Влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики антител

Общая характеристика работы.

Актуальность темы

.

Алкилоксибензолы (АОБ), в том числе и входящие в эту группу веществ алкилрезорцины (АР), встречаются на разных уровнях организации живой материи (бактерии, грибы, растения) и демонстрируют чрезвычайно широкий спектр биологических активностей, что делает их объектом значительного числа междисциплинарных исследований/1, 2/. В частности, у бактерий родов Azotobacter, Pseudomonas, Micrococcus, Thioalkalivibrio и др. эти вещества выполняют роль внеклеточных ауторегуляторов с функциями адаптогенов, способных индуцировать переход клеток в гипометаболическое и анабиотическое состояние /3, 4/.

В основе биологической активности АОБ лежит их способность к ряду физико-химических взаимодействий (гидрофобных, электростатических, водородных) с липидами клеточных мембран /5/, протеинами /6/ и нуклеиновыми кислотами /7/, что обуславливает изменение структурной организации и функциональной активности биомакромолекул и надмолекулярных структур. При этом универсальность действия АОБ как «химических шаперонов» /8/ обуславливает развитие сходных эффектов в гетерологичных системах. В частности, в присутствии микромолярных концентраций гомологов АОБ показаны изменения каталитической активности, функциональной и операционной стабильности монои полисубъединичных ферментных белков не только микробного и растительного, но и животного происхождения /9−11/, а также снижение аффинности рецепторов к фибриногену на поверхности тромбоцитов/12/.

В связи с тем, что АОБ в значимых количествах поступают в организм человека и животных с пищей, а также синтезируются некоторыми представителями микробиоценоза, их концентрации в биологических жидкостях и тканях могут достигать нанои микромолярных значений /13, 14/. Это предполагает возможность участия АОБ в регуляции ряда иммунофизиологических и иммунопатологических процессов. Высказанное предположение подтверждает показанная в опытах in vitro способность АОБ изменять розеткообразующую активность Т-лимфоцитов /15/, а также оказывать цитотоксическое действие на мононуклеарные фагоциты /16/. Итоговым результатом реализации такой биологической активности могут являться индуцируемые АОБ аллергические состояния/17, 18/.

Однако до настоящего времени отсутствуют данные, характеризующие эффекты алкилоксибензолов в отношении антител — неферментных иммунных белков человека и животных, включая изменения их основного свойства — антигенсвязывающей способности, а также функциональной и операционной стабильности при экстремальных физических и химических воздействиях.

Цель и задачи исследования

.

Цель работы — изучить влияние алкилкоксибензолов — химических аналогов бактериальных ауторегуляторов, на функциональную активность и стабильность антител (иммуноглобулинов).

Для достижения данной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики иммуноглобулинов в реакциях «антиген-антитело».

2. Изучить действие алкилоксибензолов на стабильность иммуноглобулинов при денатурирующих воздействиях и неоптимальных условиях проведения реакций.

Научная новизна.

Впервые установлено, что алкилоксибензолы — химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, способны блокировать специфическое взаимодействие антител (иммуноглобулинов) с соответствующими I антигенами. Выраженность эффектов АОБ зависит от длины алкильного радикала и определяемой этим гидрофобности данных веществ, а концентрационная зависимость их действия варьирует от характеристик реакционной системы. Механизм эффектов АОБ на иммуноглобулины связан с их модифицирующим действием на аффинность, а через него и авидность антител. Эффект распространяется на антитела различной специфичности и классов. В ряде случаев результатом взаимодействия «АОБ: антитела» может стать частичное изменение специфичности иммунных белков.

Обнаружено, что алкилоксибензолы способны дополнительно влиять I на результат реакции в системе «антиген-антитело» через взаимодействие с антигенами. Ранжирование значимости эффектов АОБ в рассматриваемой системе позволило установить, что короткоцепочечные гомологи преимущественно реализуют свою биологическую активность через влияние на свойства антигенов, в то время как длинноцепочечные АОБ оказывают большее действие на свойства антител.

Выявлен модифицирующий эффект длинноцепочечных алкилоксибензолов на функциональную активность Рс-фрагментов антител, проявляющийся в затруднении инициации классического пути активации комплемента в реакции комплементзависимого гемолиза.

Изучение эффектов алкилоксибензолов на функциональную и операционную стабильность антител позволило установить разнокачественность отклика на внешние воздействия: АОБ снижали устойчивость белков к термоденатурации, преимущественно увеличивали их устойчивость к УФ-облучению и неоднозначно изменяли диапазон i активности при низких и высоких значениях рН.

При длительной инкубации модифицированных АОБ антител в водных растворах выявлено развивающееся во времени восстановление показателей их связывания с соответствующими антигенами, первоначально ингибированного в результате взаимодействия белков с длинноцепочечными АОБ. На этом фоне значимым эффектом 1,3-диокси-5-метилбензола явилась его способность увеличивать сроки сохранения функциональной активности антител при температуре +37°С.

Практическая значимость.

Полученные результаты, свидетельствующие об изменении функциональных характеристик антител при взаимодействии с АОБ, позволяют говорить об алкилоксибензолах как о новойгруппе бактериальных ауторегуляторов с иммуномодулирующими свойствами с перспективой разработки на этой основе новых, подходов к регуляции иммунологических реакций-, в системах in vitro и in vivo.

Результаты модификации антител 1,3-диокси-5-метилбензолом положены в основу оригинального подхода к стабилизации этих белковых молекул в условиях длительного нахождения в водных растворах, ориентированного на увеличение сроков хранения диагностических и лечебно-профилактических препаратов иммуноглобулинов без утраты их функциональной активности. Приоритет разработанного подхода закреплен «Способом стабилизации антител в водных растворах» (положительное решение ФИПС по заявке на изобретение № 2 010 136 488 от 30.08.2010 г.).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Алкилоксибензолы — химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, изменяют функциональные характеристики антител: антигенсвязывающую способность, специфичность и эффекторные функции. Характер влияния алкилоксибензолов зависит от химического строения АОБ и наиболее выражен у их длинноцепочечных гомологов. Изменение параметров связывания в системе «антиген-антитело» дополнительно может быть обусловлено модификацией свойств антигенов в присутствии АОБ.

2. Алкилоксибензолы различной структуры разнокачественно влияют на стабильность антител при внешних воздействиях: повышают их чувствительность к термоденатурации, преимущественно снижают чувствительность к УФ-облучению и неоднозначно изменяют диапазон активности при различных значениях рН. 1,3-диокси-5-метилбензол увеличивает сроки сохранения функциональной активности антител в условиях их длительного нахождения в водном растворе.

Связь автора с научными программами и собственный вклад автора.

Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № 1 200 606 125 «Влияние ауторегуляторных ёрфакторов бактерий из группы алкилоксибензолов на структуру и функции биополимеров», а также при поддержке гранта РФФИ 08−04−99 078-рофи «Разработка технологии стабилизации иммунных и ферментных белков с использованием химических шаперонов микробного происхождения».

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

Публикации.

Основные результаты представлены в 13 печатных работах, в том числе 5 статьях в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Апробация работы.

Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на III и V Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов, 2006, 2010) — V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006) — Региональной конференции молодых ученых с международным участием. «Современные проблемы экологии, микробиологии и ' иммунологии» (Екатеринбург — Пермь, 2007) — III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь — Н. Новгород, 2008) — IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб, 2008) — Российской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009) — Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, включая обзор литературы, описание материалов и методов, 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 194 источника отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 21 рисунком.

Выводы.

1. Алкилоксибензолы способны блокировать специфическое взаимодействие антител с соответствующими антигенамивыраженность подобных эффектов зависит от особенностей химической структуры АОБ и характеристик системы «антиген-антитело».

2. Влияние алкилоксибензолов на параметры специфического связывания антител с соответствующими антигенами обусловлено уменьшением аффинности и авидности иммуноглобулинов.

3. В результате взаимодействия антител с АОБ. может происходить частичное изменение их специфичности с возникновением возможности связываниям гетерологичными антигенами.

4. Алкилоксибензолы способны потенцировать свое действие в системе «антиген-антитело» через изменение поверхностных свойств антигена, что в большей степени характерно для короткоцепочечных АОБ по сравнению с длинноцепочечными.

5. Длинноцепочечные АОБ изменяют функциональную активность Бс-фрагмента антител, затрудняя инициацию классического пути активации комплемента.

6. Алкилоксибензолы увеличивают чувствительность антител к термоденатурации, преимущественно снижают чувствительность к УФ-облучению и разнрнаправленно изменяют диапазон активности при различных значениях рН.

7. При длительном хранении модифицированных АОБ антител в водных растворах происходит восстановление показателей их связывания с соответствующими антигенами, первоначально ингибированного в результате модификации АОБ.

8. 1,3-диокси-5-метилбензол, оказывающий наименьшее влияние на антигенсвязывающую способность антител, существенно увеличивает сроки сохранения, их. функциональной активности в условиях длительного пребывания в водномрастворе.

Заключение

.

Малые органические молекулы, вероятно, являются одними из наиболее эволюционно древних компонентов живых систем. История их открытия связана с исследованием цвета, запаха и вкуса продуктов растительного и животного происхождения /188/, а распространение подобного поиска в мир микроорганизмов позволило выявить у малых молекул и иные, не менее значимые функции. Так, одним из наиболее ярких открытий в микробиологии конца XX века явилось описание феномена межклеточной коммуникации и определяемого этим коллективного поведения1 бактерийза которые в качестве химических сигналов отвечают именно малые молекулы /19/. При этом к настоящему времени количество известных малых регуляторных молекул, представленных лактонами гомосерина, циклическими олигопептидами и др. достигло нескольких десятков и продолжает возрастать /25/.

Среди малых молекул с регуляторными свойствами обращает на себя внимание широкий спектр изомеров и гомологов алкилоксибензолов (АОБ), в научной литературе описываемых также как фенольные липиды /54/ или алкилрезорцины /1/. Исследование характера индуцируемых ими эффектов позволило связать биологическую роль АОБ с индукцией перехода микроорганизмов в гипометаболическое и анабиотическое состояние /3, 4/. В свою очередь лежащие в основеподобной активности молекулярные механизмы оказались связанными со способностью АОБ к взаимодействию с липидными мембранами /5/, протеинами /6/ и нуклеиновыми кислотами /7/, ведущему к изменению структурных особенностей и функциональных характеристик данных биополимеров.

Глубокое биохимическое единство жизни, а также отобранная в процессе эволюции оптимальная структура АОБ определили их присутствие и значимые биологические функции у ряда эукариот — грибов и растений /66, 69/. При этом помимо проявившейся еще в мире прокариот способности АОБ к модификации структуры и функции белковых макромолекул, у растений они дополнительно принимают участие в контроле окислительных процессов, а также реализации антимутагенных и антибактериальных эффектов/189, 190/.

Эндогенное образование алкилоксибензолов в организме животных и I человека в настоящее время не установлено. Однако, в связи с тем, что АОБ в значимых количествах поступают с растительной пищей, а также образуются некоторыми представителями микробиоценоза, они могут выступать и в качестве потенциальных участников ряда’физиологических и патологических процессов данной группы высших эукариот. При этом обоснованность подобного предположения подтверждается обнаружением присутствия АОБ в биологических жидкостях и тканях человека и животных в нанои микромолярных /13,14/ концентрациях.

Первыми экспериментальными доказательствами регуляторных эффектов АОБ в гетёрологичных системах стали изменение каталитической активности ряда ферментных белков животного происхождения /6, 10/ и обусловленное ими снижение аффинности рецепторов к фибриногену на поверхности тромбоцитов, /12/. В свою очередь доказательствами возможного участия АОБ в регуляции активности иммунной системы стало обусловленное ими изменение розеткообразующей активности Тлимфоцитов, адгезивных свойств и фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов, а также активности белков системы комплемента /16/.

Однако, в научной литературе отсутствуют данные, характеризующие эффекты алкилоксибензолов в отношении антител — неферментных иммунных белков человека и животных, а именно их основного свойстваантигенсвязывающей способности, а также функциональной и операционной стабильности при экстремальных физических и химических воздействиях, что и определило цель настоящего исследования.

В процессе достижения указанной цели на примере ряда гомологов алкилоксибензолов (СгАОБ, С3-АОБ, Сб-АОБ и С12-АОБ), различающихся длиной алкильных радикалов и определяемой этим гидрофобностью молекул, впервые показана зависимость изменения функциональных характеристик и параметров стабильности антител от структуры и действующих концентраций АОБ. При этом установлено, что направленность и выраженность действия АОБ характеризуется выраженной зависимостью от особенностей их химического строения (в первую очередь — длины углеводородного алкильного радикала) и в зависимости от этого проявляется в формировании двух основных групп эффектов:

1) для длинноцепочечных гомологов АОБ впервые показано влияние на ряд функциональных характеристик антител — их антигенсвязывающую способность, специфичность и эффекторные функции, что позволяет охарактеризовать данную группу малых молекул как бактериальные ауторегуляторы с иммуномодулирующими свойствами;

2) впервые охарактеризовано влияние АОБ на чувствительность антител к различным денатурирующим воздействиям, а также стабильность их функциональных' характеристик при длительном нахождении в водном растворе, каковая может быть существенно увеличена в присутствии короткоцепочечного 1,3-диокси-5-метилбензола и позволяет рекомендовать названный гомолог АОБ в качестве стабилизатора препаратов антител.

Обобщая и обсуждая полученные при проведении работы указанные фундаментальные и прикладные результаты, еще раз обратим внимание на следующие детализирующие их основные моменты, а также определим возможные направления дальнейшего научного поиска.

Первая группа научных результатов работы связана с выявлением I способности АОБ к' блокированию специфического связывания антител с соответствующими (гомологичными) антигенами. С использованием различных вариантов иммуноферментного анализа, включающего классический «сендвич-метод» и конкурентный ИФА показано, что присутствие в реакционной системе возрастающих концентраций АОБ приводит к достоверному снижению показателей связывания антител I различной специфичности и классов. Данная способность существенно зависела от химического строения использованных гомологов алкилоксибензолов, будучи наиболее выраженной у длинноцепочечных Сби С12-АОБ в сравнении с короткоцепочечными С г и Сз-АОБ.

В подобном контексте малый размер, а также особенности молекулярной организации АОБ позволяют уподобить их гаптенам, активность которых также связана с блокированием антигенсвязывающей способности антител /166/. Однако, в отличи от истинных гаптенов, представляющих собой фрагменты детерминантных групп антигенов и в этой связи блокирующих взаимодействие только в определенных парах «антиген-антитело», эффект АОБ распространялся на антитела самой разной специфичности. Сказанное позволило рассматривать исследованные малые молекулы как некие «супергаптены», обладающие расширенным спектром биологической активности.

Обнаружение подобной уникальной способности АОБ ставит вопрос о механизмах, лежащих в основе вызываемого ими блокирования антител. При этом вероятные возможности определяются взаимодействием длинноцепочечных гомологов АОБ с остатками гидрофобных аминокислот непосредственно в активных центрах антител, а также обуславливаемым ими изменением характера укладки полипептидных цепей, нарушающего точную организацию макромолекулы в области активного центра, как это было ранее показано для ряда ферментных белков /51, 108−110/.

Окончательное решение данного вопроса требует продолжения исследований в обозначенном направлении, в том числе с использованием методов исследования третичной структуры белков (рентгеноструктурный анализ, двухи многомерная ЯМР-спектроскопия). Полученные же при проведении настоящего исследования экспериментальные результаты позволили детализировать выявленные эффекты АОБ через влияние на аффинитет и авидность антител, характеризующие качество и количество силы их связывания с соответствующими антигенами.

Так изменение аффинитета антител под действием АОБ было зафиксировано с использованием метода гашения триптофановой флюоресценции при добавлении нитроароматического лиганда динитрофенола. При этом выявленное подавление гашения флюоресценции антител, предварительно инкубированных с С6-АОБ, по сравнению с интактными иммуноглобулинами позволило говорить о снижении их аффинности в присутствии названных малых молекул. В свою очередь методом денатурирующего иммуноферментного анализа был показан более выраженный прямой блокирующих эффект АОБ по отношению к низкоавидным антителам по сравнению с высокоавидными, а также снижение самого показателя авидности последних в присутствии Сб-АОБ.

На этом фоне вторым значимым научным результатом представляется I экспериментально обнаруженная способность АОБ не только блокировать взаимодействие антител с гомологичными антигенами, но и обуславливать возможность их неспецифического взаимодействия с рядом гетерологичных антигенов. Так в опытах с антителами шести специфичностей к стероидным и нестероидным гормонам человека продемонстрировано повышение показателей их взаимодействия с гетерологичными антигенами под действием С6-АОБ, а особенно С12-АОБ. Сказанное позволило констатировать, что подобная способность вновь была характерна именно для длинноцепочечных АОБ, тем самым заставляя рассматривать два описанных выше феномена (блокирование специфического взаимодействия и возникновение возможности неспецифического взаимодействия в системе «антиген-антитело») как проявление одного и того же механизма биологической активности гидрофобных гомологов алкилоксибензолов, определяемого изменением структуры активных (антигенсвязывающих) центров антител.

Обсуждая полученный результат, представляется целесообразным сопоставить его с недавно полученными данными о влиянии АОБ на внутримолекулярную динамику белка, рассмотренную на примере ферментного белка — лизоцима /191/. При этом обращает на себя внимание повышение внутримолекулярной подвижности модифицированнойАОБ белковой глобулы, в том числе проявляющейся в увеличении флуктуаций в области активного центра. Результатом же происходящих процессов оказывается снижение характеризуемой константой Михаэлиса субстратной специфичности ферментных белков, одновременно* сопровождающееся-парадоксальным расширением спектра их субстратной специфичности. Так в варианте модификации лизоцима, наряду с изменением его активности к типичному субстрату — бактериальному пептидогликану, отмечена выраженная стимуляция гидролитической активности фермента в отношении коллоидного хитина /10/.

В подобном контексте представляется вероятным предположение о том, что изменение специфичности белков как результат их модификации АОБ, по-видимому, является универсальным эффектом этих малых молекул, распространяющимся как на иммунные, так и на ферментные белки (в частности — лизоцим /10/, оксигеназы /11/ и др.). Применительно же именно к антителам возможность частичного изменения их специфичности при взаимодействии с АОБ может иметь дополнительные медико-биологические аспекты. В частности, модификация антител АОБ микробного происхождения представляется одним из молекулярных механизмов «уклонения» инфекционных агентов от эффекторов иммунной системы. В свою очередь механизмы индуцируемых АОБ растительного происхождения иммунопатологических состояний /17, 18/ также могут быть опосредованы именно этой особенностью биологической активности названных малых молекул.

Дополнительным вопросом, требующим своего решения при описании взаимодействияАОБ с белковыми макромолекулами, являлся избирательный или неизбирательный характер их контакта именно с активными (антигенсвязывающими) центрами антител. Проведенное с этой целью экспериментальное исследование влияния АОБ на активность еще одного функционального участка — Бс-фрагмента антител, позволило констатировать, что эффект алкилоксибензолов проявляется и в изменении его активности, тем самым свидетельствуя о делокализованности данных малых молекул по всей глобуле белка. При этом действие алкилоксибензолов на эффекторные функции иммуноглобулинов в реакции комплементзависимого лизиса эритроцитов проявлялось через увеличение кинетического параметра 150%, характеризующего скорость инициации классического пути активации комплемента. В совокупности же с известными данными о влиянии АОБ на собственную активность белков системы комплемента /16/, их действие на эффекторные функции антител может рассматриваться в качестве еще одного механизма «уклонения» микроорганизмов от контакта с бактерицидными факторами организма-хозяина.

Наконец еще одним экспериментально выявленным эффектом АОБ в системе «антиген-антитело», усиливающим направленность и выраженность происходящих процессов, явилась способность данных малых молекул, наряду с изменением функциональных характеристик антител, модифицировать и значимые для взаимодействия с ними поверхностные свойства антигенов. При этом подобная способность в наибольшей степени была выражена уже не у длинноцепочечных, но у короткоцепочечных гомологов АОБ, что вероятно определялось их влиянием на гидратную оболочку антигенов. В свою очередь результаты проведенного двухфакторного дисперсионного анализа свидетельствовали о преобладании у длинноцепочечных АОБ способности к модификации антигенсвязывающей способности антител, развернутая характеристика которой была дана нами выше.

Таким образом, результатом выполнения первой части работы явились выявление и характеристика изменения функциональной активности антител (иммуноглобулинов) как результата их взаимодействия с химическими аналогами низкомолекулярных регуляторных факторов бактериального и растительного происхождения, что позволяет по-новому оценить роль I последних при их поступлении или образовании в организме человека и животных. В целом полученные результаты позволили с новых позиций оценить эволюционно древние химически консервативные малые молекулы из группы алкилоксибензолов как иммуномодуляторы особого типа, формирующие «информационный шум», дезорганизирующий и дискоординирующий иммунный ответ и потенциально ведущий к развитию иммунодефицитных и аутоиммунных состояний.

В подобном контексте полученные результаты хорошо согласуются с формирующимся в мировой науке представлениям о наличии у некоторых I бактериальных ауторегуляторов способности к воздействию нафункционирование иммунной системы млекопитающих /192/. Однако^ в отличие от известных фактов стимуляции продукции цитокинов при воздействии на клетки иммунной системы образуемого Chromobacterium violaceum ауторегулятора N-додеканоил-гомосеринлактона /193/ или показанного у образуемого Pseudomonas aeruginosa автоиндуктора N-оксододеканоил-гомосеринлактона способности к индукции апоптоза макрофагов и нейтрофилов /194/, оригинальность полученных результатов заключается в выявлении воздействия бактериальных ауторегуляторов не на клеточное, но на гуморальное звено иммунитета.

Второй блок полученных экспериментальных результатов включает оценку эффектов алкилоксибензолов на функциональные характеристики иммунных белков при денатурирующих воздействиях (функциональная стабильность) или неоптимальных условиях проведения реакций (операционная стабильность). При этом основанием для подобной постановки вопроса явились представления об АОБ как своеобразных химических шаперонах", предотвращающих денатурацию белковых молекул при экстремальных внешних воздействиях /8, 9/. Однако, экспериментально зафиксированные эффекты АОБ в отношении стабильности антител при воздействии высоких температур, ультрафиолетового облучения и неоптимальных значениях рН оказывались достаточно разнонаправленными.

Так короткоцепочечный гомолог СгАОБ в низких концентрациях повышал, а в высоких понижал значения характеризующего процесс термоденатурации параметра ЕТ20, не оказывая достоверного влияния на параметр ЕТ50. В свою очередь проведение модификации с использованием Сб-АОБ и последующая термообработка образующихся комплексов вели не только к значимому изменению величин ЕТ20, но и к снижению ЕТ50 существенно ниже такового у немодифицированных антител. При этом полученный результат, свидетельствующий о происходящем снижении терморезистентности комплексов «антитело+АОБ», согласуется с приведенными выше данными о повышении внутримолекулярной подвижности белковой глобулы при ее модификации алкилоксибензолами /191/, одновременно еще раз подтверждая факт связывания АОБ в области активных центров антител.

Еще одним, воспроизводящим ранее полученный на примере ферментных белков эффект /9/, стало протективное действие АОБ на функциональную стабильность антител при УФ-облучении, в основе которого может лежать близость спектральных максимумов (277 нм у Ср АОБ и 280 нм у Сб-АОБ) с таковыми у входящих в структуру белков остатков ароматических аминокислот — тирозина и триптофана (около 280 нм). Соответственно, в результате частичного перекрывания данных спектров в УФ-диапазоне возникает возможность формирования своеобразного «оптического экрана» из молекул АОБ, поглощающих кванты света на пути к белку. В то же время подобное предположение не способно полностью объяснить связь выраженности УФ-протекторного эффекта с особенностями химического строения АОБ, а также формирующиеся при этом нелинейные концентрационные зависимости, вновь заставляя признать роль в этих процессах прямого взаимодействия в системе «антитело+АОБ».

Наконец эффекты на операционную стабильность антител при неоптимальных значениях рН также оказывались достаточно неоднозначными. При этом наиболее общей зависимостью стало то, что при низких (кислых) значения рН АОБ проявляли себя как дестабилизаторы антител, а единичныефакты расширения их операционной стабильности продемонстрированы при высоких (щелочных) значениях рН.

На фоне столь неоднозначного эффекта АОБ на функциональную и операционную стабильность антител важной задачей представлялось исследование эффектов данной группы малых молекул на стабильность их характеристик в водных растворах, потенциально определяемых особыми амфифильными свойствами АОБ. При этом предпосылки для подобного исследования дополнительно определялись собственными результатами компьютерного моделирования взаимодействия молекул воды с различными гомологами АОБ, позволившими методом функционала плотности БРТ/ КОШ7/ ВЗ ЬУР/ в базисе 6−310 провести расчет межмолекулярных потенциалов и определить возможность создания устойчивых по энергии комплексов. Выполнение соответствующих расчетов позволило констатировать особенность свойств коротокоцепочечных гомологов АОБ и, особенно, С1-АОБ, формирующего устойчивые связи с молекулами воды и, тем самым, способного существенно модифицировать гидратную оболочку биополимеров.

Экспериментальное исследование влияния СрАОБ на антитела, изначально не вызывающего значимых изменений функциональных характеристик данных белков (см. выше), сопровождалось достоверным увеличением сроков сохранения их антигенсвязывающей способности. В частности, использование названного гомолога к концу периода хранения при +37°С почти двукратно увеличивало время, за которое происходила потеря 20% функциональной активности антител и обуславливала превышение показателя их антигенсвязывающей способности на 79.0% по сравнению с интактными антителами. В свою очередь использование длинноцепочечных гомологов АОБ в динамике хранения хотя и вело к частичному восстановлению показателей связывания модифицированных ими антител с соответствующими антигенами, не сопровождалось значимым увеличением сроков сохранения подобной функциональной активности.

Полученные результаты определили перспективу инновационного подхода к стабилизации иммунных белков как результата их взаимодействия с АОБ, включающего определение химической структуры стабилизатора (Сг АОБ) и его оптимальной концентрации (10″ 4М), не оказывающих негативного эффекта на антигенсвязывающую способность и другие значимые характеристики антител, но позволяющих достичь увеличения сроков сохранения их функциональной активности при длительном нахождении в водных растворах. Приоритет подобного подхода закреплен «Способом стабилизации антител в водных растворах» (положительное решение ФИПС по заявке на изобретение № 2 010 136 488 от 30.08.2010 г.).

Таким образом, проведенное исследование, свидетельствующее о взаимодействии малых регуляторных молекул из группы алкилоксибензолов с антителами, изменяющем их функциональные характеристики и параметры стабильности, приобретает оригинальные медико-биологические и биотехнологические приложения. С одной стороны, полученные результаты позволяют раскрыть' новые механизмы взаимодействия «микроорганизм-макроорганизм», определяемые бифункциональностью длинноцепочечных гомологов АОБ в подобной системе и потенциально ведущие к созданию на данной основе новой группы иммуномодуляторов. С другой стороны, в ряде случаев полученные результаты могут быть биотехнологически полезными, что заключается в возможности длительного сохранения функциональных характеристик антител при их модификации короткоцепочечными АОБ.