Молекулярные колонии

Актуальность проблемыПринцип метода молекулярных колоний (ММК) заключается в том, чтонуклеиновые кислоты экспоненциально размножают при помощи полимеразне в жидкой среде, как обычно, а в иммобилизованной среде, например, в геле. В результате иммобилизации среды потомство каждой исходной молекулыне распространяется по всему реакционному объему, а концентрируется в ограниченной зоне вокруг родительской молекулы, то есть образует колонию. Таким образом, отдельную молекулу можно размножить до детектируемогочисла идентичных молекул, что дает возможность обнаруживать, идентифицировать и подсчитывать единичные молекулы. Удобнее анализировать молекулярные колонии, расположенные в виде двумерного рисунка, для чего размножение осуществляют в тонком слое геля. Впервые мы опубликовали метод молекулярных колоний в 1991 году, применив его для обнаружения в воздухе единичных молекул реплицирующихся матриц, вьфащивая колонии РНКв агарозе, содержащей QP-репликазу (РНК-зависимую РНК-полимеразу фагаQP) и рибонуклеозидтрифосфаты (Chetverin et al. 1991). Тогда же мы предложили использовать аналогичный подход для выращивания колоний ДНК, атакже использовать молекулярные колонии для таких направлений, как изучение реакций между одиночными молекулами РНК, точная молекулярнаядиагностика, клонирование и экспрессия генов in vitro. Все это содержится впатентах на метод молекулярных колоний, полученных нами в России и США (Четверин и Четверина 1995, 1998а, 19 986- Chetverin & Chetverina 1997, 1999а, 1999b). Реализация сформулированных идей позволила бы дать мощный инструмент для молекулярной биологии и биотехнологии. Именно этому посвящена данная работа, что и определяет ее актуальность. После серии нашихпубликаций, продемонстрировавших уникальные возможности метода молекулярных колоний, его потенциал был осознан на Западе, где он стал известенпод названием «метод полоний» (то есть «полимеразных колоний»), даннымему Чёрчем и сотрудниками (Гарвардский университет, США) (Mitra &1999). С тех пор метод молекулярных колоний с успехом применяется12 В ряде зарубежных лабораторий для решения разнообразных фундаментальных и прикладных задач. Данная работа выполнена в рамках тем «Разработка бесклеточной системы репликации РНК» (государственный регистрационный номер 01.8.70 31 902), «Конструирование и исследование РНК-векторов» (01.960.5 897) и"Развитие метода молекулярных колоний: Исследование механизма рекомбинации РНК, молекулярная диагностика и клонирование генов in vitro" (0120.404 412).

Цель и задачи исследования

Целью работы явилось развитие метода молекулярных колоний и изучение его возможностей для обнаружения, клонирования и анализа молекулнуклеиновых кислот. В качестве основных направлений работы бьши выбраны исследование явления рекомбинации РНК in vitro (как демонстрация научного потенциала метода), разработка методов молекулярной диагностики (какдемонстрация практического применения метода), а также срштез и экспрессия генов в молекулярных колониях (что может иметь как научное, так ипрактическое значение).Для достижения этой цели бьши поставлены и решены следуюш-ие задачи исследования.1. Создание чистой бесклеточной системы для изучения рекомбинации РНК.

2. Изучение механизма образования рекомбинантных РНКв частности, выяснение возможности рекомбинации РНК без участия ДНКинтермедиатов.3. Разработка способа выраш, ивания колоний ДНК посредством осуществления полимеразной цепной реакции в геле.4. Разработка методов детекции молекулярных колоний с использованиемфлуоресцентных зондов.5. Разработка способов диагностики инфекционных и онкологических заболеваний.6. Разработка метода клонирования генетического материала in vitro, включающего выращивание колоний ДНК, их экспрессию (транскрипцию итрансляцию) и скрининг in situ.13Научная новизна и практическая значимостьВ работе показано, что, по сравнению с размножением нуклеиновых кислот в жидкости, метод молекулярных колоний обладает рядом преимуществ: позволяет прямо подсчитывать число исходных молекул и прямо клонироватьмолекулы, без использования традиционных методов генной инженерии. Метод исключает взаимную конкуренцию разных молекул (поскольку их синтезпространственно разделен), что позволяет преодолеть помехи со стороны неспецифического (фонового) синтеза нуклеиновых кислот и размножать сложные смеси матриц без риска потерять редкие и неэффективно размножаемыевиды. На примере исследования рекомбинаций — очень редких реакций междумолекулами РНК, а также на примере детекции вирусных нуклеиновых кислоти РНК-маркеров онкологических заболеваний в образцах крови и костногомозга продемонстрирована уникальная способность метода обнаруживатьодиночные молекулы РНК или ДНК определенного вида среди огромной массы посторонних нуклеиновых кислот. Полученные результаты существенно расширили представления о рекомбинации РНК. Доказано существование рекомбинации на уровне РНК, обнаружено многообразие механизмов рекомбинации РНК, осуществляемойразными РНК-зависимыми РНК-полимеразами, открыто явление спонтаннойрекомбинации РНК. Создана ПЦР-версия метода молекулярных колоний, использующая полимеразную цепную реакцию для выращивания колоний ДНК. В отличие отQp-репликазной версии, позволяющей выращивать колонии РНК только определенного вида, данный метод позволяет размножать в виде молекулярныхколоний любую нуклеотидную последовательность. На основе ПЦР-версииметода молекулярных колоний созданы способы диагностики инфекционныхи онкологических заболеваний, для чего разработана полная диагностическаяпроцедура, включающая в себя новый способ консервации биологическогоматериала и новый универсальный метод выделения нуклеиновых кислот изклинических образцов. Разработаны способы обнаружения колоний с помощью флуоресцентньпс зондов, в том числе, способы обнаружения растущих14колоний в реальном времени с использованием гомогенных флуоресцентныхсистем детекции. Разработан метод клонирования генетического материала in vitro, включающий получение колоний ДНК, а также их экспрессию (транскрипцию итрансляцию). Продемонстрирована возможность скрининга клонов in situ пофункции кодируемого белка. Апробация работыМатериалы диссертационной работы были представлены на открытомсеминаре Лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН (2006), на ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино, 19 952 006), на международных конференциях: Энгельгардтовские конференции помолекулярной биологии (2000, 2004, 2006), конференции «Frontiers in Bioprocessing II» (Colorado, USA, 1991), «First German-Russian Smnmerschool on in vitro Systems» (Берлин, Германия, 1994), конференции Медицинского институтаГоварда Хьюза (Прага, Чехия, 1996; Варшава, Польша, 1997; Будапешт, Венгрия, 1998; Чеви Чейз, Мэрилэнд, США, 2000; Ванкувер, Канада, 2001; ПалмКоув, Австралия, 2002, Мерида, Мексика, 2005), конференции RNA society (Висконсин, США, 1996; Эдинбург, Великобритания, 1999), U.S. — RussianWorkshop «Ecology of Infectious Diseases» (Новосибирск, Россия, 2002), II Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективыразвития» (Москва, Россия, 2003), конференция «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Новосибрфск, Россия, 2006), конференция «Генетика вРоссии и мире» (Москва, Россия 2006), — а также на конференциях и школахмолодых ученых (Рига, Латвия, 2000, Ижевск, Россия, 2004, Москва, Россия, 2004, 2005, Пущино, Россия, 2005, 2006).ПубликацииРезультаты исследования опубликованы в 58 работах, в том числе в 18статьях, 6 патентах (3 патента РФ и 3 патента США), 5 заявках на патент (3заявки на патент РФ и 2 международные заявки) и 29 сообщениях (тезисыконференций).15Финансовая поддержка работыРабота выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук (программа «Молекулярная и клеточная биология»), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 93−04−6550, 96−04−48 329, 96−04−48 331,99−04−48 672, 02−04−48 320, 05−04−48 897), Федеральной целевой паучнотехнической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002;2006 годы (госконтракты43.035.1.1.1527/ИБ и 02.434.11.3024), Медицинского института Говарда Хьюза (гранты 75 195−544 701 и INTNL55000302), Европейского агентства ИНТАС (гранты 95−1365, 97−1034, 01−2012), Международного научного фонда (грантыМТО 000 и МТО 300).БлагодарностиДанная работа была выполнена в лаборатории биохимии вирусных РНКИнститута Белка РАН. Автор выражает руководителю лаборатории и своему постоянному соавтору А. Б. Четверину искреннюю признательность и сердечную благодарностьза постоянное внимание и поддержу, советы и рекомендации при постановкеэкспериментальных задач, стимулирующие и плодотворные обсуждения, засоздание творческой и благожелательной атмосферы в лаборатории. Автор благодарит своих коллег и соавторов — сотрудников ИнститутаБелка В. И. Угарова, Т. Р. Саматова, М. В. Фалалееву, А. А. Демиденко, Д. Копеина, А. В. Русинову (Кравченко), Ю. А. Заболотневу, а также сотрудников НИИ детской гематологии Минздрава РФ — В. О. Бобрынину иМ. А. Масчана. Автор приносит искреннюю благодарность и глубокую признательностьакадемрпсу РАН А. Спирину за постоянное внимание, интерес и поддержкуданной работы. Автор благодарен д.ф.-м.н. А. В. Финкельштейну за консультацию пооценке вероятностей выделения клонов. Автор благодарен В. И. Присяжному за предоставление реактивов дляхимических модификаций РНК и очистки белков.16Автор благодарит за предоставление плазмидных конструкций или материала для их создания: А. П. Алимова (Институт Белка РАН, Пущино), В. Н. Ксензенко (Институт Белка РАН, Пущино), ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово. Новосибирская обл.), Е. Высоцкого (Институт биофизики, Красноярск), Е. В. Флейшман и И. Косорукову (Институт Канцерогенеза РОНЦ, Москва), Н. Н. Угарову (Московский Государственный Университет), Дабровски иЙ. Кур (Технический университет Гданьска, Польша), П. Кэсберг, А, Палменберг и П. Шекли (Университет штата Висконсин, США), Тайаги (Народный институт здоровья, Нью-Йорк, США), Шульц (Университет Колорадо, США).Автор благодарит за техническую помощь постоянных сотрудников лаборатории Н. И. Андросову, Л. В. Шутову, Т. М. Попкову, А. А. Андросову, атакже студентов, выполнявших курсовые и дипломные работы Е. А. Узлову, 3. В. Валину, А. В. Симоненко, 3. К. Тнимова, Д. В. Лесняка. Автор благодарит всех сотрудников лаборатории за доброе отношение и помощь в работе, атакже всех сотрудников Института Белка, способствовавших выполнениюданной работы.

1. На основе QP-ренликазной версии метода молекулярных колоний иссле довано явление рекомбинации РЬЖ in vitro:

1) создана нервая чистая бесклеточная система рекомбинации РНК;

2) внервые нрямо продемонстрирована снособность молекул Р1Ж к ре комбинации без участия ДНК-интермедиатов;

3) обнаружено многообразие механизмов ренликативной рекомбинации.

РНК, осуществляемой разными РНК-зависимыми РНК-нолимеразами;

4) открыто явление саморекомбинации РНК.

2. Создана ПЦР-версия метода молекулярных колоний, иснользующая, но лимеразную ценную реакцию для выращивания колоний ДНК в нолиак риламидном геле. Разработаны способы обнаружения колоний ДНК с по мощью флуоресцентных зондов, в том числе снособы обнаружения рас тущих колоний в реальном времени с использованием гомогенных флуо ресцентных систем детекции. 3. На основе НЦР-версии молекулярных колоний разработана полная проце дура диагностики инфекционных и онкологических заболеваний. Метод.

выявляет 100% молекул ДНК-мишени и 50% молекул РНК-мишени в био логических образцах и обладает высокой надежностью и специфично стью. Нродемонстрировано, что разные мишени не мешают онределению.

друг друга, даже если их титры различаются более чем в миллион раз, и.

что обнаружению мишени не мешает присутствие триллион-кратного из быгка посторонних нуклеиновых кислот. 4. С номощью молекулярных колоний осуществлено нолноценное клониро вание генетического материала, включая экснрессию и скрининг клонов in.

situ по функции кодируемого белка.