическом строении надземной части этого растения. При изучении ассортиментного состава слабительных средств установлено, что данная группа фитосредств представлена в подавляющем большинстве антрагликозидсодержащими препаратами. Однако, ограничивают использование последних быстрое к ним привыкание и ряд противопоказаний: кишечная непроходимость, геморрой в стадии обострения, беременность, а также серьезные побочные эффекты, в числе которых — раздражающее действие на слизистую кишечника, иногда приводящее к язвенному колиту, проктиту, тяжелым поражениям печени. Особое место в группе всех слабительных фитосредств занимает корень стальника и получаемая из него настойка, поскольку они не содержат антрагликозиды, лишены указанных выше противопоказаний и представляющих собой угрозу для здоровья побочных эффектов. Кроме того, они отличаются от аналогов по группе применением при геморрое и в этом качестве пока не имеют альтернативы. Вместе с тем, издревле в народной медицине наряду с корнем используется трава стальника. Состав ее биологически активных веществ (БАВ) ни чем не уступает, а в чем — то даже превосходит корень, в том числе — по составу фенольных соединений. Исходя из этого, представляется целесообразным исследование травы стальника полевого как источника слабительных лекарственных средств и очевидного аналога корня. Все изложенное выше позволяет считать актуальным исследование, посвященное фармакогностическому изучению травы стальника, разработке технологии ее фитопрепаратов, нормированию их качества и выявлению перспектив применения в медицинской практике.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ.

ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Объекты и материалы исследований.

Объектом исследования явилась трава стальника полевого, произрастающая в Краснодарском крае (ст. Васюринская, ст. Динская, пос. Чибий), Ставропольском крае (г. Пятигорск), Ростовской области (г. Ростов). Сырье заготавливалось в июне-августе 2002 — 2006 гг. в период бутонизации, цветения, цветения и плодоношения надземной части. Для отдельных сравнительных исследований использовался корень стальника полевого промышленной заготовки (ГФ СССР XI изд., стр.350), а также собранный в указанных выше местах произрастания осенью — с конца цветения до полного отмирания надземных частей и приведенный в стандартное состояние.

В экспериментальной работе использовали весы аналитические лабораторные 2 класса по ГОСТ 24 108–80 с пределом взвешивания 200,0 гтермостат по ГОСТ 25 336–82- сушильный шкаф, роторный испаритель ИР-1М2, валки лабораторные типа ПД 320−160/160, фильтрационные установки. Электронные спектры поглощения измеряли на спектрофотометре СФ-56 в кварцевых кюветах с толщиной рабочего слоя 1 см, атомно-адсорбционном-эмиссионном спектрофотометреэлектрофореграммы снимали на приборе «Капель 105», минерализацию проводили в приборе СВЧ-минерализатор Минотавр -1, приготовленные микропрепараты изучали с помощью микроскопа серии LW 200 Т.

В данной работе использовали лекарственные и вспомогательные вещества, отвечающие требованиями нормативной документации (ФС, ГОСТ, ТУ).

2.2 Методы и методики исследований.

2.2.1 Определение влажности сырья проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 1, стр. 285.

Определение экстрактивных веществ проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 1, стр. 295.

Определение общей золы и золы, нерастворимой в хлористоводородной кислоте проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 2, стр. 24.

Определение дубильных веществ проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 1, стр. 286.

Определение органических кислот проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 2, стр. 296.

Определение изофлавоноидов проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 2, стр. 350.

Микроскопический анализ лекарственного растительного сырья проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 1, стр. 277.

Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ГФ СССР XI изд. (далее по тексту ГФ XI изд.), вып. 1, стр. 199.

2.2.2 Определение сапонинов.

Методика определения тритерпеноидов заключалась в следующем [124, 135,34,40]:

Около 1,0 г (точная навеска) измельченного до 1,0 мм сырья экстрагировали 70% спиртом в колбе с обратным холодильником на кипящей, водяной бане порциями по 20 мл и 2 раза по 15 мл в течение 1 часа в каждом случае. Полученные извлечения фильтровали в круглодонную колбу, фильтрат упаривали под вакуумом до 1/5 первоначального объема (10 мл). Концентрат обезжиривали в делительной воронке 75 мл хлороформа, используя для этой цели 5 ступеней экстракции. Водный слой переносили в ту же круглодонную колбу, аккуратно добавляли смесь, состоящую из 3 мл концентрированной серной кислоты и 12 мл ледяной уксусной кислоты. Содержимое колбы кипятили с обратным холодильником в течение 1,5 часов. После этого, остывший до комнатной температуры гидролизат количественно переносили в ранее использованную делительную воронку, для чего колбу ополаскивали 2 объемами воды по 10 мл. Олеаноловую кислоту из содержимого делительной воронки извлекали хлороформом четырехкратно по 10 мл, ополаскивая им круглодонную колбу. Гидрофильный слой в воронке отбрасывали, а хлороформный промывали водой до нейтрального значения рН (пятикратно по 25 мл). Извлечение фильтровали через плотный бумажный фильтр, предварительно смоченный хлороформом, в мерную колбу вместимостью 50 мл. Делительную воронку ополаскивали 5 мл хлороформа и также фильтровали в колбу. Содержимое в колбе доводили до метки тем же растворителем. Полученный раствор в объеме 1 мл вносили в колбу вместимостью 25 мл, отгоняли под вакуумом растворитель и добавляли 10 мл концентрированной серной кислоты. Раствор олеаноловой кислоты в серной кислоте термостатировали при 70 °C в течение 1 часа. Параллельно проводили контрольный опыт. После охлаждения до комнатной температуры определяли оптическую плотность испытуемого раствора в сравнении с концентрированной серной кислотой на спектрофотометре при длине волны 315 нм (максимум поглощения, отмеченный на спектре испытуемого раствора и олеаноловой кислоты, наблюдался при этой длине волны) в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Содержание олеаноловой кислоты в траве стальника полевого рассчитывали по формуле (1):

Р-У1-У2−1М (!).

311-У3-т-(Ю0-\0 где О —значение оптической плотности исследуемого раствора V] — общий объем хлороформного извлечения, мл Уг — объем концентрированной серной кислоты, мл У3 — объем хлороформного извлечения, взятый на анализ, мл 311 — удельный показатель поглощения олеаноловой кислоты в концентрированной серной кислоте ш — навеска сырья, г.

— потеря в массе при высушивании сырья, %.

2.2.3 Определение полисахаридов.

Сумму водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ и гемицел-люлозу, А и В из травы стальника выделяли по приведенной схеме в соответствии с рисунком 1.

Хлороформное извлечение.

Спиртовое извлечение.

Объединенное водное извлечение.

Упаривание, осаждение 96% этанолом, фильтрование.

Осадок.

1 г.

Промывка 96% этанолом, сушка г.

Сумма водорастворимых полисахаридов.

Прибавление ледяной уксус ной кислоты.

Осаждение 96% этанолом, промывка осадка 96% этанолом, сушка.

Гемицеллю лоза В.

Осадок.

Исчерпывающая экстракция хлороформом, сушка.

Исчерпывающая экстракция 70% спиртом этиловым, сушка.

Экстракция горячей водой.

Экстракция смесью щавелевой кислоты и окса-лата аммония ние у Упаривание, осаждение 96% этанолом, г фильтрование.

Промывка 96% этанолом, сушка.

1 г.

Рисунок 1- Схема выделения фракций полисахаридов из травы стальника.

Измельченное сырье исчерпывающе экстрагировали сначала хлороформом для обезжиривания, а затем 70% спиртом этиловым с целью удаления пигментных, фенольных и легкоокисляющихся веществ. Шрот высушивали до удаления запаха растворителей и подвергали трехкратной экстракции водой при температуре 90−95°С в течение 1 часа при постоянном перемешивании (соотношение сырья и экстрагента при первой и второй экстракции 1:20, при третьей — 1:10). Объединенное и отфильтрованное извлечение упаривали под вакуумом с помощью роторного испарителя до 1/5 первоначального объема при температуре 45−50°С [138, 139].

Сумму водорастворимых полисахаридов получали осаждением путем добавления четырехкратного по отношению к объему упаренного извлечения 96% спирта этиловогоосадок отфильтровывали, многократно промывали спиртом этиловым, затем высушивали при комнатной температуре и взвешивали.

Сумму пектиновых веществ выделяли из шрота сырья. После выделения водорастворимых полисахаридов трехкратно экстрагировали смесью 0,5% растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония (1:1) при температуре 90 °C в течение 3-х часов (соотношение шрота и экстрагента при первом контакте 1:20, при втором и третьем 1:10). Полученное извлечение концентрировали до 1/5 первоначального объема при температуре 45−50°С с помощью роторного испарителяк сгущенному извлечению прибавляли трехкратное количество 96% этилового спирта, осадок отделяли фильтрованием, промывали спиртом этиловым, высушивали при комнатной температуре и взвешивали.

Далее проводили выделение гемицеллюлозы, А и В. Остаток сырья после выделения пектиновых веществ экстрагировали пятикратным объемом 10% раствора натрия гидроксида при температуре 20 °C, перемешивая на магнитной мешалке в течение 12 часов, добавляли к щелочному фильтрату двукратный объем (по отношению к сырью) ледяной уксусной кислоты для осаждения гемицеллюлозы А. В фильтрате (после отделения гемицеллюлозы А) двукратным объемом 96% спирта этилового осаждали гемицеллюлозу В. Раствор декантировали, осадок несколько раз промывали порциями 96% спирта этилового, высушивали в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы и взвешивали.

Для определения мономерного состава полисахаридных комплексов проводили их гидролиз серной кислотой [24]. Навески полисахаридных комплексов (0,05 г) помещали в ампулы емкостью 5−10 мл, прибавляли 2,5 мл раствора серной кислоты (1 моль/л), запаивали ампулы и проводили гидролиз при температуре 100−105°С в течение 6 часов для водорастворимых полисахаридов, в течение 24 часов для пектиновых веществ, 48 часов для гемицеллюлозы, А и В. Содержимое ампул переносили в стаканчики, промывали ампулы 5 мл воды, нейтрализовали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной реакции. Растворы фильтровали, фильтры промывали водой до объема фильтратов 10 мл. К полученным растворам прибавляли 3 объема 96% этилового спирта, тщательно перемешивали и образовавшиеся осадки отфильтровывали через 1−2 часа. Фильтраты упаривали на кипящей водянойбане до получения объема около 0,5 мл (раствор А). Осадки бариевых солей уроновых кислот снимали с фильтров, растворяли в 2,5 мл воды, прибавляли катионит КУ-2 (1-Г) до рН 3−4 по универсальному индикатору. Растворы фильтровали, упаривали до получения около 0,5 мл раствора (раствор Б).

Растворы А, содержащие нейтральные моносахариды, хроматогра-фировали нисходящим способом в системе: н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) в течение 17−18 часов с образцами нейтральных моносахаридов, а растворы Б, содержащие кислые моносахариды — восходящим способом в системе: этилацетат-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (18:3:1:4) в течение 5−6 часов с образцами гексауроновых кислот на бумаге Хроматограммы высушивали на воздухе 1 час, обрабатывали раствором анилингидрофталата и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100−105°С. Через 10−15 минут наблюдали наличие красноватых и красновато-коричневых пятен. По величине и интенсивности окраски проводили сравнительную оценку содержания моносахаров в исследуемых фракциях.

Для количественного определения восстанавливающих Сахаров в составе полисахаридных фракций был использован метод, основанный на их реакции с пикриновой кислотой в щелочной среде [103].

0,05 г (точная навеска) полисахаридного комплекса помещали в ампулу, прибавляли 2,5 мл разведенной соляной кислоты, ампулу запаивали и нагревали при температуре 100±-5°С в течение 2 часов, по окончании гидролиза содержимое ампулы переносили в стакан и нейтрализовали по бумаге Конго: сначала 30% раствором гидроксида натрия, затем раствором разведенной соляной кислоты, и наконец 10% раствором гидроксида натрия.

Раствор фильтровали через плотный фильтр, переносили количественно в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили объем раствора водой до метки (раствор А). В колбу вместимостью 50 мл помещали 1,0 мл 1% раствора пикриновой кислоты, 3,0 мл 20% раствора карбоната натрия и 1 мл раствора А.

Колбу с содержимым погружали в кипящую водяную баню на 10 минут, затем охлаждали до комнатной температуры. Содержимое количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили водой до метки. Измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 460 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали смесь, состоящую из 1,0 мл 1% раствора пикриновой кислоты, 3,0 мл 20% раствора карбоната натрия и 1,0 мл воды, которую нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут и доводили объем раствора водой до 25 мл. Параллельно проводили определение оптической плотности 1 мл раствора стандартного образца глюкозы.

Содержание восстанавливающих Сахаров в полисахаридном комплексе в % в пересчете на глюкозу вычисляли по формуле (2):

Д-0,0056−10−100.

X ——(—).

П0-тгде Э] - оптическая плотность испытуемого раствора.

— оптическая плотность стандартного раствора глюкозы 0,0056 -концентрация глюкозы в 1 мл раствора стандартного образца, г ш — навеска полисахарида, г.

2.2.4 Определение фенольных соединений.

Для предварительного обнаружения фенольных соединений в траве стальника полевого использовали следующие качественные реакции: цианиди-новю пробуреакцию реакция со щелочьюреакция с алюминия хлоридомреакция с железа (III) хлоридомреакция Вильсонареакция с ванилином в кислоте хлороводородной концентрированной.

Пробоподготовку сырья проводили по следующей методике: 3−5 г измельченной травы стальника заливали 30−50 мл 70% спирта этилового в колбе с обратным холодильником и проводили экстракцию на водяной бане в течение 20−30 мин. Извлечение охлаждали, фильтровали через фильтровальную бумагу. Полученный фильтрат наносили на колонку диаметром 1 см, заполненную 1,0 г полиамидного сорбента, промывали 50 мл воды и элюировали фенольные соединения с колонки 70% сиртом этиловым, отбирая фракцию, окрашенную в желтый цвет. Полученный элюат упаривали до Уг объема и использовали для проведения выше указанный качественный реакций [103].

2.2.5 Определение макрои микроэлементов.

Навеску предварительно истолченного исследуемого материала массой 250 мг, помещали в кварцевую колбу, заливали 5 мл концентрированной азотной кислоты, устанавливали на умеренно нагретую плитку, помешивали, не допуская интенсивного вскипания. Для предотвращения разбрызгивания минерали-зационной массы в качестве пробки использовали каплеуловитель от колб Къельдаля. При появлении коричневой окраски минерализата нагревание прекращали, добавляли 1−3 мл азотной кислоты и продолжали нагревание при боле низкой температуре. Минерализация считается законченной, когда жидкость становится прозрачной или с легким желтоватым оттенком. Выпариванием минерализата доводили объем до 0,1−0,2 мл. При этом наблюдали интенсивное образование тяжелых белых паров хлорной кислоты. Остатки минеральных солей смывали в мерные колбы водой очищенной. Объем жидкости доводили до 15 мл [131].

Приготовление стандартных растворов металлов, калибровка: стандартные растворы ионов металлов готовили из ГСО путем его разбавления в воде очищенной или в равной смеси 10% растворов хлорной и азотной кислот. Концентрация ГСО — 1000 мг/л. Максимальная концентрация стандарта — 500 мг/л, минимальная — 0,24 мг/л. Концентрации стандартных растворов приведены в таблице 2.