Особенности иммунного, цитокинового и оксидантного статуса у больных нозокомиальной пневмонией на фоне перитонита

Актуальность проблемы:

Проблема госпитальных (нозокомиальных) пневмоний остается одной из ведущих в современной пульмонологии, что связано не только с высокой заболеваемостью и летальностью, длительностью нахождения больных на лечении, огромным экономическим ущербом, но и серьезностью прогноза [6,138,140].

В структуре госпитальных инфекционных осложнений НП являются вторыми по частоте и составляют 15−18%, при этом характеризуются высокой летальностью в 33−70% случаев [27]. К факторам риска развития НП относят неполноценную антибактериальную терапию, наличие внелегочных инфекций, дыхательную недостаточность, пожилой возраст, иммунодепрессию, хронические заболевания, хирургические вмешательства, госпитализацию в отделение интенсивной терапии [8,34,36,47]. Особенно остро проблема НП состоит в отделении интенсивной терапии хирургического профиля. По данным многочисленных авторов пациенты отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) представляют наиболее угрожаемую группу в отношении риска развития нозокомиальной пневмонии [39,48,62,72,83]. В то время как в отделении общего профиля частота развития НП не превышает 0,5−0,7%, в ОРИТ этот показатель по разным данным составляет от 15 до 40% [62,90]. Легкие в 65,3% случаев вовлекаются в синдром полиорганной недостаточности, развивающийся при распространенном гнойном перитоните. Развитие НП у 63,7% пациентов с гнойно-воспалительными очагами в брюшной полости позволяет считать нозокомиальную пневмонию ситуационной спутницей абдоминального сепсиса [72,209]. Смертность, связанная с пневмонией, особенно высока, если имеет место бактериемия или этиологическим агентом являются микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa или виды Acinetobakter [141].

Важной патогенетической особенностью развития НП является формирование иммунодефицита, в основе которого лежат нарушения во всех системах специфической и неспецифической защиты организма [3,64,65,196]. Бактериальным токсином активируются моноциты, макрофаги, что влечет за собой выброс большого количества медиаторов, в первую очередь цитокинов, активацию кининовой системы, комплемента, коагуляции и др. 100].

Дисбаланс в системе оксидантыантиоксиданты способствует развитию «окислительного стресса», приводящего к активации ПОЛ биологических мембран, нарушению структурной целостности, функции клетки, а затем их разрушению и гибели [133]. Активация свободнорадикального окисления способна вызвать повреждение легочных структур и нередко является ведущим звеном в патогенезе заболеваний бронхолегочной системы [82,87,197]. Острые повреждения легких, развивающиеся на фоне метаболических нарушений и вторичных иммунодефицитных состояний (в том числе и в послеоперационном периоде) ухудшают прогноз и создают угрозу жизни пациента.

Однако, до настоящего времени многие вопросы патогенеза нозокомиальных пневмоний у больных с перитонитом остаются неясными [72,108,211]. Изучение механизмов их развития на биохимическом, молекулярном уровнях в клинике и эксперименте, крайне важны для обоснованной патогенетической терапии.

За последнее десятилетие произошли значительные успехи в понимании патофизиологии и лечении больных нозокомиальной пневмонией, однако остаются открытыми вопросы целесообразности применения иммуномодуляторов у больных с НП [67,69], развившейся на фоне разлитого перитонита.

В середине 80 -х годов в России академиком Р. В. Петровым и его учениками была сформулирована концепция иммунокорригирующей терапии и иммунореабилитации, как нового направления в медицине [131]. Современная иммунокорригирующая терапия возлагает большие надежды в лечении бронхолегочной патологии на медиаторы иммунной системы, которые являются естественными продуктами, обеспечивающими ключевые этапы развития и функционирования иммуннокомпетентных клеток. Рекомбинантный ИЛ-2 — «Ронколейкин» обладает иммуномодулирующим действием, направленным на усиление противобактериального, противовирусного, противогрибкового и противоопухолевого иммунного ответа и является высокоэффективным препаратом при лечении иммуносупрессий различной этиологии [67,91]. Клиникоэкспериментальная оценка механизмов его действия и эффективности у больных с нозокомиальной пневмонией на фоне острого перитонита, позволит оптимизировать лечении данной категории пациентов.

Проведение комплексных исследований, направленных на решение данных проблем, представляется весьма важным и актуальным для науки и практического здравоохранения.

Цель исследования:

Охарактеризовать иммуно-биохимическое особенности течения нозокомиальной пневмонии, развившейся у больных на фоне перитонита и дать экспериментальное обоснование цитокинотерапии рекомбинантным ИЛ-2 в комплексном лечении.

Задачи исследования:

1. Изучить некоторые механизмы патогенеза экспериментального перитонита и исследовать корригирующее действие рекомбинантного ИЛ-2 на показатели фагоцитоза и уровень оппозитных цитокинов.

2. Изучить уровень цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12) в сыворотке крови больных с перитонитом и с НП на фоне перитонита.

3. Исследовать основные показатели иммунной системы: Влимфоциты (CD22+) — Т-лимфоциты (CD34) и их субпопуляции (CD4+, CD84) — натуральные киллеры (С01б+) — маркеры активации иммунокомпетентных клеток (СБ 25+, СБ 95+) и СБ 54+ - рецепторы молекулы адгезии и показатели фагоцитоза.

4. Изучить интенсивность продукции оксида азота в различных биологических субстратах (кровь, конденсат выдыхаемой влаги — КВВ, моча) у больных с перитонитом и с НП на фоне перитонита.

5. Исследовать показатели перекисного окисления липидов в КВВ и показатели антиоксидантной системы легких у больных обследуемых групп.

Научная новизна исследования:

В результате выполненных исследований впервые произведена комплексная оценка иммунной, цитокиновой и антиоксидантной систем у больных с НП на фоне перитонита.

Проведенный мониторинг ИЛ-8, ИЛ-12р40, ИЛ-12-р70 и ИЛ-10, позволил расширить представление о функционировании цитокиновой сети и установить, что у пациентов дисбаланс в системе цитокинов, служит критерием тяжести течения перитонита.

Впервые изучены особенности нарушений функционирования иммунной системы в комплексе с изменениями системы ПОЛ-АОЗ легких у пациентов с НП и без, на фоне перитонита.

Впервые проведенное динамическое определение содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови, КВВ и моче у больных НП развившейся на фоне перитонита свидетельствует о развитии системного воспалительного ответа и может служить дополнительным критерием прогнозирования дальнейшего течения болезни.

Впервые изучена сопряженность, комплекса биохимических маркеров воспаления и изменения цитокинового статуса, разработаны иммунобиохимические критерии оценки степени тяжести и прогноза этих состояний.

Впервые, на модели острого перитонита у мышей, показан корригирующий эффект рекомбинантного ИЛ-2 введеного параперитониально в ранние сроки на локальный и системный уровень продукции ИНФу и ИЛ-10 и показатели неспецифической резистентности.

Практическая значимость работы:

Экспериментально показана способность рекомбинантного ИЛ-2, влиять на фагоцитарную активность и кислородзависимые механизмы бактерицидности нейтрофилов, усиливая их не только непосредственно в очаге воспаления (перитониальном смыве), но так же в крови и легких, способствуя активации компонентов неспецифической иммунорезистентности, увеличивая резервные возможности, опосредующие локальную защиту. Выявлено его влияние на продукцию оппозитных цитокинов локально и системном уровне, проявляющееся сдерживанием продукции ИНФ-у и усилением выработки противоспалительного ИЛ-10 при введении внутрибрюшинно через 12 часов.

На основании подробной иммуно-биохимической характеристики разработаны дополнительные оценки степени тяжести перитонита и развития нозокомиальной пневмонии у данной категории пациентов.

По материалам диссертации оформлены методические рекомендации: «Состояние системы нейтрофильных фагоцитов и влияние рекомбинантного ИЛ-2 на механизмы фагоцитарно-клеточной защиты в модели экспериментального перитонита».

Апробация.

Основные результаты работы были представлены на научных конференциях и симпозиумах международного, российского и регионального уровня: X и XI Российско-Японских Международных Симпозиумах Медицинского Обмена (Якутск, 2003; Ниигата, 2004), Международном форуме молодых ученых и студентов (Анталия, 2004), V Международном Конгрессе Молодых Ученых «Науки о человеке» (Томск, 2004), IX международном конгрессе по клинической патологии (Таиланд, 2004),.

II Всемирном конгрессе по иммунологии и аллергии (Москва, 2004), International Conference on Pharmocology (Харбин, 2005), European Respiratory Society Annual congress (Копенгаген, 2005).

Объедененном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), II конференции Российской Академии наук (Греция, 2004), Ш-й Всероссийской университетской научно-практической конференции (Тула, 2003), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), Конференции студентов и молодых ученых «Научное студенческое общество и современность» (Анталия, 2004), V и VI Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2004, 2005), Заочной электронной конференции РАН и журнала «Фундаментальные исследования» (www. rae.ru, 2005), Научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2005), X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2005).

Объем и структура диссертации.

Материал диссертации изложен на 167 страницах машинописного текста, проиллюстрирован 27 таблицами и 9 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, собственных исследований, заключения, общих выводов, рекомендаций практическому здравоохранению, указателя литературы (142 отечественных и 90 иностранных источников).

выводы.

1. В эксперименте установлен регуляторный эффект рекомбинантного ИЛ-2 на фагоцитарно-клеточные механизмы. При введении рИЛ-2 повышается фагоцитарная активность и поглотительная способность нейтрофилов крови, перитониального экссудата и клетках гомогенизата легких. Увеличение, резервных возможностей нейтрофилов зависит от сроков введения рИЛ-2. При раннем его включении в терапию возрастает фагоцитарный резерв клеток перитониального экссудата.

Введение

рИЛ-2 через 12 часов после заражения обеспечивает увеличение резервных возможностей фагоцитов ткани легких.

2. Установлено влияние рИЛ-2 на уровень прои противовоспалительных цитокинов на 3 сутки острого воспалительного процесса в брюшной полости экспериментальных животных: при его применении происходит снижение уровня ИНФ-у в крови и нарастание его секреции в очаге воспаления, а при введении через 12 часов — и в ткани легких. На этом фоне установлена активация синтеза ИЛ-10 как локально, так и в системном кровотоке, что обеспечивает включение механизма противовоспалительного ответа.

3. У больных выявлены дефекты фагацитарноклеточной защиты, характеризующиеся низкой поглотительной способностью нейтрофилов, истощением кислородозависимых механизмов бактерицидности. Дефицит фагоцитоза наиболее выражен при нозокомиальной пневмонии развившейся на фоне перитонита. Низкий уровень фагоцитарного резерва с выраженностью степени интоксикации отражают депрессию клеточной защиты. Проведенный корреляционный анализ показателей фагоцитарной активности, НСТтеста и уровня сывороточного ИЛ-8 позволил выявить, что при среднетяже-лом течении перитонита в динамике болезни уровень нейтрофильного хемо-аттрактанта сопряжен с количественными показателями фагоцитарной реакции и НСТ-теста, что отражает его активирующее влияние, однако обратная связь ИЛ-8 и фагоцитарного резерва свидетельствуют об истощении резервно ных возможностей фагоцитов. У пациентов с тяжелым течением перитонита, в том числе и с НП, регистрировалось разобщение функции ИЛ-8 и фагоцитарной активности, что подтверждает дозощависимые эффекты ИЛ-8 и позволяет констатировать негативное влияние гиперпродукции данного цито-кина на фагоцитарную систему.

4. У больных перитонитом установлен вторичный иммунодефицит, характер и выраженность которого зависят от тяжести течения заболевания.

У больных со среднетяжелым течением перитонита в дебюте заболевания выявлена недостаточность СБЗ+ и СБ4+ на фоне компенсаторного нарастания цитотоксических клеток, В-лимофоцитов и маркеров их активации, в динамике уровень Т-хелперов увеличивается, снижается степень напряженности функционирования клеточного иммунитета.

При тяжелом течении перитонита установлен дефицит СБЗ+, СБ4+ и С08+ клеток и существенное снижение коэффициента СБ4+/ СБ8+ при активации других показателей иммунного статуса, нарастание СБ95+ и СБ54+ клеток, и тенденция к увеличению основных популяций Т-лимфоцитов в динамике.

При НП на фоне перитонита выявлен глубокий структурный иммунодефицит, усугубляющийся в течении болезни.

5. При анализе цитокинового профиля установлено, что у пациентов с НП уже в дебюте болезни регистрируется дефицит ИЛ-12р70 и менее выраженное нарастание ИЛ-12р40, чем у больных других групп, а так же снижение величины коэффициента соотношения ИЛ-12р40 / ИЛ-12р70 и минимальный уровень ИЛ-10 к 5−7 дню заболевания.

При среднетяжелом течении перитонита уровень противовоспалительных повышается максимально к концу первой недели болезни при минимальном увеличении коэффициент соотношения ИЛ-8 / ИЛ-10 в динамике.

У больных с тяжелым течением перитонита уже в дебюте заболевания одновременно максимально нарастает уровень ИЛ-8 и ИЛ-10 с превалированием в динамике нарастания уровня провоспалительных цитокинов.

6.Высокий уровень метаболитов оксида азота в первые дни заболевания в сыворотке крови, моче и конденсате выдыхаемой влаги с нарастанием в динамике у больных с НП, развившейся на фоне перитонита, свидетельствует о развитии системного воспалительного ответа. Установлена взаимоинду-цирующая роль ИЛ-8 и N0. Корреляционные взаимосвязи тяжести течения перитонита и N0 свидетельствуют о том, что определение метаболитов N0 может служить дополнительным критерием тяжести заболевания.

7.У больных с НП, развившейся на фоне перитонита, интенсификация процессов ПОЛ в КВВ характеризуется увеличением как резервных липидов, так и мембранных фосфолипидов. На этом фоне выявлено истощение в системе антирадикальной защиты легких, характеризуя глубокие метаболические нарушения.

Рекомендации для внедрения результатов исследований в медицинскую науку и практическое здравоохранение:

1. Выявленная ведущая роль иммунных нарушений в патогенезе нозокомиальной пневмонии, проявляющаяся дисбалансом про-и противовоспалительных цитокинов, выраженным дефектом фагоцитарноклеточной защиты при мониторинге позволяет прогнозировать течение заболевания.

2. Дополнительным диагностическим и прогностическим критерием течения заболевания является мониторинг уровня активных метаболитов N0 в сыворотке крови, КВВ и моче.

3. Целесообразно применение антиоксидантов для коррекции метаболических нарушений в легких у больных.

4. Учитывая экспериментально выявленные эффекты усиления фагоцитарной активности нейтрофилов и эффекты активации противовоспалительного ответа не только локально, но и в системном кровотоке при параперитониальном введении рекомби-нантного ИЛ-2 животным, не исключается возможность применение его в ранние сроки заболевания, для коррекции течения абдоминального сепсиса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Несмотря на очевидный прогресс медицины в углублении знаний и поиске новых эффективных механизмов управления воспалительными процессами при пневмонии, пневмония является одной из самых распространенных болезней современного общества. В России регистрируется до 687 тысяч заболеваний пневмонией в год. По оценке А. Г. Чучалина в последние годы в нашей стране наблюдается тенденция к дальнейшему росту пневмонии [139,140].

Нозокомиальная пневмония занимает 2-е место в структуре госпитальных инфекционных осложнений и составляет 15−18% [90,108,140]. По данным многочисленных исследований пациенты отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) представляют наиболее угрожаемую группу в отношении риска развития нозокомиальной пневмонии [8,27,37,64,83].

Многоцентровое исследование EPIC (Europian Prevalence of infection in Intensive Care, 1992 г) показало, что 46,9% всех инфекционных осложнений составляют пневмонии. При распространенных формах острого перитонита НП развивается в 57−63% случаев [27,28,55]. Летальность при НП колеблется от 20% до 50% [64,83,90].

Хирургическая операция, и ее составляющие (предоперационный стресс, анастезия, хирургическое вмешательство, кровопотеря, переливание алло-генной крови, иммунотоксическое действие лекарственных препаратов, па-рантеральное питание и др.) вызывают изменения практически всех компонентов иммунной системы, что является причиной развития послеоперационных инфекционных осложнений [11,46,60]. Легкие в 63,7% случаев вовлекаются в синдром полиорганной недостаточности, развившейся при распространенных формах перитонита [39]. Нами в литературном обзоре, был отмечен целый ряд факторов, увеличивающих риск развития НП в отделении реанимации и интенсивной терапии [23,27,37,64].

Существенную роль в развитии патологического процесса в легких играет состояние защитных свойств слизистых оболочек дыхательных путей и нарушение функций эффекторных механизмов иммунной системы 75,83,86, 90,108].

Воспалительный процесс сопровождается локальной аккумуляцией фагоцитирующих клеток, активацией их кислородного метаболизма и увеличению продукции свободнорадикальных форм кислорода, местному усилению процессов перекисниго окисления липидов (ПОЛ) [19,82,87,108]. При физиологическом процессе эта реакция безусловно полезна, неблагоприятное же течение вызвает повреждение тканей, приобретая черты воспалительного процесса с избыточным образованием АФК [15,17,1,8,18,25]. Последние приводит к нарушению продукции цитокинов иммунокомпетентны-ми клетками к их постоянному синтезу и истощению, что нарушает экспрессию молекул межклеточной адгезии на поверхности активированных макрофагов, негативно влияя с одной стороны на антигенпредставляющую стадию иммунного ответа [33,75], с другой стороны — недостаток цитокинов (ФНОа и ИЛ-8) приводит к нарушению индукции энзимных легочных антиоксидан-тов [18,40].

Цитокины включаются во все звенья воспаления и иммунного ответа [56,73,125], они регулируют миграцию клеток в очаг воспаления, их активацию и превращение в эффекторные клетки [127,128,130,136].

В развитии воспалительной реакции, по мнению многих авторов, ведущая роль принадлежит не только цитокинам, но и медиаторам воспаления, ведущее место среди которых отводится оксиду азота [30,47,60]. Пожалуй, ни одно из достижений фундаментальной биологии не нашло столь быстрого приложения к практической медицине, как результаты исследования биологической роли N0 [76,77], который синтезируется эндотелием сосудов, лейкоцитами и участвует в регуляции гемодинамики, центральной и вегетативной нервной системы [78,85,103]. Повышение продукции N0 под влиянием высокого содержания эндотоксинов и цитокинов усиливает аутодеструктив-ное, повреждающее действие последних (дезорганизацию функции иммунной системы в целом), способствует развитию тяжелой системной реакции организма на воспаление [60,103].

Учитывая это, представлялось обоснованным изучение уровня и динамики некоторых факторов неспецифической защиты организма — количественных и качественных показателей фагоцитоза, уровня и динамики стабильных метаболитов оксида азота в различных биологических субстратах (КВВ, кровь, моча), процессов оксидантной и антиоксидантной системы легких, а так же оценка клеточного звена иммунитета и определение уровня и динамики оппозиционных цитокинов для использования их в качестве критериев степени тяжести и прогноза заболевания.

Проведенные нами исследования показали, что нарушения фагоцитарной активности нейтрофилов наблюдаются как у больных с острым перитонитом, так и у больных с НП развившейся на фоне тяжелого послеоперационного течения перитонита. Более глубокие дефекты в фагоцитарном звене, проявляющиеся низкой фагоцитарной активностью нейтрофилов в комплексе с их низкой поглотительной способностью, при мониторинге выявлены у пациентов с НП развившейся на фоне перитонита.

При мониторинге, динамики заболевания нами установлен ряд закономерностей. Количество фагоцитирующих нейтрофилов, в 1−3 сутки заболевания у пациентов с НП было значитально ниже 30,4+1,9% (р<0,001), против показателей больных с тяжелым перитонитом без НП — 37,3 ±1,2% и людей контрольной группы 78,0+1,2%. Наиболее выраженное угнетение фагоцитарной активности выявлено на 5−7 сутки заболевания, что характеризовалось дальнейшим снижением удельного веса фагоцитирующих нейтрофилов 29,2 ±-2,4%(р<0,001).

Для изучения механизмов нарушения фагоцитарной активности нейтрофилов было изучено состояние кислородзависимой интралейкоцитарной микробицидной активности клеток крови в НСТ-тесте. У больных, несмотря на высокие показатели спонтанного НСТ-теста, фагоцитарный резерв достоверно ниже здоровых лиц (р<0,05), что связано с выраженностью степени интоксикации и отражает депрессию клеточной защиты. При этом кислородза-висимые механизмы активации нейтрофилов достаточно высоки у всех пациентов, однако функциональные возможности значительно снижены. Что, особенно выражено у больных с тяжелым послеоперационным течением перитонита как без НП, так и с пневмонией, развившейся на фоне перитонита. Что способствует прогрессированию токсемии и формированию состемных воспалительных реакций.

Следующим важным результатом наших исследований, явилось определение у больных НП факторов напряженности клеточного иммунитета, за счет снижения активности основных эффекротных клеток (СБЗ), уменьшение субпопуляций Т-лимфоцитов (СБ4+, СЭ8+), увеличение клеток с цито-токсической функцией (ТЛ316+), достоверное увеличение маркеров активации иммунокомпетентных клеток (СБ25+), а так же увеличение маркера активации эндотелия СБ54+, что свидетельствует об усилении адгезионности сосудов. На этом фоне установлено достоверное увеличение клеток, экспрес-сирующих СБ95+, что можно рассматривать, как механизм ограничения активации иммунной системы.

Результаты исследований цитокинового статуса показали, что ведущая тенденция изменений у больных, заключалась в дисбалансе продукции в системе прои противовоспалительных цитокинов, обусловленном нарушением регуляции иммунного ответа. Значительное повышение провоспали-тельных цитокинов зарегистрировано у больных, что отражает тяжесть клинического течения и объем потологического воспаления. Выявлена активация клеточно-опосредованных реакций у больных острым перитонитом и НП развившейся на фоне перитонита. Нарастание в системном кровотоке к 5−7 суткам более чем в 16 раз ИЛ-8 220,3+10,7 пг/мл и 216,3+11,4 пг/мл соответственно, против показателей здоровых лиц 13,4±1,3пг/мл (р<0,001). Установлена прямая зависимость между уровнем данного хемокина в сыворотке крови и степенью тяжести течения послеоперационного периода (г=0,7−0,79, р<0,001), что вероятно отражает процесс гиперактивации иммунной системы.

С другой стороны, у больных выявлено достоверное нарастание уровня ИЛ-12 в сыворотке крови, являющегося ключевым цитокином для усиления клеточно-опосредованного иммунного ответа и инициации эффективной противоинфекционной защиты. При этом, более низкие показатели уже в дебюте заболевания у больных с тяжелым послеоперационным течением перитонита как функционально активного гетеродимера ИЛ12р70, так и естественного антогониста ИЛ-12, гомодимера ИЛ-12р40. Так, если у пациентов со среднетяжелым течением уровень ИЛ-12р40 в начале заболевания увеличился в 8,7 раз, а на 5−7 сутки в 15 раз в сравнении со здоровыми лицами (153,61 ±14,5пг/мл и 264,33 ±6,3, против 17,58±2,9пг/млр<0,00), то у пациентов с тяжелым послеоперационным периодом в 4 и 11 раз соответственно (70,5±10,1пг/мл и 194,7±7,6пг/мл, против 17,58±2,9пг/млр<0,00), а у больных, с развившейся НП в2,5 и 6,9 раз (43,71 ±4,9 пг/мл и 122,1 ±9,8пг/мл, против 17,58±2,9пг/млр<0,001). Что, вероятно способствует развитию но-зокомиальной пневмонии вследствие не эффективности между механизмами неспецифической защиты и специфическим иммунным ответом и инициации противоинфекционной защиты, как результат ослабления клеточноопосредованного иммунного ответа.

Известно, что иммунорегуляторные эффекты цитокиновой сети построены на равновесии оппозиционных пулов цитокинов [42,127,220,226]. Уже в 1−2 сутки после операции увеличивается синтез и секреция противовоспалительных цитокинов, секретируемых преимущественно ТЬ-2 лимфоцитами, что очевидно приводит к угнетению ТЬ-1 лимфоцитов и функциональной активности нейтрофилов[12,38,46,65]. В нашем исследовании выявлено достоверное повышение у больных в сыворотке крови ИЛ-10, ингибирующего активность макрофагов и ТЪ-1 -лимфоцитарные реакции, что отражает тяжесть клинического течения и степень выраженности патологического процесса. Нарастание уровня ИЛ-10 оказалось более выраженным в начале заболевания у больных с тяжелым течением перитонита, чем у больных со среднетяже-лым течением (р<0,05), однако в динамике выявлена тенденция нарастания уровня у больных со среднетяжелым течением (р<0,01). У больных же с тяжелым течением показатели продукции ИЛ-10 в сравнении с дебютом снизились более чем в 2 раза (78,33 ±10,2пг/мл, против 33,78±9,1пг/млр<0,001). Уровень системного ИЛ-10 больных, у которых на фоне перитонита развилась НП, хотя и превышал показатели здоровых лиц, но на всем протяжении исследования оставался ниже, чес у больных без НП (43,31 ±2, 2пг/мл и.

20,49 ±1,4пг/мл, против 78,33 ±10,2пг/мл и 33,78±9,1пг/млр<0,05). Выявлена прямая сильная корреляционная связь в динамике заболевания в зависимости от тяжести течения послеоперационного периода (г=0,86−0,96, р<0,001).

Известно, что интенсивность и характер иммунных реакций зависят от состояния внутриклеточного оксидантного, антиоксидантного и нитроксид-ного статусов.

Установлено, что индукция окида азота сопровождает любую воспалительную реакцию, оказывает микробицидное действие, сосудорегулирующее действие на системном и микроциркуляторном уровне [86,95,189]. В последние годы обнаружена и иммунорегуляторная функция оксида азота — способность избирательно ингибировать ТЬ-1, угнетать продукцию ИНФ-у, одновременно повышая активность ИЛ-4, следовательно изменять дифференци-ровку Т-хелперов в сторону ТЪ-2 — иммунного ответа [101,103,168,182].

При анализе результатов, исследования метаболитов оксида азота в различных биологических субстратах (КВВ, кровь, моча) больных, мы получили интересные данные, свидетельствующие о несомненном участии этой молекулы в патогенезе и тяжести течения заболевания. В сыворотке крови достоверно высокие показатели N0 в сравнении со здоровыми донорами регистрировались у всех больных. У пациентов с развившейся НП на фоне тяжелого течения перитонита его уровень был достоверно выше больных сравниваемых групп (р<0,05). В дебюте, заболевая установлена прямая умеренной силы (г=0,42,р<0,05), а в динамике к 5−7 суткам обратная умеренной силы корреляционная связь зависимости уровня оксида азота и тяжести течения послеоперационного периода.

Исследование метаболитов оксида азота в КВВ оказалось еще более информативным. Выявлено, что при тяжелом послеоперационном течении перитонита уровень метаболитов оксида азота достоверно выше уровня здоровых лиц, но более высокие уровни метаболитов N0 в КВВ характерны для больных с НП, чем у больных с острым перитонитом, что в 2,2 выше показателей здоровых доноров. В динамике заболевания у больных с НП уровень N0 в конденсате выдыхаемой влаги не изменялся и оставался высоким.

Не менее интересные данные выявлены при исследовании метаболитов оксида азота в моче. Достоверно высокие значения регистрировались у больных с острым перитонитом, причем у больных с НП развившейся на фоне перитонита эти показатели оказались более высокими. Мониторинг позволил выявить, что только у пациентов с НП к 5−7 суткам показатели метаболитов оксида азота в моче нарастают, при том как у остальных пациентов наоборот приближаются к показателям здоровых лиц. Установлена прямая корреляционная связь умеренной силы уже в начале заболевания в зависимости от степени тяжести течения послеоперационного периода (г=0,37, р<0,01).

В доступной литературе не представлены данные об изменении уровня N0 в различных биологических субстратах у больных и о взаимосвязи их с иммунными показателями, и уровнем цитокинов в сыворотке крови. Учитывая тот факт, что повышение концентрации N0, активирует распад арахидоновой кислоты, и как следствие выработку провоспалительных простоглан-динов и цитокинов.

Нам представилось интересным установить возможные корреляционные взаимосвязи уровня N0 в сыворотке крови и продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-12р70 и ИЛ-12р40), а так же противовоспалительного ИЛ-10.

Установлено, что у пациентов с НП в начале заболевания N0 угнетает (г= -0,54), а в динамимке, напротив стимулирует выработку ИЛ-12р70 (г=0,79). Подтверждая тот факт, что повышение концентрации N0 активирует распад арахидоновой кислоты, и как следствие выработку провоспалительных простогландинов и цитокинов.

Связи провоспалительного ИЛ-8 и N0 носили отрицательный характер в течение заболевания (г= -0,63- г= -0,76). Выраболтку ИЛ-10 в дебюте болезни данный метаболит стимулировал (г=0,53), а на 5−7 сутки напротив, угнетал (г= -0,73).

Тогда, как упациентов с тяжелым течением перитонита без НП зафиксировано нарастание на 5−7 сутки ИЛ-12р70 (г=0,59). Обратные взаимосвязи ировня ИЛ-8 у паицентов этой группы выявлены в течении заболевания (г= -0,12- г= -0,45). Связи уровня ИЛ-10 носили разнонаправленный характер, так в начале заболевания они были отрицательными (г=-0,38), в динамике же напротив положительными (г=0,63).

Установлены, как в дебюте, так и в динамике у пациентов со среднетя-желым течением обратные сильные корреляционные связи уровня ИЛ-8 и оксида азота (г= -0,76- г= -0,86). При этом, в начале заболевания уровень ИЛ-12р70 обратно слабо коррелировал с системным уровнем N0 (г= -0,21), то в динамике нами были выявлены сильные прямые корреляционные взаимосвязи (г=0,86).

Таким образом, определение высокого уровня метаболитов N0 уже в первые дни заболевания в сыворотке крови, конденсате выдыхаемой влаги и моче дает основание считать, что у больных с НП на фоне тяжелого послеоперационного течения перитонита в воспалительный процесс вовлекаются легкие и почки, формируется синдром системной воспалительной реакции (ССВР), что может служить дополнительным не инвазивным критерием тяжести течения инфекционного процесса.

В своей работе мы определили, что метаболические нарушения в легких, у больных в зависимости от степени тяжести послеоперационного течения перитонита характеризуются интенсификацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и истощением антиоксидантной защиты.

Более существенное увеличение интермедиантов ПОЛ в конденсате выдыхаемой влаги отмечается у пациентов с тяжелым послеоперационным течением перитонита в сравнении с пациентами среднетяжелого течения (р<0,05). У пациентов с НП развившейся на фоне перитонита интенсификация процессов периоксидации липидов более выражена и характеризуется увеличением как резервных липидов, так и мембранных фосфолипидов, отражая наибольшую уязвимость фосфолипидов сурфактантной системы к ок-сидантному повреждению, что является следствие локальной аккумуляции фагоцитирующих клеток в очаге воспаления, активации их кислородного метаболизма, увеличения свободных форм кислорода и местного усиления процессов перекисного окисления.

Характерно, что в начале заболевания отмечается повышение показателей АРА (антирадикальной активности) у всех больных. В динамике, значения близкие к показателям здоровых, выявлены у пациентов со среднетя-желым послеоперационным течением перитонита. У пациентов с тяжелым послеоперационным периодом эти значения в 1,4 раза были ниже, чем у здоровых лиц и в 1,8 -2 раза ниже, чем у пациентов со среднетяжелым послеоперационным течением перитонита (0,015 ±0,005 Д/мл, против.

0,030 ±0,002Д/мл и 0,021 ±0,003Д/мл здоровых доноровр<0,05). Была выявлена тенденция к снижению АРА в КВВ у пациентов с НП развившейся на фоне перитонита в сравнеии с показателями пациентов с тяжелым течением перитонита без НП (р<0,01), отражая метаболические сдвиги в легких, происходящие при развитии нозокомиальной пневмонии на фоне перитонита и приводящие к выраженному истощению антиоксидантной системы легких.

Мы считаем, что результаты, полученные в ходе проведенного эксперимента заслуживают определенного внимания.

Успехи, достигнутые в клинической иммунологии за последние годы, к настоящему времени позволили выявить нарушения функционирования иммунной системы при различных состояниях организма. Однако не всегда применяемые средства и методы их лечения обладают достаточным терапевтическим эффектом и дают желаемые результаты. Часто клиницисты придают основное значение антибиотикотерапии, в то время как вопросы иммунотерапии остаются вне поля зрения [26,71,94,122].

Мы сочли необходимым проанализировать влияние рекомбинантного ИЛ-2 на клеточные механизмы первой линии неспецифической иммунологической защиты организма в клетках гомогенизата легких, клетках крови и клетках перитониального смыва, а так же, продукцию ключевых прои противовоспалительных цитокинов, в острую фазу воспалительного ответа (3 сутки) у экспериментальных мышей линии СБА.

Данные эксперимента показали, что в группе животных получивших взвесь чистой культуры S. aureus, отмечалось повышение фагоцитарной активности и поглотительной способности нейтрофилов в сравнении с интакт-нами животными, однако более яркая активация фагоцитоза отмеча в сериях опытов, где применылся рИЛ-2. В клетках крови, показатели ИР и ИГ рав-нонаправленно повышались у всех экспериментальных животных, и 1,5 раза были выше интактных. При введении рекомбинантного ИЛ-2 параперитони-ально одновременно с S. aureus, процессы активации иммунокомпетентных клеток были несколько выше как в крови (в 1,6 раз) 4,56+0,08 и 41,8+1,8 (р<0,01, р<0,05), так и непосредственно в очаге воспаления (4,50+0,08 и.

43,0±1,2- р< 0,001), а так же в гомогенизате легкого (3,50+0,17 и 33±1,4- р< 0,001, р< 0,05). Этот факт свидетельствует о способности влиять на активность нейтрофилов рИЛ-2, что, вероятнее всего, связано с преимущественно локальным действием цитокина. На уровне индивидуальной клетки экспрессия гена ИЛ-2 и выработка ИЛ-2 продолжается 1 сутки, а экспрессия высокоаффинного рецептора — до 3 суток. Кроме того, эксперссия рецептора усиливается под влиянием самого ИЛ-2 аутокринно, как следствие взаимодействия макрофагов с объектами фагоцитоза [26,73].

Не маловажным представляется тот факт, что в модели экспериментального перитонита нами были получены данные, свидетельствующие о влиянии рИЛ-2 на микробицидную кислородзависимую функцию активированных нейтрофилов. У животных получивших параперитониально рИЛ-2 через 12 часов в перитониальном экссудате и гомогенезате легкого выявлено достоверное увеличение ФР (0,001) в сравнении с интактными, и животными получивших рИЛ-2 одновременно с S. aureus и животными, которым препарат не вводился.

Введение

рИЛ-2 в эти сроки, вероятно усиливает функцию фагоцитарных клеток, что способствует активации компонентов неспецифической иммунорезистентности, существенно увеличивая резервные возможности нейтрофилов (р<0,05), опосредующих локальную защиту.

Данные изменения свидетельствуют о том, что чрезмерная антигенная стимуляция приводит к повышению неспецифической иммунорезистентности не только в очаге воспаления, но и в других органах и системах. Подтверждая тот факт, что воспаление развивается локально, но в его реализации участвуют все системы организма [4]. Полученные данные свидетельствуют, что парантеральное введение рекомбинантного ИЛ-2 существенно повышает степень активации эффекторов, что способствует активации ранних событий антигенспецифического ответа, опосредующих локальную защиту.

Установлено, что важнейшей функцией ИНФ-у является его участие в опосредовании взаимосвязей между лимфоцитами и макрофагами и в регуляции соотношения клеточной и гуморальной составляющих иммунного ответа. Являясь основным продуктом Th-1 клеток, интерферон снижает секреторную активность Th-2 клеток, в результате всех этих взаимодействий усиливает развитие клеточного иммунитета и подавляет проявления гуморального иммунного ответа [144,145]. В связи с этим мы сочли целесообразным в нашем эксперименте провести исследование уровня данного цитокина у животных и дать оценку влияния на него рИЛ-2.

Исследования показали, что у животных получивших взвесь чистой культуры S. aureus в сыворотке крови зафиксировано достоверное повышение уровня ИНФ-у, более чем в 10 раз (р< 0,001), подтверждая данные литературы, что цитокины синтезируются индуцибельно и пик данного лимфоки-на отмечается через 72 часа. У животных получивших рИЛ-2 уровень данного цитокина зависел от момента введения. При введении в момент заражения его уровень повышался в 2,7 раз, а при введении рИЛ-2, через 12 часов напротив, снижал показатели ИНФ-у в 4 раза в сыворотке крови.

В гомогенизате легкого, уровень ИНФ-у был выше показателей если у-животных контрольной группы, при этом в 1,2 раза превышая показатели интактны в группе где, препарат не применылся, то при введении рИЛ-2 через 12 часов в 1,7 раз (р<0,05).

Не посредственно в очаге воспаления (перитониальном смыве), напротив уровень продукции ИНФ-у был снижен у всех исследуемых животных. Однако при введении «Ронколейкина» сразу его уровень хоть и оставался в 2,6 раз ниже, чем в группе интактных, при этом в 1,9 раз превышал показатели продукции цитокина в группе животных, которым рИЛ-2 вводили через 12 часов и в 3,8 раз показатели продукции животных, которым препарат не вводился. Локальная продукция данного цитокина приводит к рекрутированию в очаг инфекции эффекторных клеток, активации их фагоцитарной и бактерицидной активности, связыванием данного хемокина с рецепторами на клеткахмишенях, что обясняет полученные результаты. Косвенно об этом свидетельствует выявленная корреляционная зависимость величины фагоцитарного резерва и уровня ИНФ-у в перитониальном экссудате животных с экспериментальным перитонитом (г= -0,49−0,67- р<0,05).

Следующее исследование, уровня продукции типичного представителя противовоспалительных цитокинов — ИЛ-10, в модели экспериментального перитонита, позволило нам выявить сдерживающее влияние рИЛ-2 на продукцию данного цитокина в клетках гомогенизате легких и системном кровотоке в острую фазу стафилококкового перитонита, у всех экспериментальных животных. Более выражена супрессорная активность уровня ИЛ-10 наблюдалась у животных, получивших рИЛ-2 через 12 часов в сравнении с интакт-ных животных (16,52+0,7 пг/мл и 14,6 ±0,8 пг/мл соответственнор<0,01). В клетках гомогенизата легкого, при введении «Ронколейкина» через 12 часов его уровень характеризовался наивысшими значениями и достоверно не отличался от уровня контрольной группы (53,1 ±1,1 пг/мл и 57,1 ±0,7 пг/мл соответственно, р>0,05). Продукция ИЛ-10 в легких является конституитивной и принадлежит резидентным макрофагам и усиливается уже в первые часы-иммунокомплексного воспаления [78,89]. Вероятно, введенный параперито-ниально препарат ИЛ-2 в более поздние сроки воспаления, оказывает стимулирующий эффект на продукцию ИЛ-10 в легких эксперниментальных животных. Нарастание данного противовоспалительного цитокина непосредственно в очаге воспаления, в перитониальном смыве отмечено у животных, которым после внутрибрюшинного введения S. aureus, через 12 часов был введен препарат «Ронколейкин» (р<0,05).

Таким образом, можно говорить, что введенный параперитониально рИЛ-2 повышает биологическую активность функционирования элементов и механизмов, как естественной резистентности, так и антигенспецифического иммунитета, что в совокупности обеспечивает более быструю элиминацию этиопатогенов, предотвращает углубление иммунных дисфункций и как следствие, развитие вторичной иммунной недостаточности.