Влияние углеводородов и тяжелых металлов на некоторые звенья метаболизма головастиков шпорцевой лягушки (Xenopus Laevis)

Актуальность проблемы.

В настоящее время человек интенсивно изменяет химический состав окружающей среды. Повышается концентрация тяжелых металлов и углеводородов в воздухе, природных водах, почвенном покрове, организмах, что не проходит бесследно для органического мира (Глазов, 1977; Веселов, 1984; Аршаница, 1988; Бочков, Чеботарев, 1989; Грин, Стаут, Тейлор, 1990; Егорова, 1995; Mormede, Davies, 2001).

Возрастающий мутагенный пресс антропогенно меняющейся среды обитания ведет к увеличению наследуемой патологии и злокачественных образований на всех уровнях организации живой материи. Профилактика индуцированного мутагенеза реальна и могут осуществляться компонентным путем, т. е. выявлением и изъятием из сфер народного хозяйства веществ, обладающих прямым или потенциальным мутагенным действием (Гводенко, Зинчук, Алешня, 2000).

Накопление в живых организмах вредных веществ приводит, если не к гибели, то ослаблению их, развитию заболеваний, нарушению функций различных систем и органов, в том числе и репродуктивных (Миноранский, 1996).

Особое техногенное давление испытывают экосистемы внутренних водоемов и прибрежных морских вод в районах с мощной индустриальной базой, развитым сельским хозяйством, наличием богатых месторождений полезных ископаемых (Александров, 1988; Зобова, 1977; Степанов, Флоров, 1981; Сухенко, 1992; Gladimeyi, Wade, 1984; Кузьмин, 1999). 6.

Следовательно, понимание механизмов действия токсикантов на гидробио-нтов является необходимой предпосылкой для разработки научных основ и методов определения ПДК применительно к задачам рыбохозяйственной регламентации поступающих в водоемы химических веществ (Лукьяненко, 1983; Гвозденко, 1997; Потапов и соавт., 1998; Agradi, Baga, Ceradini, Heltai, 2000). Водные организмы часто подвергаются слабым хроническим дозам многочисленных антропогенных поллю-тантов, многие из которых, генотоксичны. Часто имеется длительный латентный период между началом контакта поллютанта с окружающей средой и последующим патологическим состоянием или возможным экологическим ударом. Метод ранней диагностики таких процессов был бы крайне полезен (Shugart, Simener, Me. Carthy, 1987). В то же время, ПДК многих веществ являются крайне завышенными. Так, ПДК бензола для рыбохозяйственных водоемов составляет 0,5 мг/л, тогда как это вещество физиологически весьма активно и встречается в нефти, коксовой смоле, выхлопных газах, то есть в веществах, наиболее часто попадающих в окружающую среду в следствии хозяйственной деятельности человека. Гомолог бензола — толуол обладает менее выраженной токсичностью, по литературным данным (Plappert, Ваг-hel, Seidel, 1994), но его ПДК для рыбохозяйственных водоемов также составляет 0,5 мг/л (Перечень ПДК и ориентировочно безопасных уровней воздействия вредных веществ воды рыбохозяйственных водоемов, 1993).

Внушает опасения повышение в природных водах ионов тяжелых металлов, например, таких как медь, кадмий. 7.

Токсичность этих веществ, при воздействии на живой организм, показана во многих научных работах, но изучению таких опасных ксенобиотиков, в концентрациях равных ПДК, уделяется крайне слабое внимание, хотя такие исследования могут существенно помочь в уточнении существующих нормативов (Болезни рыб. Справочник, 1989; Микряков, Лакирова, 1997; Lin Yu-hua, Lu Jian-min, Fu Huiguang, 2001).

Мало изученная область — совместное действие ксенобиотиков на живой организм. Естественно, накопление данных в этой области позволяет более масштабно подойти к проблеме охраны окружающей среды (Волков и соавт., 1977; Максимов и соавт., 1997).

Одна из основных задач классической токсикологии — выбор объекта исследований (Катаскова, Полуян, Щербакова, 2000). Шпорцевая лягушка является весьма удачным тест — объектом среди позвоночных животных. Хотя в биологических лабораториях эксперименты на Xenopus laevis проводятся не одно десятилетие (Дет-лаф, 1975; Лефковитс, Гирнис, 1988; Brattelid, Smith, 2000), в практике токсикологических исследований в нашей стране это объект еще не применялся.

Преимущество проведения работы с этим животным следующие:

• возможность проведения исследований круглогодично;

• наличие генетически однородной популяции;

• большое количество икры;

• возможность постановки эксперимента на животных начиная с эмбрионального периода;

• высокая чувствительность головастиков к ксенобиотикам- 8.

• легкость содержания взрослых животных.

Цель и основные задачи исследования.

Целью настоящей работы является исследование воздействия тяжелых металлов (Си, Cd) и углеводородов (бензол, толуол), в концентрациях равных ПДК, на ряд метаболических процессов головастиков шпорцевой лягушки (Xenopus laevus) для рекомендации данного организма, как тест — объекта для разработки ПДК загрязняющих веществ рыбохозяйственных водоемов.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать влияние тяжелых металлов и углеводородов в тесте Fetax.

2. Изучить влияние тяжелых металлов и углеводородов на включение Н-тимидина в ДНК и содержание дезоксирибонуклеиновых кислот в организме головастиков Xenopus laevis.

3. Оценить воздействие тяжелых металлов и углеводородов на интенсивность пере-кисных процессов в организме головастиков Xenopus laevis.

4. Изучить действие тяжелых металлов и углеводородов на выработку гормона стресса — кортикостерона в организме головастиков Xenopus laevis. 9.

Научная новизна.

Впервые шпорцевая лягушка введена как тест — объект в токсикологические исследования в нашей стране. о.

Впервые проведены исследования по изучению включения Н-тимидина в ДНК у головастиков Xenopus laevis. Показана возможность применения данной методики для выявления действия углеводородов и тяжелых металлов на репаратив-ные процессы в ДНК организма.

Выявлено тератогенное действие исследованных веществ в концентрации равной ПДК на эмбрионы шпорцевой лягушки.

Обнаружено, что толуол и ионы тяжелых металлов блокируют гормональный ответ организма при стрессе и снижают интенсивность репаративных процессов в ДНК организма, добавление же к смеси поллютантов — бензола активирует как гормональный ответ, так и интенсивность репаративных процессов в ДНК.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Полученные результаты значительно расширяют представления о механизмах действия тяжелых металлов и углеводородов в концентрациях, равных ПДК, на живой организм. Показана необходимость пересмотра ПДК ряда веществ с учетом их действия на генетический аппарат.

Результаты работы позволяют сделать вывод о возможности развития стрессреакции у организмов даже при незначительных изменениях концентрации загрязняющих веществ. Показаны перспективы изучения гормонального статуса организма для диагностики патогенного действия изучаемых веществ. Выявлена связь между развитием стресс — реакции у организмов и интенсификацией репаративных процессов в ДНК у головастиков шпорцевой лягушки. Результаты исследований послужили основой для разработки 15 ПДК для рыбохозяйственных водоемов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Шпорцевая лягушка является чувствительным объектом и может использоваться для апробации ПДК загрязняющих веществ рыбохозяйственных водоемов.

2. Бензол при хроническом воздействии в концентрации, равной ПДК, вызывает повышение интенсивности включения меченного тимидина в ДНК и активацию уровня перекисного окисления липидов в организме головастиков Xenopus laevis. в остром опыте бензол вызывает стресс-реакцию у животных, что выражается в повышении уровня кортикостерона.

3. Толуол в концентрации, равной ПДК, вызывает снижение интенсивности включения 3Н-тимидина в ДНК и повышает уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в организме головастиков, при этом блокируется гормональный ответ.

3 ттт.

Смесь бензола и толуола повышает как уровень включения Н-тимидина в ДНК,.

11 интенсивность ПОЛ, вызывает увеличение концентрации кортикостерона в организме головастиков Xenopus laevis.

— f~2 [ о.

4. Смесь тяжелых металлов Си, Cd, в концентрациях равных ЦЦК, вызывает снижение интенсивности включения меченного тимидина в ДНК и повышает интенсивность ПОЛ, но не вызывает гормонального ответа в организме голова2 стиков Xenopus laevis. Совместное действие Си, Cd и бензола, толуола в концентрации, равной ПДК, вызывает повышение уровня включения метки в ДНК, активацию ПОЛ и вызывает значительный гормональный ответ (повышение содержания кортикостерона) в организме головастиков Xenopus laevis.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на:

• 3-й Международной Конференции «Экология города» (г. Ростов — наДону, 1995),.

• конференции молодых ученых «Биомониторинг и рациональное использование гидробионтов» (г. Владивосток, 1997),.

• 3-й Международной Конференции «Экология и здоровье человека» (г.

Ростов — на — Дону, 1997).

Методические указания по использованию головастиков шпорцевой лягушки для определения токсичности воды в лабораторных условиях приняты к вне.

12 дрению Центральным управлением по рыбохозяйственной экспертизе и нормативам по охране, воспроизводству рыбных запасов и акклиматизации.

Материалы диссертации использованы при создании научно-популярного фильмаоб амфибиях и могут использоваться при чтении спецкурсов по биохимии и экологии в ВУЗах.

Публикации.

По материалам работы опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем работы.

Работа состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов, изложена на 101 странице машинописного текста и содержит 9 таблиц, 3 рисунка, 1 фотографию.

Список литературы

включает 123 на именования, из них — иностранных 17.

Выводы.

1. На основании проведенных экспериментов доказано, что шпорцевая лягушка яв' ляется чувствительным объектом для изучения воздействия загрязняющих веществ и может использоваться при разработке ПДК для рыбохозяйственных во' доемов.

2. Толуол (0,5 мг/л), смесь ионов меди (0,001 мг/л) и кадмия (0,005 мг/л) при остром воздействии (24 часа) и бензол (0,5 мг/л) при хроническом действии (30 суток) в предельно допустимых концентрациях (ПДК) повышают уровень перекисного окисления липидов в организме головастиков Xenopus laevis.

3. Толуол (0,5 мг/л) и смесь солей тяжелых металлов (Си + 2 0,001 мг/л, Cd + 2 0,005 мг/л) в концентрациях, равных ПДК, не влияют на концентрацию кортикостерона в организме Xenopus laevis и снижают интенсивность включения Н-тимидина при неизменной концентрации ДНК и повышают смертность личинок на 35% и 25,5% соответственно.

4. Добавление бензола к толуолу и солям тяжелых металлов.

Си + 2 0,001 мг/л, Cd 2+.

0,005 мг/л (все вещества взяты в предельно допустимых концентрациях) повышает содержание в организме Xenopus laevis кортикостерона, активирует включение Н-тимидина при неизменной концентрации ДНК и снижает смертность.

86 организмов по сравнению с отдельно взятыми толуолом и ионами тяжелых металлов, то есть является антагонистом. 5. Учитывая выявленное (с помощью нового объекта — шпорцевой лягушки и разработанных нами методик) токсическое действие поллютантов на уровни, приближенных к ПДК, считаем необходимо пересмотреть существующий перечень ПДК изученных нами веществ для рыбохозяйственных водоемов.

Заключение

.

В условиях изменения физиологически оптимальных параметров химического состава воды за счет присутствия примесей антропогенного происхождения, содержащиеся в воде токсиканты могут служить причиной формирования патологических реакций организма (Бокина, Фадеева, Вихрова, 1972; Виноградова, 1988). Во многих случаях наблюдается длительный латентный период между началом контакта химиката с окружающей средой и последующим выражением патологического состояния (Shugart, 1987), что подтверждается нашими экспериментальными данными. Следовательно, понимание механизмов действия токсикантов на гидробионтов является необходимой предпосылкой для разработки научных основ и методов определения ПДК, применительно к задачам рыбохозяйственной регламентации поступающих в водоемы химических веществ (Лукьяненко, 1983; Гвозденко, 1997; Argadi, Baga, Ceradini, Heltai, 2000). Так, при остром воздействии бензола, в концентрации равной ПДК, наиболее быстро реагирует на воздействие токсиканта гормональное звено. Повышение концентрации кортикостерона может свидетельствовать о начале развития стресс-реакции у опытных животных.

Полученные данные свидетельствуют о том, что острое применение бензола в концентрации, равной ПДК, не вызывает достоверных изменений как в интенсивно.

78 сти включения Н-тимидина в ДНК (табл.1), так и в концентрации ДНК и уровне перекисного окисления липидов. Как у контрольных, так и у опытных животных содержание ДНК составляет 0,4 мг/г ткани (табл. 2).

Изменение в уровне кортикостерона может свидетельствовать о развитии стресс — реакции у животных, а следовательно, активации гомеостатирующих механизмов, что подтверждается литературными данными о роли этого гормона (Хеф-ман, 1972; Гаркови, Квакина, Укалова, 1977).

Взаимодействие токсических агентов с живыми системами приводит к нарушению гомеостаза на клеточном и тканевом уровнях, что наглядно представлено интенсификацией тератогенеза (фото 1). Бензол, при его хроническом воздействии вызывает искривление хорды и расширение кровеносных сосудов в области сердца. Активация перекисного окисления липидов выявлена практически во всех вариантах опыта, что можно рассматривать как свидетельство воздействия на организм мощного стресс — фактора и универсального механизма повреждения мембранных структур клетки, следствием которого являются изменения вязкости липидного биослоя и нарушение ионной проницаемости (Коржаницкий, 1977; Осипов и соавт. 1980; Белевский, 1981; Slater, 1984). Однако, при остром действии бензола нами не отмечено активации ПОЛ, что может быть объяснено запуском гомеостатирующих механизмов, посредством активации гормональных процессов, тормозящих повреждающее действие бензола на мембраны при однократном использовании последнего.

В отличие от острого воздействия, использование постоянно поддерживаемой концентрации бензола вызывает достоверное повышение активности перекисного окисления липидов, что выражается в достоверном увеличении уровня МДА на 21,6% по сравнению с контролем. В то же время, концентрация кортикостерона достоверно не отличалась от контрольного уровня (табл. 2).

Восстановление уровня кортикостерона и повышение ПОЛ может свидетельствовать о повышении активности систем организма животных, в том числе и репа-ративных. Действительно, результаты исследований свидетельствуют об увеличении интенсивности включения Н-тимидина в ДНК.

Как уже было отмечено, бензол обладает минимальным влиянием на изученные звенья метаболизма по сравнению с толуолом и солями тяжелых металлов. Причем летальность в тесте Fetax для бензола была также минимальной. 2 + 2.

В то же время, применение толуола и солей тяжелых металлов (Си, Cd) в концентрации, равной ПДК, свидетельствует о том, что несмотря на выраженное негативное влияние этих веществ на организм (резкая активация ПОЛ), изменений в содержании гормона стресса — кортикостерона не происходит. Это обусловлено, повидимому, блокадой гормонального ответа организма этими токсикантами. Наряду с.

3 о отмеченным процессом, снижение включения Н-тимидина при неизменной концентрации ДНК может свидетельствовать и о блокировании репаративных процессах в ДНК. Кроме того, для действия толуола и солей тяжелых металлов характерна максимальная смертность организмов (рост смертности для толуола — 35%, солей тяже.

80 лых металлов — 25% по сравнению с контролем) и наиболее выраженный тератогенный эффект.

Результаты исследований по изучению влияния толуола в концентрации 0,5 мг/л и смеси бензол 0,5 мг/л, толуол 0,5 мг/л (концентрации веществ равны ПДК) на динамику встраивания Н-тимидина в ДНК головастиков Xenopus laevis в остром опыте представлены в таблицах 3,4.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что добавление толуола в концентрации 0,5 мг/л в остром опыте достоверно (Р < 0,05) снижает уровень связанной с ДНК метки. В тоже время, не отмечено изменений в концентрации ДНК (табл. 5).

То есть, очевидно, что снижение количества связанного Н-тимидина зависит не от изменения концентрации ДНК, а от замедления включения его в состав нуклеиновых кислот в ходе репаративных процессов в организме Xenopus laevis.

Выявлено достоверное (Р < 0,05) снижение отношения связавшегося с ДНК Н-тимидина к свободному через 30 и 180 минут после введения метки (табл.3).

Параллельно с этим процессом отмечено достоверное повышение уровня пере-кисного окисления липидов в организме экспериментальных животных (табл.5), что может свидетельствовать о воздействии выраженного стрессогенного фактора на организм головастиков.

Однако, отсутствие повышения концентрации кортикостерона у головастиков Xenopus laevis при остром воздействии толуола, являющегося выраженным стрессо.

81 ром, повышающим интенсивность ПОЛ, может свидетельствовать о подавляющем действии этого токсиканта на гормональное звено регуляции метаболизма, что может, в конечном итоге угнетать метаболические процессы организма, в том числе и репаративные, что было отмечено в наших исследованиях.

Во многом отличные от воздействия раздельно применяемых бензола и толуола, данные получены при остром воздействии смеси этих веществ в концентрации, равной ПДК. Результаты этих исследований свидетельствуют о выраженном развитии стресс — реакции в организме головастиков, что проявляется в повышении активности перекисного окисления липидов и в достоверном увеличении уровня МДА в сравнении с контролем, а также в достоверном увеличении содержания кортикостерона по сравнению с контрольным значением (табл. 5).

Параллельно с этими процессами нами обнаружено выраженное потенцирование включения 3Н-тимидина. Также выявлено выраженное увеличение отношения о связанного с ДНК Н-тимидина к свободному. Наряду с этим процессом отмечалось сохранение концентрации ДНК на контрольном уровне. Эти данные могут свидетельствовать о значительном усилении репаративных процессов, что обусловлено, по-видимому, повреждающим ДНК действием смеси толуола и бензола при остром воздействии этих веществ.

Таким образом, действие смеси бензол — толуол в концентрациях равных ПДК дает противоположный эффект по включению меченного тимидина в ДНК головастиков Xenopus laevis в сравнении с отдельным действием толуола. Причем, толуол.

82 оказывает выраженное подавляющее действие на различные этапы метаболизма, тогда как бензол препятствует инактивирующему как гормональные, так и репаратив-ные процессы действию толуола.

Результаты исследований по изучению влияния смеси ионов металлов (медь и кадмий) и смеси ионов металлов с углеводородами (бензол и толуол) в концентрациях равных ПДК на динамику встраивания Н-тимидина в ДНК головастиков Xenopus laevis представлены в таблицах 6, 7.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что добавление смеси ионов ме.

2 + 2 таллов до конечной концентрации (Си (0,001 мг/л), Cd (0,005 мг/л) в среду головастиков с последующей экспозицией 18 часов до введения меченного тимидина в организм головастиков достоверно (Р < 0,05) снижает уровень связанной с ДНК метки. Отношение связанного с ДНК Н-тимидина к свободному статистически значимо (Р < 0,05) уменьшалось по сравнению с контролем (табл.6). В то же время, концентрация ДНК в условиях данного исследования достоверно не отличается от контрольного уровня (табл.8). Полученные данные свидетельствуют о том, что.

3 Ч> снижение количества связанного Н-тимидина зависит не от изменении концентрации ДНК, а от торможения включения нуклеотида в состав нуклеиновых кислот в ходе репаративных процессов. По-видимому, действие смеси ионов данных металлов в остром опыте, при концентрациях веществ равных ПДК в значительной степени блокирует интенсивность репаративных процессов в организме.

83 блокирует интенсивность репаративных процессов в организме головастиков Xenopus laevis.

Значительный интерес представляет тот факт, что бензол, сам по себе являющийся мощным токсикантом, выступает в смеси с толуолом и ионами тяжелых металлов своеобразным антагонистом. Действие смеси бензола с толуолом, а также и бензола с тяжелыми металлами приводит к активации ПОЛ. Однако, наряду с этим отмечен резкий гормональный ответ, заключающийся в росте концентрации адаптационного гормона кортикостерона и активация включения 3Н-тимидина при неизменной концентрации ДНК, что может свидетельствовать об интенсификации репаративных процессов. Наряду с этим выявлено снижение смертности личинок Xenopus laevis до 19% и 18% по сравнению с контролем соответственно, т. е. по сравнению с отдельно используемыми толуолом и ионами тяжелых металлов смертность уменьшается на 46% и 28%, соответственно.

Необходимо также принять во внимание, что отмеченные негативные метаболические ответы организма (активация ПОЛ, торможение репаративных процессов), а так же увеличение летальности организмов в присутствии бензола, толуола, ионов Си + 2, Cd 2 +, используемых в ПДК, свидетельствует о необходимости пересмотра существующих нормативов с использованием современных методов исследования.

Кроме того, требует дальнейшего детального изучения совместного действия токсиканта на гидробионтов, что, по нашему мнению, должно фиксироваться в.