Молекулярно-генетическое исследование наследственной компоненты подверженности к инсульту у населения г. Томска

Актуальность. Цереброваскулярная патология занимает второе место среди главных причин смертности и является ведущей причиной инвалидизации населения в экономически развитых странах, что определяет её как одну из важнейших медицинских и социальных проблем [Беленков, и др., 2003]. Смертность от цереброваскулярных заболеваний в России — одна из самых высоких в мире: в 2000 г. стандартизированный показатель смертности составил 319,8 на 100 000 населения [Верещагин и др., 2001]. Наряду с высокой смертностью, социально значимыми являются и последствия инсультов: развитие стойкой инвалидности с потерей трудоспособности, высокий риск повторных нарушений мозгового кровообращения, сосудистой деменции [Виленский, 2002].

В течение последних 20 лет в литературе обсуждается более 100 гуморальных факторов, патологических процессов, наследственно-конституциональных аномалий и социально-экономических параметров, относимых к факторам риска. К наиболее значимым факторам риска относят возраст, артериальную гипертонию, атеросклероз, нарушения ритма сердца, сахарный диабет, курение, алкоголизм [Виленский, 2002]. Россия по числу случаев инсультов значительно опережает такие страны, как Китай, Венгрия, Португалия и др. Инсульты в России у больных с артериальной гипертензией возникают в 4 раза чаще, чем в США и других развитых странах. Ежегодно только острые нарушения мозгового кровообращения диагностируются у 1,7−5,4 человек на 1000 населения всех возрастных групп. При этом статистика показывает, что четверть всех больных с острой недостаточностью мозгового кровообращения умирают в течение первых суток [Скворцова, 2001].

Исследования отечественных и зарубежных учёных позволили сделать вывод о том, что семейная предрасположенность является фактором риска развития инсульта [Давиденкова и др., 1979; Brass et al., 1992; Скворцова и др., 2003]. Было показано, что в семьях больных с атеротромботическим инсультом достоверно чаще, чем в контрольной группе, встречаются такие факторы риска как артериальная гипертония, гипертрофия миокарда, гиперлипидемия, гипергликемия и, как следствие, ишемические инсульты и транзиторные ишемические атаки (ТИА).

Крупномасштабные исследования, включавшие тысячи человек, продемонстрировали, что отягощённость одновременно по отцовской и материнской линиям намного больше увеличивает риск развития инсульта, чем наследование по одной из них. По данным популяционного исследования в Финляндии, положительный семейный анамнез увеличивает риск развития инсульта, как у мужчин, так и у женщин, причём связь между семейным и индивидуальным риском гораздо выше для возрастной когорты от 25−49 лет [Jousilahti, Rastenyte et al., 1997]. J. Diaz и соавт. (1986) пришли к выводу, что у сибсов пациентов с ишемическими инсультами или ТИА регистрируется гораздо больше факторов риска развития цереброваскулярных заболеваний, чем у сибсов из контрольной группы. Важное значение в уточнении роли генетических факторов в развитии той или иной патологии имеет метод близнецового анализа. Так, L. М. Bras и соавт. (1992) установили, что конкордантность по риску развития ишемического инсульта у монозиготных близнецов составила 17,7%, а у дизиготных — 3,6%.

Ряд исследователей установили зависимость риска развития инсульта от линии наследования. L. Welin и соавт. (1987) показали, что наследование инсульта по материнской линии является фактором риска, не зависимым от артериальной гипертензии, ожирения и уровня фибриногена в крови.

В других наблюдениях не прослеживалась связь между индивидуальным и семейным риском развития инсульта [Boysen et al., 1998; Herman et al., 1983]. Такие неоднозначные результаты и выводы объясняются использованием разных методов исследования, проводимых в различных популяциях, а также некоторыми трудностями при сборе семейного анамнеза, особенно у лиц старшего поколения. Различия могут возникать из-за разных подходов к формированию выборок, а также по причине неоднородности самого инсульта, который по сути является не заболеванием, а синдромом с широким разнообразием фенотипических проявлений, факторов риска и генетических систем, задействованных в его развитии [Скворцова и др., 2003].

Одним из подходов в изучении генетической предрасположенности к возникновению инсульта является использование полиморфных маркёров различных генов для анализа сцепления и/или ассоциаций с болезнями или их клиническими проявлениями. Гены, потенциально «задействованные» в развитии ишемического инсульта, относятся к разным генетическим системам: гены ренин-ангиотензиновой системы (РАС), системы гемостаза, гены синтазы окиси азота (vVOS-гены), гены, кодирующие метаболизм гомоцистеина и липидов, гены программированной клеточной гибели [Скворцова и др., 2003].

Для поиска генетических факторов риска развития инсульта, были проанализированы литературные данные и выбраны гены-кандидаты, определенные аллельные варианты которых могли бы вносить вклад в развитие заболевания. Выбор генов-кандидатов проводился на основании анализа метаболических нарушений, характерных для данной патологии. Известно, что высокая активность тромбообразования и высокий уровень плазменного фибриногена ассоциирован с повышенным риском развития инфаркта миокарда [Redondo et al., 1999], коронарного атеросклероза и инсульта [Margaglione et al., 1999]. Пятый фактор свертываемости крови в комплексе с активированным протеином С, который является антикоагулянтом, участвует в осуществлении баланса прокоагуляционных и антикоагуляционных механизмов. Мутации в гене пятого фактора.

FF (G1691A) приводят к резистентности фактора свертываемости к активированному протеину С (АПС-резистентность), нарушению баланса между факторами свертывания крови и антикоагулянтами, тем самым определяя генетическую предрасположенность к тромбообразованию. По данным литературы известно, что мутация Лейдена (Gl691 А) ассоциирована с развитием различных патологических состояний таких как ишемический инсульт [Margaglione et al. 1999; Casas et al. 2004], венозные тромбозы [Kosch, 2002], инфаркт миокарда [Middendorf et al. 2004]. Также установлено, что мутация гена протромбина FII (G20210) часто встречается вместе с лейденской мутацией и данное сочетание повышает риск развития тромбозов и инфарктов [Doggen, et al. 1998]. Показано, что PLA2 полиморфизм гена GPIIIa является фактором риска поражения крупных сосудов при инсульте у мужчин [Slowik et al. 2004], может вносить вклад в развитие инфаркта миокарда и коронарного атеросклероза и ассоциируется с развитием инсульта у молодых женщин европеоидной расы, а аллель PLA1 ассоциирован со смертельным исходом инсульта [Carter et al., 1999; Wangner et al., 1999; Feng et al., 1999].

В последнее время большое число публикаций посвящено изучению функциональной роли молекулы оксида азота (NO) в организме человека [Снайдер, 1992; Башкатова и др., 1998; Зенков, 2000; Cooke, 1992; Demple, 1992; Gelis, 1998]. Установлено, что в центральной нервной системе (ЦНС) гиперпродукция NO играет роль в развитии эпилепсии и инсультов. Что касается сердечно-сосудистой системы, то избыток NO увеличивает проницаемость сосудов, способствует отёку тканей, оказывает прямое кардиотоксическое действие, приводит к генерализованной вазодилятации и глубокому снижению артериального давления (АД) [Giagliano et al., 1995]. Более того, NO подавляет реакцию сосудов на констрикторные стимулы, и гипотензия может стать необратимой. Это явление было описано при септическом, геморрагическом, травматическом, анафилактическом, тепловом и кардиогенном шоке [Стокле и др., 1998].

N0, вырабатывается эндотелиальной синтазой оксида азота — eNOS, кодируемой геном NOS3, является самым мощным из известных эндогенных вазодилятаторов [Ванин, 1998; Гомазков, 2000; Wilcox et al., 1997] и его связь с сердечно-сосудистой патологией, не вызывает сомнений [Степанов и др., 1998; Чистяков и др., 2000; Пузырёв К. В., 1999; Ковалев, 2001; Косянкова, 2002; Sessa, 1994; Warpeha et al., 1999; Hingorani et al., 1999; Guzic et al., 2001; Colombo et al. 2003; Casas et al. 2004]. Однако анализ литературы показывает множество пробелов в наших современных знаниях по исследованиям роли гена NOS3 в патогенезе инсульта.

Проблема инсульта является актуальной в связи с его широкой распространённостью. Инсульт, являясь мультифакториальным заболеванием, требует изучения распространённости этиологических факторов (факторов риска) в конкретной популяции. Для эффективного определения характера генетических изменений, лежащих в основе этой патологии, а также для дальнейшего развития представлений о механизмах развития инсульта целесообразно проведение популяционно-генетического исследования. Такой подход может служить основой в оценке общей подверженности популяции к развитию цереброваскулярной патологии и, в частности, ишемического и геморрагического инсульта.

Таким образом, анализ генетической компоненты в этиологии и патогенезе развития инсульта представляется весьма актуальным.

Цель исследования:

Установить факторы риска инсультов и значимость аллельных вариантов генов ИОБЗ, РУ, П1, ОРШа в развитии острых нарушений мозгового кровообращения у русских жителей города Томска.

Задачи исследования:

1. Изучить основные факторы риска развития инсульта у больных г. Томска.

2. Оценить частоты аллелей и генотипов по полиморфным вариантам генов-кандидатов подверженности к инсульту: гена эндотелиальной синтазы оксида азота (N083), гена пятого фактора свертываемости крови (РУ), гена протромбина (РП) и гена рецептора интегринов (ОРШа) в Томской популяции.

3. Изучить ассоциации полиморфных вариантов генов N083, '.РУ, РП, ОРШа с факторами риска развития инсульта и его клиническими проявлениями.

4. Определить связь генов N083, РУ, РП, ОРШа с количественными патогенетически значимыми признаками для инсульта признаками. Новизна исследования:

Впервые проведено исследование генетической изменчивости полиморфных вариантов УШИ, С774Т, 0894 Т, С-691Т гена эндотелиальной синтазы оксида азота (N083) — 1 691А, А407(Ю гена пятого фактора свертываемости крови (РУ), полиморфизма 20 210А гена протромбина (Р11) и варианта Т196С гена рецепторов интегринов (ОРШа) у жителей г. Томска, перенесших мозговой инсульт. Получены новые сведения о вкладе полиморфных вариантов генов N083, РУ, Р11, ОРШа в предрасположенность к инсульту. Показано, что полиморфизмы УШИ и С774Т гена N083 могут быть факторами риска развития инсульта и служить генетическими маркёрами при тестировании данной патологии.

Впервые оценена роль генов N083, ГУ, П1, СРШа в изменчивости комплекса количественных патогенетически значимых признаков, при инсульте. Показано, что полиморфные варианты гена N083 ассоциированы с показателями уровня липидов и свёртывающей системы крови (УЫТЯ полиморфизм гена N083 с показателями уровня триглицеридовполиморфизм 0894 Т с уровнем общего фибриногенааллельные варианты полиморфизма С-691Т с показателями холестерина в составе липопротеидов высокой плотности, и идексом атерогенности). Полиморфизм Т196С гена СРШа связан с показателями свёртывающей системы крови (уровнем общего фибриногена, активированным тромбопластиновым временем). Практическая значимость:

Сведения о значимости артериальной гипертонии как фактора риска инсульта, у лиц с отягощенным семейным анамнезом, позволяют обратить внимание на более активную профилактику инсульта не только на популяционном, но и индивидуальном уровне, направленном на максимально раннее выявление лиц с заболеваниями и патологическими процессами, повышающими риск развития острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК).

Полученные данные о вкладе молекулярно-генетических маркёров в формирование клинического полиморфизма инсульта могут быть учтены при формировании групп риска и организации профилактических мероприятий, стать основой для осуществления молекулярно-генетического тестирования подверженности к данной патологии в семьях, служить ориентиром в выборе лекарственной терапии (генотип-специфическая терапия).

Полученная информация о распространении частот аллелей и генотипов полиморфизма генов N083, ГУ, П1, СРШа может быть использована в области генетической эпидемиологии, патологии человека, а также в популяционной и эволюционной генетике для углублённого описания генофондов народонаселения. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ведущий фактор риска развития инсульта — артериальная гипертонияассоциирован с полиморфизмами (УШ11, С774Т, в894Т, С-691Т) гена эндотелиальной синтазы оксида азота (N033).

2. Аллельные варианты гена N083 связаны с уровня липидов и свёртывающей системы крови (УЫТЯ полиморфизм с показателями уровня триглицеридовполиморфизм в894Т с уровнем общего фибриногенаС-691Т с показателями холестерина в составе липопротеидов высокой плотности и идексом атерогенности).

3. Наличие мутации Лейдена 691 А) является фактором риска тяжёлого течения инсульта.

4. Полиморфизм Т196С гена СРШа ассоциирован с показателями свёртывающей системы крови (уровнем общего фибриногена, активированным тромбопластиновым временем), а также с нарушением ритма сердца у пациентов, перенесших инсульт. Апробация работы:

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на межлабораторном научном семинаре ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2005 г.) — IV и V конгрессах молодых учёных и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2003; 2004) — на V Конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Афины, 2003 г.) — Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвящённой 300-летию Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы современной неврологии, психиатрии и нейрохирургии» (Санкт-Петербург, 2003 г.) — Международной конференции «Современные подходы к диагностике, профилактике и лечению нейродегенеративных заболеваний (деменции, инсульта и болезни Паркинсона)» (Новосибирск, 2003 г.) — Международном европейском конгрессе по генетике человека (Мюнхен, Германия, 2004 г.) — научно-практической конференции, посвященной 25-летнему юбилею факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов (Томск, 2004 г.), Российском национальном конгрессе кардиологов (Томск, 2004), VII научной конференции «Актуальные проблемы клинической генетики» (Томск, 2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в сборниках и 6 тезисов в материалах конференций различного уровня.

ВЫВОДЫ.

1. Наиболее распространённым фактором риска инсульта у жителей г. Томска является артериальная гипертония. Тяжесть инсульта зависит от уровня среднего артериального давления. Наследственная отягощённость — второй по значимости (после артериальной гипертонии) фактор риска и наблюдается у пациентов с ишемическими инсультами в 76,53% случаев, а с геморрагическими — в 68,78%.

2. Установлено, что полиморфные варианты VNTR и С774Т гена NOS3 вносят вклад в предрасположенность к развитию инсульта и являются важными для прогнозирования тяжести течения и типа заболевания: выявлено значимое накопление аллеля «A» VNTR полиморфизма по сравнению с контрольной группой и по мере нарастания тяжести заболевания. Больные геморрагическим инсультом имеют более высокую частоту генотипа «АА» по сравнению с больными ишемическим инсультом и контрольной группой. Носители гетерозиготного генотипа «СТ» полиморфного варианта С774Т имеют повышенный риск развития инсульта характеризующегося средней степенью тяжести неврологических нарушений.

3. Мутация Лейдена FV{G1691 А) является фактором риска тяжелого течения инсульта. Частота «патологического» аллеля «А» у больных с тяжелой степенью заболевания находится на уровне 9,4%, что превышает значения, полученные для контрольной группы 2,1%- р=0,05.

4. Выявлена ассоциация полиморфного варианта Т196С гена GPIIIa с нарушениями седечного ритма при инсульте. У больных инсультом с нарушением сердечного ритма на ЭКГ установлена более высокая частота «патологического» аллеля PLA2(16,7%) и его гетерозиготных носителей (33,3%) по сравнению с группой больных инсультом без нарушений сердечного ритма (7%) (%2=3,95- р=0,046) и (13,9%) (%2=4,46- р=0,034) соответственно).

5. Для полиморфных вариантов гена N033 и Т196С гена СРШа получены ассоциации с параметрами липидного спектра и свёртывающей системы крови больных. Установлено, что УЫТЯ полиморфизм гена N033 связан с уровнем триглицеридов в крови. У больных с генотипом «вв» полиморфизма С894Т гена N033 отмечено повышение уровня общего фибриногена. Аллельные варианты полиморфизма С-691Т гена N033 связаны с показателями холестерина в составе липопротеидов высокой плотности и индексом атерогенности. Полиморфизм Т196С гена СРШа связан с показателями свёртывающей системы крови: повышением уровня общего фибриногена и снижением показателей активированного частичного тромбопластинового времени.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Выявление высокой значимости артериальной гипертонии — как фактора риска инсульта, у лиц с отягощённой предрасположенностью, позволяет обратить внимание на более активную популяционную и индивидуальную профилактику инсульта, направленную на максимально раннее выявление лиц с заболеваниями и патологическими процессами, повышающими риск развития острых нарушений мозгового кровообращения. При планировании мероприятий по профилактике инсультов, особое внимание уделять контролю АД, лечению артериальной гипертензии, сердечнососудистых заболеваний.

2. Обратить внимание на развитие инсульта у лиц с наследственной предрасположенностью на фоне пограничной и умеренной АГ, а также на низкий процент больных, получающих адекватное лечение.

3. Необходимо продолжить исследование инсульта и его факторов риска в открытой популяции г. Томска для более достоверной и углублённой информации о динамике эпидемиологических показателей, роли генетических факторов.

4. Полученная информация о распространении частот аллелей и генотипов полиморфизма генов ЫОБЗ, ГУ, П1, СРШа может быть использована в эволюционной геномике, популяционной генетике и генетической эпидемиологии широко распространённых заболеваний. Сведения о вкладе молекулярно-генетических маркёров в формирование клинического полиморфизма инсульта могут учитываться при формировании групп риска и организации профилактических мероприятий.

6. Анализ прогностической значимости полиморфных вариантов генов в семьях, может являться основой для осуществления молекулярно-генетического тестирования к данной патологии, служить ориентиром в выборе вида лекарственной терапии (генотип-специфическая терапия).