Моделирование конформационного равновесия и сольватации при связывании органических соединений с биологическими мишенями

Основной парадигмой современного дизайна лекарственных средств является направленное воздействие на определённую биологическую мишень в организме человека. Поскольку в настоящий момент расшифрованы трёхмерные структуры большого количества мишеней, крайне актуальной является проблема моделирования связывания новых лекарственных кандидатов с белковыми молекулами известной структуры. На сегодняшний день наиболее точным методом расчёта прочности связывания лигандов с терапевтическими мишенями является метод возмущения свободной энергии (ВСЭ), основанный на молекулярно-механическом описании полноатомной системы белок-лиганд с явным учётом молекул растворителя. Данный подход позволяет учесть ряд факторов, игнорируемых полуэмпирическими методами, но зачастую определяющих различие в связывании близких по структуре соединений (например, подвижность белка, конформационное равновесие лиганда и сольватацию системы), и таким образом является наиболее эффективным вычислительным методом для лидерной оптимизации лекарственных кандидатов.

Метод ВСЭ имеет строгое теоретическое обоснование, и при корректном проведении моделирования позволяет получить точное значение изменения свободной энергии при связывании лиганда с белком. Тем не менее, поскольку входные данные для расчётов ВСЭ формируются с помощью молекулярной динамики, итоговая точность определяется точностью молекулярно-динамических вычислений, которая в свою очередь зависит от корректности молекулярно-механического силового поля и качества сэмплирования системы. Предметом исследования настоящей работы являлись подходы к улучшению сэмплирования при использовании стандартных параметров силового поля.

Проблема недостаточного сэмплирования чаще всего возникает при моделировании комплекса органического вещества с терапевтической мишенью. Важную роль в динамике этой системы играют молекулы воды, контактирующие с атомами белка и лиганда, так как их подвижность зачастую оказывается существенно ограниченной из-за образования водородных связей либо из-за стерических затруднений. В то же время, недостаточное сэмплирование этих мостиковых молекул является критичным для итоговой точности расчётов, и в некоторых случаях может приводить к ошибкам порядка нескольких ккал/моль, что является неприемлемым при оптимизации лекарственных кандидатов. Для решения данной проблемы было предложено большое количество различных подходов, цель которых главным образом сводилась к определению прочности связывания отдельных мостиковых молекул воды. В то же время, ни в одной из существующих работ не был проведён систематический анализ полноты сэмплирования молекул воды в комплексе. Данный анализ, с одной стороны, позволил бы оценить корректность расчётов свободной энергии и выявить альтернативные варианты расположения мостиковых молекул воды, а с другой помог бы определить основные сайты сольватации и предложить направления для дальнейших модификаций лигандов. Таким образом, разработка методологии оценки временной стабильности сольватации комплекса белок-лиганд при расчётах методом ВСЭ является актуальной и не решённой на сегодняшний день проблемой.

Недостаточность сэмплирования может возникать и в ходе молекулярной динамики свободного лиганда в воде при наличии у него медленно переходящих друг в друга конформаций. Как и в случае с сэмплированием воды, пренебрежение конформацинонным равновесием лиганда может вносить в итоговую энергию связывания недопустимую ошибку порядка нескольких ккал/моль. Решению этой, а также схожей проблемы заторможенных конформаций белка посвящено большое количество теоретических работ, основанных на применении методов двухтопологического ВСЭ, потенциала средней силы и методов общего «ускорения» сэмплирования системы. Тем не менее, в большинстве случаев предложенные методы отличались низким быстродействием и сложностью практической реализации, хотя и позволяли существенно уменьшить ошибку расчётов свободной энергии связывания. Создание универсального и эффективного способа анализа конформационного равновесия для заторможенных степеней свободы лиганда и белка позволило бы не только повысить точность метода ВСЭ, но и выявить дополнительные направления модификации структуры лиганда для повышения заселённости связывающегося конформера.

Настоящее исследование направлено на решение данных задач направленного синтеза и посвящено разработке способов явного расчёта конформационного равновесия и сольватации комплекса белок-лиганд при моделировании связывания лигандов с терапевтическими мишенями методом ВСЭ. Эффективность и применимость предложенных подходов показана на примере направленного синтеза ингибиторов поли (АДФ-рибозо) полимеразы и 8ук-киназы.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в создании методологии учёта вкладов конформационного равновесия и сольватации в свободную энергию образования комплекса белок-лиганд для направленного дизайна и синтеза новых биологически активных соединений. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание эффективного метода расчёта конформационного равновесия 6 органических соединений с явным учётом растворителя;

2. Разработка метода выявления и учёта (в свободной энергии связывания) различных сольватационных состояний комплекса белок-лиганд, находящихся в динамическом равновесии;

3. Направленный дизайн новых ингибиторов 8ук-киназы и поли (АДФ-рибоза)-полимеразы (РАЯР) с использованием разработанных методов;

4. Синтез новых ингибиторов Бук-киназы и сопоставление экспериментальных данных по активности с результатами моделирования.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1.Методы расчёта свободной энергии связывания органических соединений с терапевтическими мишенями.

Метод возмущения свободной энергии (ВСЭ) — метод статистической механики, позволяющий рассчитывать свободную энергию практически любых процессов на основании результатов молекулярно-динамических расчётов. На практике метод ВСЭ успешно применялся для дизайна ингибиторов ВИЧ-1 обратной транскриптазы [1- 2], секретируемой фосфолипазы А2 [3] и р38а MAP киназы [4], а также теоретических исследований ингибиторов катехол-О-метилтрансферазы inhibitors [5], нейраминидазы вируса гриппа [6], глюкозидазы [7] и т. д. Метод ВСЭ может быть реализован в классическом варианте, с использованием соотношения переходе Беннета либо в виде термодинамического интегрирования. Теоретические основы данных методов изложены ниже.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Впервые предложен способ расчёта энергии заторможенных конформационных переходов в органических молекулах, основанный на использовании двугранного угла в качестве реакционной координаты в методе ВСЭметод позволяет с высокой точностью (~1 кДж/моль) рассчитывать конформационное равновесие биологически активных соединений с явным учётом растворителя;

2. Исследована заселённость конформеров впервые синтезированных биологически активных соединений, производных 2,4-диариламиноазинового ряда — ингибиторов Бук-киназыпоказано, что в ряду изученных соединений заселённость конформеров отличается в 10−50 раз, что соответствует вкладу в свободную энергию связывания 4−6 кДж/моль;

3. Разработан метод учёта сольватации комплекса белок-лиганд, основанный на анализе временной корреляции карт плотности растворителя, полученных из молекулярно-динамических траекторий, который позволяет выявлять альтернативные сольватационные состояния комплекса белок-лиганд, не идентифицируемые при помощи стандартных критериев (временная зависимость координат атомов белка или энергии системы);

4. Показано качественное изменение сольватации комплекса РАЯР-лиганд при переходе от Я=-Н, -СН2С1, -СН2ОН, -СН21ГН2 к Я=-СН2Ы3 в ряду синтезированных производных 3,5,6,7-тетрагидро-4//-циклопента[4,5]тиено[2,3-?/]пиримидин-4-онов с помощью разработанного метода анализа корреляции карт плотности растворителяв случае производного Я=-СН2Ыз было обнаружено наличие альтернативных сольватационных состояний комплекса, отличие в свободной энергии которых составляло 4 кДж/моль;

5. Проведён направленный синтез четырёх новых производных 2,4-диаминотриазина, ингибирующая активность которых в отношении Бук-киназы хорошо согласуется с разработанной моделью, включающей учёт конформационного равновесия лиганда и сольватацию комплекса белок-лиганд (отличие рассчитанной свободной энергии связывания от экспериментальной- 2 кДж/моль) — показана биологическая активность соединения МТ-030 на клеточных линиях неходжкинской лимфомы;

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Методы молекулярного моделирования биологической активности органических соединений приобрели огромное значение на всех стадиях разработки лекарств, начиная от выбора терапевтической мишени и заканчивая финальной оптимизацией лекарственных кандидатов. Если на стадии скрининга большой библиотеки разнообразных соединений основным критерием является скорость расчётов, то при выборе направлений дальнейшей модификации одного-двух активных соединений с целью повышения прочности связывания с мишенью на первое место уже встаёт точность моделирования.

Наиболее точным методом расчёта связывания лигандов с терапевтическими мишенями, используемым в настоящее время, является метод ВСЭ, основанный на молекулярно-механическом моделировании полноатомной системы белок-лиганд-растворитель. Длина траекторий, рассчитываемых в данном методе, лимитирована текущим уровнем развития вычислительной техники, и составляет несколько наносекунд (для чего требуется порядка 10 000 процессоро-часов). При расчёте свободной энергии для уравновешенной системы подобное время расчётов является достаточным, однако для систем, имеющих заторможенные степени свободы, недостаточная длина траектории может приводить к неприемлемым ошибкам. Таким образом, важной задачей является создание не только методов увеличения степени сэмплирования системы, но и подходов к оценке адекватности выбранной длины траектории для расчётов ВСЭ. Необходимость решения этих задач в настоящей работе была продиктована выбором органических лигандов и соответствующих терапевтических мишеней. Так, для исследованных ингибиторов 8ук-киназы 2,4-диариламиноазинового ряда изначально предполагалось наличие заторможенных конформационных переходов в воде, а высокая степень сольватированности и наличие мостиковых молекул воды в комплексе РАЯР с 3,5,6,7-тетрагидро-4#-циклопента[4,5]тиено[2,3-?/]пиримидин-4-оном (РАЫРН) косвенно указывало на возможные кинетические сложности обмена связанных молекул воды с раствором.

Выбор лигандов и мишеней был обусловлен их практической значимостью. Так, ингибитор Бук-киназы фостаматиниб (пролекарственная форма Я406) в настоящее время проходит клинические испытания в терапии ревматоидного артрита [100- 101] и неходжкинской лимфомы [102], а ингибиторы РАЯР перспективны для терапии рака [103- 104- 105] и инфаркта миокарда [106].

Изначальной мотивацией для разработки нового метода моделирования конформационного равновесия послужило отсутствие возможности расчёта энергий конформационного перехода в доступных программах. Однако дальнейший анализ литературных данных показал, что существующие в настоящее время алгоритмы решения данной задачи имеют ряд недостатков: узкую область применения, низкое быстродействие, континуальный учёт растворителя. В ходе выполнения диссертационной работы был создан новый способ расчёта свободной энергии конформационных переходов, основанный на методе ВСЭ с явным учётом растворителя, лишённый всех указанных недостатков. Гибкость разработанного метода позволила посредством вспомогательного обратимого вращения крайних циклов добиться осуществления стерически затруднённых заторможенных конформационных переходов для ингибиторов Syk-киназы 2,4-диариламиноазинового ряда.

Аналогичная мотивация возникла и при разработке методов анализа сольватации комплекса белок-лиганд. Несмотря на то, что в целом этой проблеме уделяется большое внимание, в настоящее время отсутствуют какие-либо методы анализа стабильности молекул воды в ходе молекулярной динамики, позволяющие принять решение об адекватности выбранной длины траектории или необходимости её увеличения. Применение предложенного метода для комплексов PARP с ингибиторамипроизводными 3,5,6,7-тетрагидро-4#-циклопента[4,5]тиено[2,3-?/]пиримидин-4-онапоказало его способность выявлять изменения в сольватационном состоянии комплекса белок-лиганд. Проведённый детальный анализ сольватации комплекса PARP с азидным производным PARPN3 привёл к разработке метода точного расчёта прочности связывания лигандов в случае наличия у комплекса белок-лиганд альтернативных сольватационных состояний.

Какими бы точными ни были методы предсказания свободной энергии связывания белков с лигандами, стадия генерирования структур новых ингибиторов проводится, как правило, вручную исходя из структуры комплекса белок-лиганд. Предложенные на основе структурных соображений (и подтверждённые методом молекулярного докинга) модификации соединения МТ-030 (МТ-ОЗО-ОМе, МТ-030-С1, MT-030-Me и МТ-ОЗО-ОН) должны были привести к увеличению прочности связывания с Syk-киназой. Тем не менее, дальнейший расчёт методом ВСЭ с учётом конформационной фокусировки показал, что, к сожалению, все предложенные направления изменения структуры МТ-030 должны привести к снижению ингибирующей активности. Синтез и исследование ингибирующей активности in vitro на ферментном препарате показали, что экспериментальные данные хорошо согласуются с результатами расчётов методом ВСЭ, но не методом.

120 молекулярного докинга. Таким образом, еели проблема точного расчёт прочности связываний ингибиторов с лигандами является практически решённой, проблема выявления направлений модификации структуры известных ингибиторов для повышения их сродства к мишени требует дальнейшей автоматизации.

Для наиболее активного соединения серии, МТ-030, дополнительно была изучена биологическая активность в клеточных моделях заболеваний, ассоциированных с ингибированием 8ук-киназы, — ревматоидного артрита и неходжкинской лимфомы. Эффективность МТ-030 в этих моделях не уступала эффективности 11 406, находящегося в настоящее время в стадии клинических испытаний, что говорит о большом терапевтическом потенциале МТ-030.