Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на синтетические процессы клеток

Актуальность исследования.

К настоящему времени лазерное излучение прочно вошло в медицинскую практику. Прежде всего, это высокоинтенсивное лазерное излучение, используемое в хирургии для нанесения поверхностных и глубоких разрезов, испарения поверхностных дефектов кожи, коагуляции и карбонизации тканей, их стерилизации и т. д. [61, 74]. В сочетании с фотосенсибилизатором низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) применяется для избирательного разрушения опухолей (фотодинамическая терапия) [68, 101, 154, 198]. И, наконец, все большее внимание врачей и исследователей привлекает низкоинтенсивная лазерная терапия (НЛТ), основанная на эффекте взаимодействия света с естественными компонентами клеток и тканей [218]. С одной стороны это обусловлено все возрастающей лекарственной аллергизацией населения, а также привыканием к медикаментозным препаратам, что требует поиска новых способов патогенетического воздействия на организм пациента [83]. С другой стороны, достаточно высокая терапевтическая эффективность НИЛИ, наблюдаемая при лечении самого широкого круга заболеваний, служит веским аргументом в пользу перспективности развития НЛТ [5, 55, 59, 80, 105].

Несмотря на большое количество свидетельств успешного применения, достаточное количество врачей встречают НЛТ с осторожностью и некоторой долей скептицизма [105, 182, 218]. Эти осторожность и скептицизм вполне понятны и в их основе лежит отсутствие убедительного научного объяснения наблюдаемых положительных эффектов лазерного облучения. Действительно, ни одна из существующих на сегодняшний день теорий, описывающих механизмы лазерной биостимуляции, не дает полного представления о механизме терапевтического действия НИЛИ, начиная с поглощения кванта света и заканчивая физиологическим ответом организма. В результате подбор доз, режимов и способов облучения, клинических показаний к проведению HJ1T преимущественно идет эмпирическим путем, что малоэффективно, часто сопровождается отсутствием ожидаемого положительного результата вплоть до развития побочных эффектов и обострения основного заболевания [7, 36, 105, 182, 218].

Согласно сформулированной на кафедре биофизики РГМУ концепции свободнорадикального механизма стимулирующего действия НИЛИ, хромофорами лазерного излучения в красной области спектра могут быть эндогенные порфирины, которые, поглощая энергию лазерного излучения, индуцируют фотосенсибилизированные свободнорадикальные реакции, приводящие к инициации перекисного окисления липидов в мембранах клеток и увеличению их проницаемости для ионов Са2+. В рамках данной концепции было показано, что лазер-индуцированное увеличение содержания ионов Са2+ в цитозоле лейкоцитов запускает Са2±зависимые процессы, результатом которых является сборка активных комплексов NADPH-оксидазы и повышение бактерицидных свойств клеток [47, 48, 91].

Тем не менее, наряду с увеличением бактерицидности, одними из наиболее часто встречаемых и хорошо доказанных как в клинике, так и в эксперименте терапевтическими эффектами НИЛИ являются вазодилятация, улучшение микроциркуляции, формирование и рост новых микрососудов, ускорение заживление ран, снятие болевого синдрома [1, 76, 204, 205, 218]. Анализ данных литературы показывает, что большинство этих эффектов могут быть связаны с активацией синтетических процессов клеток, а именно, с наработкой ферментов индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и супероксиддисмутазы (СОД), а также с активацией синтеза цитокинов и клеточной пролиферацией.

Согласно исследованиям последних лет активация синтетических процессов на начальном этапе сопровождается появлением в цитоплазме клеток активных форм кислорода (АФК), которые, выступая в качестве вторичных мессенджеров, активируют и/или потенцируют активацию различных сигнальных путей (MAP киназный каскад) и факторов транскрипции (NF-kB, API и др.) [98, 130, 214]. Учитывая это можно предположить, что, при инициации фотосенсибилизированных свободнорадикальных реакций под действием лазерного облучения, в цитоплазме клеток образуется некоторое количество АФК, которые, воздействуя на транскрипционные факторы и сигнальные пути, запускают синтез белков, включая iNOS, СОД, различные цитокины. Отсюда возникла необходимость исследования влияния НИЛИ на активацию синтетических процессов клеток и возможного участие АФК в этой активации.

Цель и задачи исследования

.

Целью настоящей работы было изучить влияние НИЛИ в красном диапазоне спектра на индукцию синтетических процессов клеток (синтез iNOS, супероксиддисмутазы, цитокинов ФНОа и ИЛ-1(3), а так же исследовать возможное участие активных форм кислорода в этой индукции.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:

1. Изучить влияние лазерного облучения на индукцию синтеза ферментов супероксиддисмутазы и индуцибельной NO-синтазы в макрофагах, а также изучить влияние лазерного облучения на индукцию синтеза цитокинов (ФНОа и ИЛ-1(3) мононуклеарными фагоцитами.

2. Изучить влияние экзогенного фотосенсибилизатора «Фотосенса» и индуктора синтеза эндогенных порфиринов аминолевуленовой кислоты на лазер-индуцированный синтез NO-синтазы макрофагов.

3. Изучить влияние антиоксидантов на лазер-индуцированный синтез ферментов NO-синтазы и супероксиддисмутазы макрофагов.

4. С помощью флуоресцентного зонда DCFH-DA изучить возможность образования активных форм кислорода в цитоплазме макрофагов под действием лазерного излучения.

Научная новизна.

1. В работе показано, что низкоинтенсивное лазерное излучение (А-=632.8 нм) способно активировать синтез клетками (перитонеальными макрофагами крыс и моноцитами периферической крови человека) цитокинов ИЛ-1|3 и ФНОа, а так же ферментов индуцибельной N0-синтазы и супероксиддисмутазы.

2. Проведено сопоставление действия лазерного излучения красного и инфракрасного диапазонов спектра, а так же изучено влияние предварительной инкубации макрофагов с индуктором синтеза эндогенных порфиринов — аминолевуленовой кислотой на лазер-индуцированную активацию синтеза клетками оксида азота.

3. С помощью внутриклеточного индикатора АФК — дихлорфлуоресцин-диацетата (DCFH-DA), в работе исследовано образование активных форм кислорода в суспензии макрофагов под действием лазерного облучения без и в присутствии экзогенного фотосенсибилизатора, а так же в суспензии макрофагов, предварительно проинкубированных с индуктором синтеза эндогенных порфиринов аминолевуленовой кислотой. Показано, что облучение клеток в присутствии антиоксидантов (мексидола, аскорбата и рутина) приводит к отмене лазер-индуцированной активации синтеза клетками оксида азота и увеличения активности супероксиддисмутазы.

4. На основе полученных данных предложена свободнорадикальная концепция механизма активации синтетических процессов под действием низкоинтенсивного лазерного излучения (А,=632.8 нм), которая включает в себя все звенья биостимулирующего эффекта, начиная от поглощения кванта света эндогенным хромофором и заканчивая изменением синтетической активности клетки.

Практическая значимость.

Полученные в работе данные представляют интерес для понимания механизмов терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения и могут способствовать научно-обоснованному подбору доз, режимов и способов облучения, а также клинических показаний к проведению низкоинтенсивной лазерной терапии. Кроме этого, полученные данные могут служить основой для дальнейших исследований в области изучения механизмов терапевтической эффективности низкоинтенсивных лазерных излучений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Низкоинтенсивное лазерное излучение в красном диапазоне спектра (632.8 нм) активирует синтетические процессы клеток: индуцирует синтез индуцибельной NO-синтазы и супероксиддисмутазы в макрофагах, а так же выработку цитокинов (ИЛ-1р, ФНОа) моноцитами крови. Данное явление может лежать в основе таких хорошо доказанных терапевтических эффектов низкоинтенсивной лазерной терапии как улучшение микроциркуляции, формирование и рост новых микрососудов, ускорение заживление ран, снятие болевого синдрома и др.

2. Увеличение синтетической активности клеток под действием низкоинтенсивного лазерного излучения в красном диапазоне спектра связано с фотосенсибилизированными свободнорадикальными реакциями. При этом в качестве эндогенных фотосенсибилизаторов, ответственных за эффекты лазерного облучения, могут выступать порфирины.

3. Индукция синтетических процессов клеток под действием низкоинтенсивного лазерного излучения в красном диапазоне спектра обусловлена образованием активных форм кислорода в их цитоплазме, что доказано в опытах по изучению влияния антиоксидантов на увеличение синтетической активности клеток и в опытах по изучению изменения флуоресценции чувствительного к внутриклеточным активным формам кислорода зонда дихлорфлуоресцин-диацетата.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «N0 терапия: теоретические аспекты, клинический опыт и проблемы применения экзогенного оксида азота в медицине» (Москва, 4−5 декабря 2001 г.), а так же на первом интернациональном симпозиуме «Quantum medicine and new medical technologies» (Блед, Словения, 17−22 ноября 2001 г.), на III-ем съезде фотобиологов России (Воронеж, 28 июня — 4 июля 2001 г.), на II Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 24−28 апреля 2001 г.), на Пироговской межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 21−24 марта 2000 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 230 источников, из них 133 иностранных. Работа изложена на 177 страницах машинописного текста. Иллюстрированный материал представлен 39 рисунками и 3 таблицами.

148 ВЫВОДЫ.

1. Показано, что облучение излучением гелий-неонового лазера (А,=632.8 нм) в диапазоне доз от 0.24 до 0.48 Дж/см2 увеличивало выработку оксида азота макрофагами. При этом инкубация клеток с транскрипционным ингибитором циклогексимидом (0.5 мкМ) или специфическим ингибитором NO-синтазы — N-MOHOMemii-L-аргинином (L-NMMA, 100 мкМ) отменяла увеличение продукции оксида азота, что указывает на связь стимулирующего эффекта лазерного воздействия с индукцией синтеза фермента индуцибельной NO-синтазы de novo.

2. Показано, что облучение излучением гелий-неонового лазера в диапазоне доз от 2.1 до 12.48 Дж/см2 увеличивало выработку провоспалительных цитокинов ИЛ-1(3 и ФНОа моноцитами периферической крови человека.

3. Показано, что облучение излучением гелий-неонового лазера в диапазоне доз от 0.36 до 10 Дж/см увеличивало активность супероксиддисмутазы в суспензии макрофагов. При этом максимальная активность фермента наблюдалась при дозе облучения 1.2 Дж/см. Установлено, что увеличение активности супероксиддисмутазы было связано с индукцией ее синтеза de novo — инкубация клеток с транскрипционным ингибитором циклогексимидом (0.5 мкМ) отменяла лазер-индуцированное увеличение активности СОД.

4. Показано, что предварительная инкубация макрофагов с предшественником синтеза эндогенных порфиринов аминолевуленовой кислотой (0.01−1 мМ), а так же облучение макрофагов в присутствии экзогенного фотосенсибилизатора «Фотосенса» (10 нМ), приводили к снижению интенсивности лазер-индуцированной выработки клетками оксида азота (со 150−250% до 100−120% по отношению к контролю). В случае использования в эксперименте макрофагов исходно слабо отвечающих на лазерное облучение, указанные воздействия наоборот увеличивали интенсивность индукции синтеза оксида азота (со 100 140% до 160−180% по отношению к контролю). Полученные результаты свидетельствуют о важной роли фотосенсибилизаторов в активации синтетических процессов клеток под действием излучения гелий-неонового лазера.

5. Показано, что облучение клеток в присутствии антиоксидантов мексидола (0.5−1 мМ), аскорбата (0.1−0.5 мМ) или рутина (0.1−0.5 мМ) отменяло лазер-индуцированное увеличение активности супероксиддисмутазы и продукции оксида азота, что указывает на участие свободных радикалов в механизме развития ответа клеток на облучение.

6. Показано, что облучение макрофагов, предварительно проинкубированных с предшественником синтеза эндогенных порфиринов аминолевуленовой кислотой (1 мМ), а также облучение макрофагов в присутствии экзогенного фотосенсибилизатора «Фотосенса» (1 мкМ), сопровождались дозозависимым увеличением интенсивности флуоресценции специфического зонда (DCFH-DA), чувствительного к образованию активных форм кислорода внутри клетки.

7. Показано, что облучение излучением инфракрасного лазера (890 нм) в.

•л диапазоне доз от 0.012−0.072 Дж/см увеличивало выработку оксида азота макрофагами. При дальнейшем возрастании дозы увеличение продукции оксида азота сменялось ее подавлением.