Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм селена

Так же, как и в других научных дисциплинах, результаты исследований, накопленные в различные периоды развития науки о питании (нутрициологии) получали своё теоретическое выражение в виде определенных концепций. В настоящее время в стадии становления находится концепция оптимального питания — система современных представлений науки о питании, основанная на последних достижениях фундаментальных физиолого-биохимических и эпидемиологических исследований и новых научных дисциплин: нутригеномики, протеомики и метаболомики. Продолжая и одновременно развивая основные положения теории рационального питания А. А. Покровского [32] и теории адекватного питания A.M. Уголева [42], концепция оптимального питания предполагает необходимость адекватного обеспечения организма человека как макро, так и микронутриентами и минорными компонентами пищи [40]. В настоящее время существенно расширились представления об эссенциальности для организма человека многих микронутриентов и минорных компонентов пищи, не рассматривавшихся ранее в качестве факторов, необходимых для обеспечения его нормальной жизнедеятельности. Получены убедительные свидетельства их участия в метаболизме, и с позиций доказательной медицины, соответственно, установлено, что при дефиците (недостаточности) этих биологически активных веществ в рационе человека имеет место снижение резистентности к неблагоприятным факторам окружающей среды (феномен маладаптации), формирование иммунодефицитных состояний, нарушение функций систем антиоксидантной защиты, хронизация болезней, повышение риска развития распространенных заболеваний, снижение качества жизни и эффективности лечебных мероприятий [39].

Чрезвычайно важным в плане значения концепции оптимального питания для практического обеспечения здоровья населения является положение о том, что у современного человека имеет место недостаточное поступление с пищей микронутриентов и минорных компонентов пищи вследствие снижения энерготрат и, соответственно, уменьшения общего количества потребляемой пищи. Негативное влияние на обеспеченность населения микронутриентами и минорными компонентами пищи оказывают также новые технологии, используемые в сельском хозяйстве (как в земледелии, так и животноводстве) и современные способы переработки пищевой продукции.

Положение о регулярном потреблении пищевых продуктов, обогащенных микронутриентами, как важнейшем факторе оптимизации питания и здоровья человека является научным обоснованием, во-первых, для обогащения ими продуктов массового потребления для всех групп детского и взрослого населения и регулярно используемых в повседневном питании и, во-вторых, для широкого производства биологически активных добавок к пище (БАД) и специализированных продуктов, используемых преимущественно в профилактическом питании. Недопустимость бесконтрольного обогащения БАД, специализированных продуктов и тем более продуктов массового потребления микронутриентами, вследствие опасности возможных передозировок последних и соответствующего неблагоприятного воздействия их на организм человека, предполагает физиологическое обоснование адекватного и верхнего допустимого уровней их потребления. Это положение концепции оптимального питания реализовано Методическими рекомендациями МР.2.3.1.1915;04 «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ» (утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и введены в действие 02.07.2004 г.). Важно представлять, что все перечисленные в документе природные вещества и соединения характерны для традиционных пищевых продуктов животного и растительного происхождения, однако, их содержание в последних недостаточно высоко. Это обстоятельство в свою очередь определяет необходимость получения новых пищевых источников микронутриентов и других минорных биологически активных компонентов пищи, оценки их безопасности и эффективности. Концепция оптимального питания предъявляет жесткие требования к форме, в которой искомое биологически активное соединение находится в составе нового пищевого источника. Правила соответствия химического состава пищи ферментным взаимоотношениям организма на всех уровнях её ассимиляции относятся и к определенным микронутриентам, в первую очередь эссенциальным микроэлементам (ЭМ). Констатируется целесообразность использования в составе БАД и для обогащения пищевых продуктов органических форм ЭМ, так как на протяжении эволюции человека как вида и в его современной жизни преимущественно органические соединения этих микронутриетов потреблялись и потребляются им в составе растительной и животной пищи [22]. Особенно убедительно, на наш взгляд, этот тезис иллюстрируется на примере селена — микроэлемента, токсичность которого была известна уже очень давно, а представления об эссенциальности берут начало с 1957 года в связи с открытием селенсодержащего фермента антиоксидантной защитыглутатионпероксидазы [7].

Селен относится к микроэлементам, для которых интервал между адекватным и максимально допустимым уровнем потребления сравнительно узок и во многом зависит от того, в какой форме селен поступает в организм. В пищевых продуктах животного и растительного происхождения, практически весь селен представлен в органической форме. При этом, в продуктах животного происхождения преобладает селеноцистеин, а в продуктах растительного происхождения — селенометионин [44]. Однако в достаточно большом количестве БАД отечественного и зарубежного производства в качестве пищевого источника селена используются его неорганические соединения, в основном в виде селенитов и селенатов. Как органические, так и неорганические соединения селена достаточно эффективно всасываются в желудочно — кишечном тракте. При этом селенит и селенат анионы восстанавливаются ферментативным путем до селеноводорода. Возможности утилизации последнего в организме ограничены в количественном отношении, и при поступлении в организм избыточных количеств неорганического селена он может накапливаться в тканях в форме свободного высоко токсичного гидроселенид аниона. В то же время селенометионин и селеноцистеин, наряду с метаболизацией до селеноводорода, утилизируются по иному пути, включаясь в состав селенометионина и селеноцистеина тканевых белков, что существенно повышает значение предельно допустимой концентрации (ПДК) и, соответственно, уменьшает риск неблагоприяного воздействия на организм в случае передозировки селена в этой форме по сравнению с его неорганическими соединениями. Исходя из вышеизложенного, проблема поиска новых пищевых источников органических форм селена и оценки их биологического действия весьма актуальна. Перспективен биотехнологический путь получения пищевых источников этого несомненно эссенциального для организма человека микроэлемента, в частности, использование в качестве «объектов для биотехнологического встраивания» бактерий рода Lactobacillus и микроводоросли Spirulina platensis. В нашей работе предпринята попытка провести исследования, позволяющие оценить возможности использования вышеназванных биоматриц для встраивания селена с целью получения новых пищевых источников этого ЭМ.

Научная новизна.

Оптимизированы условия культивирования биомассы селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и в опытах in vivo охарактеризована биодоступность селена в составе выращенной биомассы.

Впервые при использовании в качестве исходного сырья биомассы селенсодержащей Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) выделен и очищен препарат селенсодержащего фикоцианина. Сравнительными исследованиями in vivo установлена высокая биодоступность селена в составе препарата селенсодержащего фикоцианина.

Впервые получены результаты, свидетельствующие о стимулирующем влиянии препаратов селенсодержащего фикоцианина различной степени очистки на клеточное и гуморальное звенья иммунитета у лабораторных животных (мыши линии DBA и крысы линии Вистар).

При относительно продолжительном пероральном введении препарата селенсодержащего фикоцианина невысокой степени очистки у животных, сенсибилизированных модельным антигеном — куриным овальбумином, усиливался ответ антител класса G, специфичных к этому белку. Показано, что при внутрибрюшинном введении высокоочищенного препарата селенсодержащего фикоцианина имеет место активация лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов перитонеальной полости и повышение фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата.

Практическая значимость.

Экспериментально отработанные оптимальные условия выращивания селенсодержащей биомассы лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) с высоким содержанием селена могут быть использованы при масштабировании процесса для промышленного биотехнологического получения нового пищевого источника этого эссенциального микроэлемента.

Высокоочищенный препарат фикоцианина, выделенный из биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas), может быть использован для получения моноклональных антител к этому белковому пигменту и разработки иммуноферментного метода идентификации Spirulina platensis в составе биологически активных добавок к пище и специализированных продуктов питания.

Установленное в опытах in vivo иммуностимулирующее действие водорастворимого экстракта из биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) при пероральном способе введения свидетельствует о перспективности его использования в составе нового поколения продуктов профилактического питания, повышающих иммунную защиту неспецифическую резистентность организма. Высокая биодоступность селена в составе селенсодержащего фикоцианина определяет перспективность его использования для профилактики селеновой недостаточности.

Цель работы.

Получение и характеристика в опытах in vitro и in vivo новых пищевых источников селена: биомассы селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и препарата селенсодержащего фикоцианина, выделенного из биомассы селенсодержащей Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas).

Основные задачи исследования.

1 .Вырастить в лабораторных условиях биомассу селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) с высоким содержанием этого микроэлемента.

2. Получить высокоочищенные препараты фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина, используя в качестве исходного сырья биомассу Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) и биомассу селенсодержащей Spirulina platensis соответственно.

3. В опытах in vivo провести сравнительную оценку всасывания и депонирования источников органического селена и селенита натрия в печени и семенниках крыс.

4.Охарактеризовать в опытах in vivo иммуномодулирующее действие препаратов фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина при их внутрибрюшинном введении.

5. Исследовать влияние перорального введения водорастворимого экстракта, выделенного из селенсодержащей биомассы Spirulina platensis на гуморальный иммунный ответ у сенсибилизированных животных.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были доложены на Третьем московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), на XI (Гурзуф, 2003), XII (Гурзуф, 2004) и XIII (Гурзуф, 2005) международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» .

Публикации.

По результатам работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах и 7 публикаций в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, заключение, выводы. Указатель литературы содержит 47 отечественных и 131 зарубежный источник. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, включает 14 таблиц и 19 рисунков.

5. ВЫВОДЫ.

Культивированием в средах с различным содержанием селенита натрия экспериментально определены оптимальные условия выращивания селенсодержащей биомассы лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и получен препарат, в котором содержание селена составило 1493 ± 7 мкг/г сухой биомассы.

С использованием в качестве исходного сырья биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) и биомассы селенсодержащей Spirulina platensis выделены и очищены соответственно препараты фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина. Высокоочищенный препарат фикоцианина содержит 90% пигмента. Содержание пигмента в высокоочищенном препарате селенсодержащего фикоцианина 85%, содержание селена — 92±2 мкг/г препарата.

Охарактеризованы всасывание и депонирование селена при его пероральном введении в течение 14 дней крысам линии Вистар в дозе 5 мкг на одно животное в составе биомассы селенсодержащей Spirulina platensis, препарата селенсодержащего фикоцианина, биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum и селенита натрия. Самое высокое содержание селена в сыворотке крови определено для селенита натрия, самое низкое содержание селена в печени установлено для биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum.

При пероральном введении в течение 21 дня крысам линии Вистар биомассы селенсодержащей Spirulina platensis и препарата селенсодержащего фикоцианина, концентрации селена в сыворотке крови были выше, чем при введении этих источников селена в течение 14 дней, достигнув тех же значений, что и для селенита натрия при этом сроке введения. Депонирование селена печенью значимо не различалось для всех трех его источников.

При внутрибрюшинном введении мышам линии DBA высокоочищенный препарат селенфикоцианина повышал их неспецифическую резистентность, активируя лимфоциты и макрофаги перитонеальной полости и, в отличие от фикоцианина, дозозависимо повышал относительное число нейтрофилов. Селенфикоцианин также повышал фагоцитарнюо активность клеток перитонеальной полости относительно двух типов дрожжей Saccharomyces cerevisiae WT и Saccharomyces cerevisiae GPI — мутантов.

Установлено стимулирующее влияние препаратов, содержащих селенфикоцанин, на гуморальный иммунный ответ мышей линии DBA, иммунизированных эритроцитами барана, и крыс линии Вистар, многократно сенсибилизированных овальбумином.

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Основная цель проведенного исследования состояла в оптимизации методов получения в лабораторных условиях новых пищевых источников органических форм селена (перспективных для дальнейшего промышленного масштабирования) и их экспериментальной оценке in vivo и in vitro. Что касается вопроса о том, в составе какого соединения (органического или неорганического) находится селен, то есть определенные основания отдавать предпочтение органическим формам данного микроэлемента, так как в подавляющем большинстве именно эти формы встречаются в продуктах растительного и животного происхождения. Использование неорганических соединений селена (селенитов и селенатов) представляется оправданным в лекарственных формах при наличии риска развития клинических проявлений дефицита этого микроэлемента и необходимости быстрого купирования состояния дефицита. По сравнению с неорганическими солями или окислами органические соединения селена обладают меньшим неблагоприятным побочным действием при возможных передозировках. Следовательно, разработка методов биотехнологического получения новых пищевых источников органического селена, их детальное исследование и характеристика представляются весьма актуальными. В связи с этим большой интерес представляют так называемые биологические «матрицы», при «встраивании» в которые происходит биотрансформация селена, и он переходит из неорганической формы в органическую (селенсодержащие аминокислотыселенометионин и селеноцистеин).

Настоящая работа была посвящена разработке способов получения, а также экспериментальной оценке и сравнительной характеристике биомассы селенсодержащего штамма Lactobacillus plantarum 8RA-3 и препаратов селенсодержащего фикоцианина (с различной степенью очистки) — пигмента, выделенного из обогащенной селеном сине-зеленой микроводоросли спирулины (Arthrospira platensis).

Биомасса селенсодержащих лактобацилл была получена путем культивирования штамма Lactobacillus plantarum 8RA — 3 в жидкой питательной среде с содержанием селена 5 мкг/мл в форме селенита натрия. Эта концентрация была выбрана как наиболее подходящая после проведения серии экспериментов, так как она обеспечивала оптимальное насыщение биомассы лактобацилл данным микроэлементом, его трансформацию в органическую форму и не подавляла роста биомассы. Содержание селена в сухой биомассе лактобацилл было стабильным, воспроизводимым и составило 1493 ± 7 мкг/г, что потенциально более чем достаточно для ее использования в качестве пищевого источника.

Одним из исследованных в данной работе новых пищевых источников селена была биомасса сине — зеленой микроводоросли спирулины платенсис (Arthrospira platensis).

Спирулина относится к царству цианобактерий и имеет современное систематическое родовое наименование Arthrospira sp. [19]. Спирулина способна расти при высоких концентрациях селена, которые, безусловно, летальны для подавляющего числа других прокариотических и эукариотических организмов, и накапливать селен в составе биомассы в высоких концентрациях [33, 34].

Важной особенностью спирулины является также высокая пищевая ценность ее биомассы. Содержание белка в высушенной биомассе спирулины может достигать, в зависимости от вида, штамма и условий культивации, от 50 до 75% [64]. Биомасса спирулины может быть также нутритивно значимым источником каротиноидов, фикоцианинов, витаминов группы В [103 — 105]. Усвояемость перечисленных нутриентов из спирулины достаточно высока ввиду того, что этот микроорганизм, в отличие от эукариотических микроводорослей (в частности, хлореллы), пищевых дрожжей и лактобацилл, лишен плотных неперевариваемых клеточных оболочек [19, 58].

Использованная в данной работе сухая биомасса селенсодержащей спирулины, получена биотехнологическим методом культивирования штамма Spirulina platensis (штамм. Nordst. Geitl. Ippas.(per. № В — 437) в присутствии в ростовой среде селенита натрия в регулируемых условиях теплиц открытого типа. Содержание селена в сухой биомассе составило 512±9мкг/г. Согласно [66,67] биодоступность селена в составе селенсодержащей спирулины может быть существенно увеличена путем водной экстракции. Поэтому представлялось целесообразным разработать метод получения водорастворимого селенсодержащего препарата из биомассы обогащенной селеном спирулины платенсис, содержащего, помимо селена, фикоцианинпигмент, обладающий по данным литературы выраженным иммуномодулирующим действием.

Для этих целей вначале был модифицирован метод получения фикоцианина из спирулины, впервые примененный для выделения этого фотосинтетического пигмента из цианобактерии Schizotrix sp. 157].

Выделение включало стадии водной экстракции, сульфатноаммонийных фракционирований, хроматографии на колонках с ДЭАЭ-сефацелем и суперозой-12. В результате был выделен фикоцианин необогащенной селеном спирулины со степенью очистки в 31 раз с выходом 19,6%. При этом содержание селена в нем составило 1,20±0,02мкг/г.

Этот метод выделения был сравнительно успешно использован для получения из биомассы селенсодержащей спирулины двух препаратов селенсодержащего фикоцианина: его водного раствора со степенью очистки в 2,1 раз и выходом 28% и высокоочищенного препарата (степень очистки в 27 раз с выходом 4%. Содержание селена составило в первом случае 4 мкг/мл, во втором — 92±2 мкг/г.

Поскольку фикоцианин не принадлежит к специфическим селенопротеинам, и в его гене отсутствует кодирующий включение селенсодержащей аминокислоты кодон ТГА, включение селена в состав этого белка по ко-трансляционному механизму не представляется возможным. Тем не менее, значительная степень обогащения ФЦ селеном указывает на возможность встраивания селенсодержащих аминокислот в этот полипептид, возможно, путём замещения соответствующих серусодержащих аминокислот. В ходе хроматографического фракционирования по молекулярным массам на «Суперозе 12» препарата, полученного после очистки сульфатноаммонийной фракции селенспирулины на ДЭАЭ-сефацеле (препарат фикоцианина с кратностью очистки в 24,7 раз) было обнаружено, что собранные фракции соответствуют молекулярным массам 70 — 110 кД, что совпадает с литературными данными о молекулярной массе фикоцианина. Содержание селена в собранных фракциях в пересчете на сухую массу составило 100 мкг/г, что близко к полученному ранее результату для селенфикоцианина. Эти данные свидетельствуют о том, что селен по всей вероятности включается в состав фикоцианина в виде селенсодержащих аминокислот.

Для обоснования заключения о перспективности использования исследуемых в нашей работе новых источников селена представлялось необходимым провести сравнительную оценку их всасывания и ретенции в опытах in vivo.

В ходе эксперимента крысы линии Вистар за исключением животных контрольной группы получали вышеперечисленные источники селена в виде добавки к стандартному рациону в течение 14 или 21 дня. Доза селена во всех группах составила 5 мкг на 1 животное в день. Содержание белка и общая калорийность всех селенсодержащих добавок были пренебрежимо малы (<1%) в сравнении с суточной калорийностью и белком стандартного рациона.

В ходе всего периода кормления животные всех групп нормально росли и их средняя масса, а также массы исследованных органов как при 14-, так и при 21-дневной продолжительности эксперимента достоверно не различались, что свидетельствует о нутритивной адекватности рациона.

На основании данных по содержанию селена в сыворотке крови и органах крыс, получавших этот микроэлемент в составе исследуемых пищевых источников и селенита натрия, оценивали его всасывание. Среднее содержание селена в сыворотке крови животных, получавших селенсодержащую спирулину в течение 14 дней, практически не отличалось от данного показателя контрольной группы. Животные групп, получавших белковый препарат селенсодержащего фикоцианина (со степенью очистки в 2,1 раз), характеризовались достоверно повышенным в сравнении с контролем уровнем селена в сыворотке крови, однако этот показатель у них был достоверно ниже, чем у группы, получавшей селенит натрия.

Содержание селена в печени у крыс, получавших биомассу селенсодержащей спирулины, было достоверно выше, чем в контрольной группе, и не отличалось от данного показателя у животных, получавших селенит натрия. Близкое значение среднего уровня селена обнаружено и в печени животных, получавших белковый препарат селенсодержащего фикоцианина. Самое же низкое значение депонированного печенью селена имело место для биомассы селенсодержащих лактобацилл.

Средние уровни селена в семенниках подопытных животных, как в контрольной, так и во всех опытных группах были близки по величине и достоверно не различались между собой (Р>0,1 во всех случаях).

После 21 дня приема животными тех же пищевых источников селена его средние концентрации в сыворотке крови крыс всех опытных групп были достоверно выше контроля (Р<0,05), но не различались между собой (Р>0,1) во всех случаях. Среднее содержание селена в печени животных, принимавших селенсодержащую спирулину, при расчете на орган достоверно не отличалось от контроля (Р>0,1), однако при расчете на кг ткани печени показатель опытной группы был достоверно выше контрольного (Р<0,05). У животных, получавших белковый препарат селенсодержащего фикоцианина и селенит натрия, средние концентрации селена в печени достоверно отличались от контроля (Р<0,05), но не различались между собой (Р>0,1). При определении селена в семенниках подопытных животных была обнаружена та же картина, что и у крыс, получавших испытуемые пищевые источники в течение 14 дней.

Концентрации селена в этих органах, как крыс контрольной группы, так и всех опытных групп были близки по значениям и достоверно не различались между собой (Р>0,1 во всех случаях).

Таким образом, очевидно, что наиболее сбалансированное воздействие на тканевые депо селена оказывает белковый препарат селенсодержащего фикоцианина. У крыс, получавших данный пищевой источник селена, его относительное содержание в сыворотке крови близко к таковому в печени и семенниках. У группы животных, получавших биомассу селенсодержащей спирулины, процентное содержание селена в сыворотке крови меньше, чем у других опытных групп и близко к данному показателю контрольной группы, однако содержание селена в печени довольно высоко, что также свидетельствует о способности данной органической формы селена к тканевому депонированию.

У группы животных, получавших селенсодержащие лактобациллы, относительное содержание селена в сыворотке крови оказалось близко к данному показателю у крыс, получавших селенсодержащий белковый препарат фикоцианина. Однако содержание селена в печени оказалось на уровне контроля.

Величина безразмерного отношения концентраций общего селена в ткани печени и сыворотке крови крыс групп, получавших исследуемые пищевые источники селена в течение 14 дней, может рассматриваться как качественный критерий эффективности процессов тканевого депонирования селена, поскольку уровень селена сыворотки крови, как известно из литературы [39,154,159], коррелирует с его содержанием в лабильном пуле специфических селенопротеинов плазмы (в основном, глутатионпероксидазы типа III и селенопротеина Р), тогда как уровень селена печени может рассматриваться как показатель его консервативного тканевого депо [39,154].

При сравнительном анализе указанного показателя было обнаружено, что он наиболее высок у группы, получавшей селенсодержащую спирулину, и составляет 1,6.У группы крыс, получавших селенсодержащий белковый препарат фикоцианина, рассматриваемый показатель был равен 1,4, а получавшей селенит натрия -1,5. Все три этих величины достоверно не различались между собой, указывая на приблизительно одинаковую эффективность тканевого депонирования селена из этих трех источников. Однако у крыс, получавших биомассу селенсодержащих лактобацилл, рассматриваемое отношение не отличалось от величины для контрольной группы (0,97 и 0,99 соответственно).

Представленные данные свидетельствуют о том, что показатели ассимиляции селена пищи существенно различаются в зависимости от источника этого микроэлемента. Во всех случаях биодоступность селена в составе неорганической соли оказывается максимальной, что, однако, не может рассматриваться как аргумент в пользу использования этой добавки в продуктах питания и в составе БАД ввиду ее высокой потенциальной токсичности. Среди органических форм селена наибольшей биодоступностью и наибольшей сбалансированностью в распределении по органам и тканям обладает селен в составе селенсодержащего препарата фикоцианина. Его преимущество над цельной биомассой селенсодержащей спирулины проявляется в наибольшей степени при относительно коротком (14 дней) курсе приема. При более длительном приеме (21 день) показатели биодоступности селена из спирулины и селенсодержащего препарата фикоцианина практически выравниваются. Биодоступность селена из образца биомассы селенсодержащих лактобацилл, судя по показателю его уровня в печени, оказывается существенно ниже, чем у других источников органического селена. Ввиду этого возможности использования селенсодержащих лактобацилл в составе специализированных продуктов и БАД (в том числе пробиотического действия) не вполне ясны и требуют дополнительного изучения. Одновременно полученные данные указывают на хорошие перспективы внедрения в пищевую промышленность процессов глубокой технологической переработки обогащенной микроэлементами спирулины с получением из нее обогащенных фикоцианином фракций. Что же касается использования добавки неорганического селена, то такое использование, как уже отмечалось, может быть, на наш взгляд, оправдано только в лекарственных формах при клинических проявлениях дефицита этого микронутриента.

Можно ожидать эффективного использования в качестве нового пищевого источника микронутриента (особенно для целей профилактического и возможно лечебного питания) полученного в нашем исследовании водорастворимого препарата с высоким содержанием этого микроэлемента и фикоцианина, выделенного из биомассы селенсодержащей спирулины, исходя из достаточно многочисленных научных публикаций о широком спектре биологической активности каждого из вышеназванных соединений [39,136 139,141,143,144]. Фикоцианину, как отмечалось нами ранее в обзоре литературы, свойственно выраженное иммуномодулирующее действие. В наших экспериментах in vivo при введении внутрибрюшинно мышам линии DBA различных доз высокоочищенного (содержание фикоцианина 90%) препарата пигмента, выделенного из биомассы спирулины, было охарактеризовано его иммуностимулирующее действие на животных. Фикоцианин повышал относительное число перитонеальных макрофагов в 1,8 раза (максимально эффективная доза 0,5мкг/г массы тела), оказывая, однако при этом некоторое ингибирующее влияние на нейтрофилы перитонеального экссудата.

В следующей серии экспериментов животным также внутрибрюшинно вводились различные дозы высокоочищенного препарата селенсодержащего фикоцианина, выделенного из биомассы селенсодержащей спирулины. Как и для препарата фикоцианина оценивалось влияние препарата селенсодержащего фикоцианина на лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы перитонеальной полости. Максимально эффективная доза, то есть та, при которой введение мышам селенсодержащего фикоцианина максимально увеличивала число лимфоцитов перитонеальной полости, была равна 1,0мкг/г массы тела. Это значение существенно ниже соответствующей величины, определенной при введении фикоцианина, как такового. Повышение вводимой дозы селенсодержащего фикоцианина до 5мкг/г массы тела не приводило к дальнейшему возрастанию числа перитонеальных лимфоцитов, а напротив имело место снижение их числа до контрольных значений. Эффект активирующего воздействие селенсодержащего фикоцианина на макрофаги имел место, хотя и был менее выражен по сравнению с собственно фикоцианином: число перитонеальных макрофагов повысилось всего в 1,2 раза. Максимально эффективная доза была такой же, как и для фикоцианина — 0,5 мкг/г массы тела.

Однако влияние препарата селенсодержащего фикоцианина на I перитонеальные нейтрофилы отличалось от влияния препарата фикоцианина на эти клетки, представляющие важное звено в системе неспецифической резистентности организма. Если фикоцианин снижал относительное число нейтрофилов перитонеального экссудата, то сочетание селена и фикоцианина в препарате селенсодержащего фикоцианина оказывало стимулирующее дозозависимое влияние на эти клетки и повышало их число, начиная с дозы 0,5 мкг/г массы тела, пропорционально величине вводимой дозы. Увеличение в перитонеальной полости животных количества как макрофагов, так и нейтрофилов при введении им селенсодержащего препарата фикоцианина, увеличивало фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата, что было продемонстрировано в опытах in vitro с использованием в качестве фагоцитируемого материала двух типов дрожжей с различным липидным составом цитоплазматической мембраны (Saccharomyces cerevisiae WT и Saccharomyces cerevisiae GPI). Несмотря на то, что различия в липидном составе мембран фагоцитируемых объектов влияют на их распознавание перитонеальными клетками, селенфикоцианин повышал фагоцитирующую активность клеток перитонеального экссудата независимо от вида дрожжей. Дозозависимое пропорциональное повышение активности наблюдалось, начиная с дозы 0,25мкг/г массы тела.

Таким образом, результаты, полученные в вышеперечисленных исследованиях, свидетельствуют об активирующем влиянии как фикоцианина, так и селенфикоцианина на лимфоциты и макрофаги перитонеальной полости при внутрибрюшинном введении высокоочищенных препаратов. На преимущества в плане возможного использования селенсодержащего фикоцианина как иммуностимулятора, по сравнению с фикоцианином как таковым, указывают данные сравнительного исследования влияния этих препаратов на нейтрофилы. Выраженное стимулирующее действие селенсодержащего фикоцианина на нейтрофилы при наличии некоторого ингибирующего воздействия собственно фикоцианина, позволяет предположить, что стимулирующий нейтрофилы эффект является следствием появления в составе препарата органической формы селена, хотя это предположение нуждается в дополнительной проверке. Стимулирующее влияние высокоочищенного селенфикацианина на гуморальное звено иммунитета установлено в опытах по определению дозозависимого действия препарата на число антителообразующих клеток селезенки мышей, которых иммунизировали эритроцитами барана. Иммуностимулирующее действие препарата, выделенного из селенсодержащей спирулины и содержащего в своем составе селен и фикоцианин (в количествах 4 мкг/мл и 113 мг/мл, соответственно) также было исследовано в опытах in vivo при его длительном пероральном введении крысам линии Вистар, сенсибилизированным модельным антигеном — куриным овальбумином. Уровень антител к куриному овальбумину также был достоверно и значительно выше в сыворотке крыс, сенсибилизированных этим антигеном, по сравнению с контрольной группой сенсибилизированных животных, получавших стандартный рацион вивария. Полученный результат указывает на иммуностимулирующее влияние перорального приема данного препарата на гуморальный иммунный ответ.

Подводя итоги проведенных исследований и анализируя полученные результаты, можно сделать следующее заключение. Оптимизация условий культивирования биомассы лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) в среде, обогащенной селенитом натрия позволила получить препарат.

Lactobacillus plantarum, в котором содержание селена составило 1500 мкг/г сухой биомассы.

С использованием в качестве исходного сырья биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) и биомассы селенсодержащей Spirulina platensis были выделены и очищены препараты фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина. Охарактеризованы всасывание и депонирование селена печенью и семенниками при его пероральном введении в течение двух сроков (14 или 21 дня) крысам линии Вистар в дозе 5 мкг на одно животное в составе биомассы селенсодержащей Spirulina platensis, водорастворимого экстракта, выделенного из селенсодержащей биомассы Spirulina platensis, биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum и селенита натрия. Самое низкое значение содержания селена в сыворотке крови после 14 дней перорального введения определено для биомассы селенсодержащей Spirulina platensis. Самое низкое содержание селена в печени при этом же сроке установлено для биомассы селенсодержащих Lactobacillus plantarum.

При пероральном введении в течение 21 дня селена в составе биомассы селенсодержащей Spirulina platensis и водорастворимого экстракта, выделенного из селенсодержащей биомассы Spirulina platensis, его содержание в сыворотке крови было выше по сравнению с 14 днями и достигло тех же значений, что и для селенита натрия. Депонирование селена печенью значимо не различалось для всех трех его источников. В семенниках селен не накапливался независимо от того, в составе какого препарата он находился. Установлено иммуностимулирующее действие высокоочищенных препаратов фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина при их внутрибрюшинном введении мышам линии DBA, однако в отличие от фикоцианина, оказывающего некоторое ингибирующее влияние на перитонеальные нейтрофилы, селенсодержащий фикоцианин оказывал стимулирующее воздействие на эти клетки.

Выявлено стимулирующее влияние на гуморальный иммунный ответ животных (крыс линии Вистар) водорастворимого экстракта, выделенного из селенсодержащей биомассы Spirulina platensis.