Гидродинамические свойства и структура макромолекул лигнинов овса Avena Sativa и капусты Brassica Oleracea

Актуальность проблемы. Лигнины относятся к числу важнейших компонентов растительной ткани. Различные отходы сельскохозяйственного производства, технические отходы мукомольной промышленности и овощеводства, содержащие значительные количества растительных биополимеров, представляют собой потенциально ценное сырье для химической промышленности. В последние годы было показано, что лигнины — это перспективные природные соединения для создания нового класса биомедицинских препаратов полифункционального назначения, в том числе антиоксидантов, онкои геропротекторов. Однако сегодня препараты на основе лигнинов, в основном хвойных пород древесины, применяются лишь в качестве энтеросорбентов. Лигнины других классов, в том числе травянистые, практически не используются, что обусловлено недостаточной их изученностью. В связи с этим исследования химической и топологической структуры макромолекул недревесных лигнинов являются весьма актуальными. Новые знания о строении этих полимеров позволят расширить спектр продуктов, получаемых из растений. Одним из классических подходов к познанию строения органических высокомолекулярных соединений является исследование физико-химических свойств растворов методами молекулярной гидродинамики, которые позволяют получить надежные данные о конформациях и топологической структуре макромолекул. Результаты исследования ранее не изученных недревесных лигнинов имеет не только прикладное, но и теоретическое значение, в том числе для разработки концепции о топологической структуре природных лигнинов различных классов.

Целью работы является характеристика химической и топологической структуры макромолекул лигнинов, выделенных из травянистых растений — капусты Brassica oleracea и овса Avena sativa. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• изучение гидродинамических свойств макромолекул в разбавленных растворах ДМФА методами капиллярной вискозиметрии, скоростной седиментации и поступательной диффузии;

• оценка молекулярных масс и определение конформационных и скейлинговых характеристик лигнинов;

• исследование химического строения препаратов диоксанлигнинов физико-химическими методами.

Научная новизна. На основании анализа данных ЯМР-13С, ИКспектроскопии и химического анализа получены новые данные о химическом строении лигнинов из травянистых растений капусты Brassica oleracea и овса Avena sativa и показано, что исследуемые полимеры относятся к классу лигнинов GSHтипа. Установлен функциональный и мономерный состав и вычислены брутто-формулы мономерного звена исследуемых полимеров.

С использованием методов седиментационно-диффузионного анализа и современных гидродинамических теорий разбавленных растворов установлен ряд фундаментальных характеристик макромолекул, включая гидродинамические инварианты, фрактальные размерности и структурнотермодинамические параметры, что позволило впервые в химии лигнина экспериментально установить параметры равновесной гибкости полимерной цепи. Показано, что макромолекулы лигнина овса Avena sativa относятся к классу гибкоцепных линейных полимеров, а лигнина капусты.

Brassica oleracea — к классу регулярно-разветвленных полимеров.

Практическая ценность работы. Результаты структурно-химических исследований могут быть использованы при совершенствовании технологий утилизации технических отходов растительного происхождения.

Полученные данные о строении и физико-химических свойствах препаратов в сочетании с уже имеющимися сведениями о медико-биологическом применении лигнинов расширяют перспективы целенаправленного получения продуктов различного назначения при химической переработке травянистых растений. Результаты исследования найдут также применение 5 при разработке теоретических основ структурной организации природных лигнинов.

Апробация работы. Результаты работы обсуждались на П-ой Международной конференции «Физикохимия лигнина» (г. Архангельск, 2007 г.) — Международной молодежной конференции «Севергеоэкотех» (г. Ухта, 2006;2009 гг.) — Научно-практической конференции «Февральские чтения» (г. Сыктывкар, 2006;2009 гг.) — IV-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Сыктывкар, 2006 г.) и V-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Уфа, 2008 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 13 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Работа изложена на 114 страниц машинописного текста, содержит 31 таблицу, 18 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов.

Список литературы

содержит 150 наименований.

выводы.

1. Методами химического и физико-химического анализа проведено исследование диоксанлигнинов, выделенных из оболочек зерен Avena sativa и стеблей Brassica oleracea. Установлены элементный и функциональный состав ДЛ-К и ДЛ-Об, определены усредненные брутто-формулы мономерного звена: ДЛ-К — СдНу^оОг^гСОСНз)^, ДЛ-Об — С9Н7, з9Оз, 21(ОСНз)1,05- Установлено, что ДЛ-К и ДЛ-Об относятся к композиционно неоднородным биополимерам, состоящим из мономерных единиц гваяцильного, сирингильного и я-кумарового типа.

2. Методами скоростной седиментации, диффузии и вискозиметрии исследованы гидродинамические свойства фракционированных препаратов в ДМФА, определены молекулярные массы и параметры полидисперсности образцов ДЛ-К и ДЛ-Об, которые составили Mw =28,3 xlO3 (MJMn= 1,42) для ДЛ-К и Mw= 14,9 xlO3 {MJM" =1,06) для ДЛ-Об, соответственно.

3. В ходе исследования ДЛ-Об проведена оценка гидродинамического инварианта Цветкова-Кленина Л0=3,2-Ю10 эрг-К'^моль" 173 и скейлинговых индексов Марка-Куна-Хаувинка: <я=0,62 ?=-0,52 с=0,48, которые указывают на принадлежность этого лигнина к классу полимеров с линейной топологией макроцепей.

4. На основании определения структурно-термодинамических параметров и параметра заторможенности внутреннего вращения, а установлено, что макромолекулы ДЛ-Об относятся к классу гибкоцепных линейных полимеров с параметрами термодинамической гибкости цепи d-26,6 A H? k=58,0A.

5. В ходе исследования ДЛ-К проведена оценка скейлинговых индексов уравнений Марка-Куна-Хаувинка: а=0,54, ?=-0,59, с=0,41 и установлено, что макромолекулы образуют в ДМФА набухшие непротекаемые клубки асимметричной формы. 6. На основании анализа значений гидродинамического инварианта Цветкова-Кленина Д,=2,8−1010 эрг-К^моль173, фактора разветвленности 1) установлено, что макромолекулы ДЛ-К следует отнести к разветвленным структурам с линейными ветвями. Высказано предположение, что ДЛ-К представляет собой смесь макромолекул с трехи тетрафункциональными узлами ветвления.

1.4 Заключение.

Литературные данные свидетельствуют, что лигнин состоит из трех типов мономерных единиц. Применяя традиционные методы изучения структуры лигнина, такие как НБО, ПМО, ЯМРи ИК-спектроскопия, элементный и функциональный анализ, исследователям удалось установить многие важные аспекты строения лигнина на химическом уровне. Было определено, что лигнины хвойной древесины состоят, главным образом, из гваяцильных структурных единиц. Лиственные лигниныгваяцилсирингильные биополимеры. Для недревесных лигнинов, как видно из обзора литературы, характерно наличие в структуре трех типов фенилпропановых единиц. Здесь важно отметить, что для лиственных и недревесных лигнинов может иногда наблюдаться преобладание сирингильных или я-кумаровых единиц, что не позволяет идентифицировать их как вЗили ОБН-лигнин. Кроме того, необходимо напомнить, что до настоящего времени не разработан метод выделения неизмененного лигнина. Наиболее близкими, по строению, к природному лигнину, являются лигнины механического размола и диоксанлигнины. Применение же других методов, для получения препарата, может дать результат отличный от результатов, полученных большинством исследователей.

Главная характеристики любого полимера — молекулярная масса. Большинство ДЛ и ЛМР имеют молекулярную массу от 2,0хЮ3 до З5,0×103,.

3 3 иногда достигая 50,0×10 -60,0×10. Такие значения были получены методом ультрацентрифугирования. Другие методы исследования дают часто более низкие значения молекулярных масс. В отличие от синтетических полимеров, лигнинные препараты характеризуются небольшой степенью полидисперсности М^Мп= 1−1,5. В ряде работ были получены важные величины, характеризующие структуру полимерных цепей лигнина, такие как гидродинамические инварианты, скейлинговые индексы, фрактальные размерности, факторы ветвления, вычисляемые на основании зависимости свойств поступательного и вращательного трения от молекулярной массы. Все перечисленные величины необходимы для определения топологии любого полимера. Было установлено, что хвойные лигнины имеют хаотическую структуру, а лиственные лигнины — полимеры с тетрафункциональным узлом ветвления. О полимерной структуре недревесных лигнинов, в сравнении с данными о лиственных и хвойных лигнинах, известно крайне мало.

Таким образом, анализ имеющихся в настоящее время данных показывает, что к числу наиболее актуальных задач в области химии лигнина относятся следующие:

• исследование химического строения препаратов лигнинов физико-химическими методами.

• изучение гидродинамических свойств макромолекул в разбавленных растворах ДМФА методами капиллярной вискозиметрии, скоростной седиментации и поступательной диффузии;

• оценка молекулярных масс и определение конформационных и скейлинговых характеристик лигнинов.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Характеристика сырья.

Объектами исследования являлись диоксанлигнины, выделенные из стеблей (кочерыжек) капусты Brassica oleracea (ДЛ-К) и оболочек зерен овса Avena sativa (ДЛ-Об). Стебли кочерыжки капусты были заготовлены на предприятии ОАО «Совхоз Пригородный» г. Сыктывкар, а оболочки зерен овса на предприятии «Сысольская сортоиспытательная станция» с. Визинга, Сысольского района республики Коми. Содержание основных компонентов в растительном сырье: целлюлоза — 51,0% и 34,2% для В. oleracea и оболочки зерен A. Sativaлигнина — 12,2 и 21,3% соответственно. При обсуждении результатов привлекались также данные по исследованию диоксанлигнинов, выделенных из стеблей (соломы) овса A. sativa (ДЛ-О). Препараты лигнинов представляли собой порошки светло-кремового цвета. Выход лигнинов составил: ДЛ-К — 11,0%, ДЛ-Об — 41,6% от содержания лигнина в растительном сырье.

Определение содерлсания лигнина по методу Комарова. Навеску воздушно-сухого обессмоленного растительного препарата массой около 1 г о помещали в коническую колбу вместимостью 50 см с притертой пробкой. К.

3 3 навеске добавляли 15 см 72%-ной H2SO4 (плотностью 1,64 г/см) и выдерживали в термостате при температуре 24.25°С в течение 2,5 ч при осторожном периодическом помешивании во избежание образования комков. Затем смесь лигнина с кислотой переносили в коническую колбу.

3 3 вместимостью 500 см, смывая лигнин 200 см дистиллированной воды. Разбавленную смесь кипятили с обратным холодильником на электрической плитке в течение 1 ч. Частицам дали укрупниться и осесть. Затем лигнин отфильтровывали на пористом стеклянном фильтре, высушенном до постоянной массы. Фильтр с лигнином сушили в сушильном шкафу при температуре (103±-2)°С до постоянной массы и взвешивали. По отношению массы полученного лигнина к массе исходного сырья определяли содержание лигнина в исходном растительном сырье. Параллельно проводили три эксперимента.

Определение содержания целлюлозы по методу Кюршнера. Для анализа использовали азотно-спиртовую смесь, состоящую из одного объема концентрированной азотной кислоты (плотностью 1,4 г/ см3) и четырех объемов 95%-ного этанола. Навеску сырья около 1 г помещали в коническую.

3 3 колбу вместимостью 250 см и добавляли мерным цилиндром 25 см азотно-спиртовой смеси. Кипятили на водяной бане в течение 1 ч с обратным холодильником. После окончания кипячения давали опилкам осесть и о осторожно сливали жидкость. Далее добавляли 25 см свежей азотпо-спиртовой смеси, и снова кипятили в течение 1 ч. Такую обработку проводили 4 раза. После последней обработки отфильтровывали на высушенном до постоянной массы пористом стеклянном фильтре, о промывали 10 см свежей спирто-азотной смеси, и горячей водой. После промывки тщательно отсасывали воду и сушили в сушильном шкафу при температуре (103±2) °С до постоянной массы и взвешивали. По отношению массы полученной целлюлозы к массе исходного сырья определяли содержание целлюлозы в исходном растительном сырье. Параллельно проводили три эксперимента.

Определение содержания золы. Содержание золы проводили сжиганием навески образца, помещенного в фарфоровый тигель, с последующим прокаливанием золы в муфельной печи при температуре 550.600°С. После чего тигель охлаждали в эксикаторе и взвешивали. Содержание золы в процентах определяли по отношению массы исходной навески к массе полученной золы. Параллельно проводили три эксперимента.

2.2 Выделение препарата.

Подготовка сырья состояла из следующих этапов: экстракция сырья смесью этанол-бензол (1:2 по объему) и экстракция холодной водой.

Сырье засыпали в колбу и заливали смесью диоксапа и воды (9:1 по объему) с добавлением соляной кислоты 0,7%. Смесь кипятили в течение 2-х часов. По истечении времени полученный раствор отфильтровывали и фильтрат нейтрализовали бикарбонатом натрия, раствор оставляли на сутки, затем отфильтровывали от осадка. Отфильтрованный раствор упаривали в вакууме до сиропообразного состояния. Полученный таким образом раствор выливали в 1%-ый раствор сульфата натрия, осадок отфильтровывали, промывали дистиллированной водой и высушивали.

Для очищения препарата от примесей его растворяли в небольшом количестве диоксана и высаживали в диэтиловый эфир. Переосаждение проводили три раза. Полученный препарат хранили в эксикаторе над твердой щелочью.

2.3 Исследование химической структуры лигнинов физико-химическими методами.

Элементный анализ выделенных препаратов лигнинов проводили на анализаторе фирмы Hewlett Packard (США).

ИК-спектры снимали с помощью прибора IR prestige 21 фирмы Shimazu (Япония) в таблетках КВг. Обработку спектров проводили по известной методике с применением метода базисной линии и внутреннего стандарта (полоса поглощения 1600 см" 1).

ЯМР-13С-спектры регистрировали в импульсном режиме (спектрометр Bruker АМ-300) с рабочей частотой 75,5 МГц. Ширина спектров 18 000 Гц. Длительность импульса 2 мкс. Интервал между импульсами 4 сек. Растворитель — ДМСО дейтерированный. Концентрация раствора 30%. Добавляли релаксант — трисацетилацетонат хрома, 0,02 моль/л. Число сканов для ДЛ-К — 49 000, для ДЛ-Об — 44 000.

2.4 Исследование химической структуры лигнинов химическими методами.

Определение силънокислых карбоксильных групп. В мерную колбу 25 мл помещали навеску лигнина 40−60 мг, прибавляли 20 мл 0,4 н. Са (СН3СОО)2. Колбу нагревали в течение 30 минут при 85 °C с неплотно закрытой пробкой. Затем колбу закрывали и оставляли на 15 минут для охлаждения. Смесь доводили дистиллированной водой до метки, перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр. Из фильтрата отбирали аликвоту 20 мл и титровали свободную уксусную кислоту 0,05 н. ЫаОН в присутствии фенолфталеина. Параллельно проводили холостой опыт, расчет:

— 0,85−100 =)./¦!, 062 ш0%.

А, А здесь: а — объем 0,05 н. №ОН, израсходованного на титрование пробы, мл. а0 — объем 0,05 н. 1ЧаОН, израсходованный на титрование холостой пробы, мл.

— поправка к титру 0,05 н. №ОН. 1,25 — коэффициент пересчета на полный объем. 0,85 — количество ОН-групп, соответствующее 1 мл 0,05н ШОН, мгА — навеска лигнина, мг. Затем вели пересчет на карбоксильные группы в % по формуле: соон]=Шфоон 1 J м[он} где:

ОН] — содержание в пробе гидроксильных групп, %. М[СООН] ~ молярная масса карбоксильной группы, г/моль. М[ОН] - молярная масса гидроксильной группы, г/моль.

Определение феиолъных гидроксильных групп. Приведенная ниже методика предназначена для определения содержания суммы карбоксильных и фенольных гидроксильных групп. Содержание фенольных ОН-групп определяется по разнице суммы всех кислых групп и карбоксильных групп. Дегазированный дистиллят, необходимый для проведения опыта, получали кипячением с обратным холодильником в течение 2 часов.

В сухую мерную колбу 25 мл помещали навеску лигнина 40−60 мг, прибавляли из микробюретки (защита от С02) точно 5 мл 0,1 н. NaOH и 2 мл этанола. Ставили колбу на 3 минуты в водяную баню, нагретую до 85 °C. К горячему раствору или суспензии прибавляли 1 мл 10% раствора ВаСЬ, закрывали колбу пробкой и оставляли на 15 минут для охлаждения. Затем смесь доводили до метки дегазированной дистиллированной водой (не содержащей ССЬ), перемешивали, быстро выливали в пробирку, закрывали пробкой и центрифугировали в течение 3−5 минут. Затем пипеткой отбирали 20 мл прозрачного центрифугата и выливали его в коническую колбу, в которой предварительно было налито 5 мл 0,1 н. HCl. Прибавляли индикатор. Избыток кислоты оттитровывали из микробюретки 0,1 н. NaOH. Параллельно ставили холостой опыт, расчет:

ОН 6 ](д-^о>/-1>7−1)25−100 ^(а-ао)-/-2,125 1QQ% j4. А где: а — объем 0,1н NaOH, израсходованного на титрование пробы, млао — объем 0,1н NaOH, израсходованного на титрование холостой пробы, мл;

— поправка к титру 0,1н NaOH;

1,7 — количество ОН-групп, соответствующее 1 мл 0,1 н NaOH, мг;

1,25 — коэффициент пересчета на полный объем;

А — навеска лигнина, мг Расчет содержания фенольных гидроксильных групп вели по следующей формуле:

ОН феи=[0Н овщ-[ОН сооп] 52.

При проведении функционального анализа все опыты ставились в трех повторах.

2.5 Гидродинамические методы исследования.

По данным седиментационно-диффузионного анализа определяли молекулярные массы фракций препаратов ДЛ-К и ДЛ-Об из уравнения Сведберга здесь:

5 — коэффициент седиментации;

В — коэффициент диффузии;

1-ур) — архимедов множитель системы полимер — растворитель;

7? — универсальная газовая постоянная;

Ттемпература.

Поступательнаядиффузия. Измерения коэффициентов поступательной диффузии образцов ДЛ-К и ДЛ-Об проводили на аналитической ультрацентрифуге МОМ-3180 при 25 °C. Диффузионную границу образовывали в полиамидной кювете наслаивающего типа, рабочие полости которой имеют секториальную форму. Искусственную границу между раствором и растворителем создавали путем наслоения растворителя на раствор. Коэффициенты диффузии измеряли при.

3 3 концентрациях раствора 3×10″ г/см.

Опыты проводили при скорости вращения ротора 5000 об/мин, интервал между снимками 10 мин. Количество снимков в опыте равнялось пяти. Обработку дифференциальных кривых проводили по стандартному методу максимальной ординаты и площади. Полученные значения принимали за экстраполированные к нулевой концентрации, поскольку концентрационная зависимость коэффициента диффузии, как для лиственных лигнинов, так и для препаратов хвойных лигнинов отсутствует.

Рисунок 4 — Диффузионный профиль фракции № 4 ДЛ-К в ДМФА.

На рисунке 4 показан диффузионный профиль фракции № 4 ДЛ-К в ДМФА. По данным диффузионного профиля для каждой фракции строили зависимости где: — площадь под кривой диффузионного профиляН— максимальная ордината кривой диффузионного профиля-? — время, в которое был сделан снимок.

Б/Н)2, см2.

Рисунок 5 — Зависимость скорости размывания диффузионной границы от времени для некоторых фракций ДЛ-К.

На рисунке 5 приведены зависимости (8/Н)2=:Р (1:). Из этих зависимостей, по отношения тангенса угла наклоняя прямой к 4жР, определяли коэффициенты поступательной диффузии где:

Е — увеличение оптической системы и фотоувеличителя.

Скоростнаяседиментация. Коэффициенты скоростной седиментации измеряли на аналитической ультрацентрифуге МОМ-318С) в двухсекторной полиамидной кювете капиллярного типа, позволяющей проводить опыты с образованием искусственной границы. Опыты о л проводили в ДМФА при концентрациях 3×10″ г/см при скорости вращения ротора 48 000 об/мин, интервал между снимками 10 мин, количество снимков в опыте равнялось пяти.

Цифры на рисунке — номера снимков при проведении опыта. д1пХ.

Рисунок 7 — Зависимость скорости смещения седиментационной границы от времени седиментации для некоторых фракций ДЛ-К.

На рисунке 6 показана седиментограмма фракции № 4 ДЛ-К в ДМФА. По данным еедиментограммы для каждой фракции строили зависимость скорости смещения максимума седиментационной границы от времени седиментации, рисунок 7. Величину коэффициента седиментации Б рассчитывали по отношению тангенса угла наклона прямой А1пх = к а/ (АЫх/А^со2, где: со — угловая скорость вращения ротора центрифуги, х — координата максимума еедиментограммы, А/ - время седиментации.

Определение фактора плавучести. Фактор плавучести (1^р0) или множитель Архимеда — величина, необходимая при определении значений молекулярных масс полимера в седиментационно-диффузионном анализе. Здесь (1-уро) определяли традиционно из пикнометрических измерений. Использовали пикнометр с маркировкой 25 и см, который градуировали по воде (дегазированный бидистиллят). Измерения проводили при температуре 25 °C, значение архимедова множителя определяли из уравнения:

4 ' IV где:

АР=Р-Р0, Р и Р0- масса раствора и растворителя одного объемаАр = р-р0 — разность плотностей раствора и растворителяЖ- массовая доля растворенного образца.

Исследование методом вискозиметрии. Вискозиметрические исследования проводили в капиллярном вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0,56 мм. Измеряли время истечения растворителя (ДМФА) и раствора с разной концентрацией образца. Время истечения.

57 чистого ДМФА составило 51,3 с. Концентрацию варьировали в пределах от 2,5 до 8,5 весовых %. В данной области соблюдаются критерии разбавленности: С[г|] < 1 и Т)0тн > 1,1- Измерения проводили в термостате при температуре 25 °C. По полученным значениям определяли относительную вязкость г оти.

Т0 здесь: х — время истечения раствора, ст0 — время истечения растворителя, с. Из значения относительной вязкости определяли относительное повышение вязкости в присутствии растворенного образца — удельную вязкость.

Луд ~ Лот, ~ 1.

Затем строили зависимость приведенной вязкости г) уд^ (XV — концентрация образца) от концентрации.

Г|Лу, см3/г.

Рисунок 8 — Зависимость приведенной вязкости от весовой концентрации для фракций ДЛ-К.

При экстраполяции приведенной вязкости к нулевой концентрации, рисунок 8, определяли значение приведенной вязкости (предельного числа вязкости) для каждой фракции.

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ЗЛ Исследование химической структуры лигнинов.

Лигнины, как показано в литературном обзоре, относятся к химически неоднородным полимерам, и не исключено, что совершенно одинаковых по химическому строению лигнинов не существует. Детальные исследования лигнинов показывают, что деление лигнинов на гваяцильные и гваяцилсирингильные является недостаточным. Это подтверждается исследованиями японских ученых, которые показали, что лигнины растений можно подразделять на пять-семь типов в соответствие с систематикой растений, причем ими же показано, что существующая хемотаксономическая классификация лигнинов не в состоянии описать всего многообразия существующих лигнинов. Структурные особенности лигнинов связаны не только с композиционным составом макромолекул, но и количественным составом функциональных групп и межмономерных связей. Поскольку поведение лигнинов в процессах химической переработки растительного сырья определяется строением лигнинов, то дальнейшее детальное изучение строения лигнинов различного ботанического происхождения не теряет своей актуальности до настоящего времени.

Далее будут изложены результаты исследования образцов лигнинов, выделенных из стеблей (кочерыжек) капусты Brassica oleraceo (ДЛ-К) и оболочек зерен овса Avena sativa (ДЛ-Об). При обсуждении результатов привлекались также данные по исследованию диоксанлигнина, выделенного из стеблей (соломы) овса Avena sativa (ДЛ-О).

В таблице 14 представлены данные, характеризующие химический состав усредненных структурных фенилпропановых единиц исследуемых образцов. Элементный состав диоксанлигнинов исследуемых травянистых растений свидетельствует о том, что образцы характеризуются высоким содержанием атомов кислорода, что указывает на достаточно большое.