Репаративный остеогенез при ксенотрансплантации пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека

1.1.

Актуальность темы

.

Современные травмы опорно-двигательного аппарата, различные дегенеративные заболевания костной и хрящевой тканей нередко характеризуются большой тяжестью. Растущая распространенность заболеваний, ранняя трудовая и бытовая инвалидизация свидетельствуют об отсутствии эффективных средств медикаментозного или хирургического лечения [3, 8]. Несмотря на то, что костная ткань обладает высокой восстановительной способностью, в ряде случаев репаративный процесс в костной ткани даже при использовании различных остеопластических и остеоиндуктивных материалов не заканчивается восстановлением ее структуры и функции. Подобные состояния, обусловленные разрушением или несостоятельностью камбиальных клеточных элементов костной ткани, можно охарактеризовать как «остеогенную недостаточность» [8].

Регенерация кости — сложный многоступенчатый процесс, составляющими которого являются миграция, пролиферация, дифференцировка различных клеточных популяций мезенхимального происхождения. Регенерация костной ткани и развитие кости в эмбриогенезе протекают с участием незрелых клеток мезенхимы, которые сохраняются в так называемых стволовых нишах периоста, эндоста и костного мозга [55, 138, 173].

Учитывая недостаточность функционально 1 активных предшественников остеобластов, при лечении обширных травм и дегенеративных заболеваний кости особое значение приобретают методы, связанные с трансплантацией собственных или аллогенных клеток-предшественников. В связи с развитием клеточной биологии стало возможным в лабораторных условиях получать культуры стволовых/прогениторных клеток и трансплантировать их с целью стимуляции регенерации костной и хрящевой тканей.

Можно выделить три популяции самообновляющихся клеток, которые обладают высоким пролиферативным потенциалом и обусловливают рост и перестройку костной ткани [173, 181, 222]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [17, 126], остеобласты (ОБ) [74] и хондробласты (ХБ) [20, 118] благодаря их высокой пролиферативной активности, могут быть успешно получены, размножены в культуре и использованы для стимуляции регенерации при различных заболеваниях костной и хрящевой тканей.

Разработка методов селективного выращивания стволовых и прогениторных клеток костного мозга, хряща и периостиума привела к ощутимому прогрессу фундаментальных исследований в области механизмов регенерации костной и хрящевой ткани in vitro и in situ. Однако современная реконструктивная хирургия пока не имеет надежных клеточных технологий, которые бы обеспечивали стимуляцию направленной регенерации кости и хряща. Несмотря на большое количество экспериментальных исследований на животных с использованием ММСК, хондрои остеопрогениторных клеток, предпочтительная стратегия подготовки клеточного трансплантата для репаративного остеогенеза и хондрогенеза не сформулирована, поскольку существует несколько лабораторных путей репаративного гистогенеза кости как из прикрепленных к различным носителям клеток, так и суспензионной культуры [14, 70, 145]. Большинство исследований в этой области посвящены изучению репаративного остеогенеза при трансплантации аутологичных остеогенных клеток с использованием трехмерных конструкций из различных остеопластических материалов [32, 47, 116, 143]. Эти материалы обладают выраженной остеоиндуктивной активностью, являясь компонентами органического или неорганического матрикса кости и/или сорбируя на своей поверхности факторы роста и регенерации костной ткани [60, 80, 130, 217]. Однако плохо изученным остается вопрос о стимуляции регенерации кости и ее механизмах при введении только клеток предшественников без дополнительного действия остеопластических материалов. Причиной этого, по всей видимости, является отсутствие адекватной экспериментальной модели повреждения кости, которая позволила бы эффективно апплицировать и иммобилизовать суспензионный клеточный трансплантат.

Современные методы селективного культивирования ММСК и ХБ позволяют эффективно избавляться от примеси предшественников иммунокомпетентных клеток, несущих антигены главного комплекса совместимости II класса, что позволяет избежать развития реакции «трансплантат против хозяина». В ряде работ и нашем исследовании было показано, что при длительном культивировании существенно снижается уровень экспрессии НЬА I [135]. Кроме того, в настоящее время широко изучается иммуномодулирущий эффект ММСК, который проявляется ингибирующим действием на пролиферацию Т-лимфоцитов при сокультивировании и супрессией Т-клеточного ответа при реакции смешанных лимфоцитов [102, 123, 136], экспрессией и синтезом различных противовоспалительных и иммуномодулирующих цитокинов, факторов роста (ТОБ, НОБ, 1Ь-3 и др.) [78, 122]. Трансплантация даже аллогеных МСК пролонгирует выживаемость ксенои аллографтов. Безопасность и эффективность применения аллогенных и ксеногенных стволовых/прогениторных клеток для регенерации костной ткани и необходимость проведения иммуносупрессивной терапии требует дальнейшего изучения.

В свете приведенных положений разрабатываемая нами проблема является актуальной и представляет не только теоретическое, но и практическое значение, что определяет тему данного экспериментального исследования.

1.2. Цель исследования.

Изучить влияние трансплантации пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. и хондробластов человека на репаративный остеогенез трубчатых костей крыс в эксперименте.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить культуры пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и хондробластов гиалинового хряща человека, охарактеризовать фенотип полученных культур.

2. Разработать экспериментальную модель повреждения бедренной кости для введения суспензионного трансплантата мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов.

3. Оценить влияние суспензии мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов при ксенотрансплантации на скорость и качество регенерации костной ткани диафиза бедра крысы.

4. Изучить особенности репаративного остеогенеза на противоположной конечности при односторонней трансплантации клеток.

5. Провести сравнительную оценку репаративного потенциала обоих типов клеток.

1.3. Научная новизна.

Данная работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проводится оценка стимуляции регенерации костной ткани при ксенотрансплантации суспензионного клеточного трансплантата мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека на модели повреждения бедренной кости у крыс. Кроме того, исследован системный (дистантный) эффект стимуляции регенерации кости на противоположной конечности при односторонней трансплантации клеток.

В ходе исследования разработана модель экспериментального повреждения кости для оценки влияния суспензии мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов на эндоостальный и костномозговой остеогенез.

Установлено, что костная ткань, образующаяся при трансплантации ММСК и ХБ, встраивается в костный орган и подвергается полноценному ремоделированию, что приводит к восстановлению целостности органа.

Впервые было проведено сравнительное исследование репаративного потенциала двух типов клеток: мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов.

Показано, что ксенотрансплантация пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов без проведения иммуносупрбссии не вызывает осложнений и местных реакций отторжения трансплантата.

1.4 Научно-практическая значимость.

Анализ полученных экспериментальных результатов позволяет разработать и внедрить в клиническую практику метод стимуляции регенерации дефекта костной ткани путем трансплантации пренатальных ММСК и ХБ, используя их выраженную остеогенную активность in situ и возможность крупномасштабного получения культур этих клеток.

1.5. Положения, выносимые на защиту.

1. Трансплантация ксеногенных пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов обеспечивает стимуляцию регенерации костной ткани, при этом образованная костная ткань встраивается в костный орган, подвергается ремоделированию и морфологически не отличается от окружающей кости.

2. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки обладают более выраженным остеорепаративным потенциалом, чем хондробласты.

3. При локальном одностороннем введении клеточного трансплантата имеет место системный эффект стимуляции регенерации кости.

1.6. Апробация работы.

Основные положения работы доложены на: II Московском международном конгрессе «Биотехнология и медицина» (2003 г., Москва) — XXXI Annual ESAO congress (2004 г, Варшава) — Московской научной конференции «Клиническая трансплантация органов» (2005 г., Москва) — II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (2005 г., Москва) — Межлабораторной научной конференции в НИИ морфологии человека РАМН (2006 г., Москва) — Научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (2006 г., Москва).

1.7. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 в центральной печати, получен 1 патент.

1.8. Объем и структура работы диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Литературный указатель включает в себя 226 источников, из них 32 — отечественных, 194 — иностранных. Работа иллюстрирована 60 фотографиями, 35 таблицами.

выводы.

1. Разработана экспериментальная модель, позволяющая фиксировать суспензионный клеточный трансплантат в области дефекта костной ткани с помощью полупроницаемой полиэфирсульфоновой мембраны, которая отграничивала периостальный остеогенез от эндостального и костномозгового.

2. Трансплантация ксеногенных пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека в область дефекта кости крысы приводит к ускорению регенерации на 10, 30 сутки наблюдения за счет увеличения площади костной части регенерата, зрелой компактной кости и уменьшения доли рыхлой соединительной ткани. При трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток выявлено более выраженное ускорение регенерации, чем при введении хондробластов в основном за счет увеличения доли зрелой компактной костной ткани.

3. Выявлен системный (дистантный) эффект стимуляции регенерации на противоположных конечностях при одностороннем введении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов на 10, 30 сутки эксперимента.

4. На отдаленных сроках (90 сутки) после трансплантации клеток в области дефекта формировался полноценный костный регенерат.

5. На исследуемых сроках ксенотрансплантация пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов без проведения иммуносупрессивной терапии не вызывала осложнений, местных реакций отторжения трансплантата.

6. Получены и охарактеризованы культуры пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и хондробластов гиалинового хряща человека. В гиалиновом хряще плода с увеличением срока гестации увеличивается количество клеток, синтезирующих тканеспецифический маркер, коллаген II типа. 7. Полученные результаты служат экспериментальным обоснованием для применения аллогенных трансплантаций пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов при лечении обширных дефектов костной ткани в клинической практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Объектом изучения в настоящей работе служили особенности репаративного остеогенеза трубчатых костей крыс при ксеногенной трансплантации суспензии пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека. Основной из поставленных вопросов состоял в том, как влияют на скорость и качество регенерации костной ткани эти виды клеточных трансплантатов.

Основными задачами нашего исследования были получение и характеристика культур клеток, трансплантация которых приводит к стимуляции репаративного остеогенеза. Можно выделить три популяции самообновляющихся клеток, которые обладают высокой пролиферативной активностью и обусловливают рост и перестройку костной ткани. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, остеобласты и хондробласты могут быть успешно получены, размножены в культуре и использованы для стимуляции регенерации при различных заболеваниях костной и хрящевой тканей [7, 20, 86].

Как указывалось выше, источниками ММСК служат глубокий слой надкостницы, эндост, костный мозг и периферическая кровь [57, 111, 126, 189]. Большинство клеточных биологов для получения культуры ММСК используют преи постнатальный костный мозг, из клеток которого при ведении культуры в селективных культуральных средах и пассировании с низкой плотностью удается выделить клоногенную культуру ММСК [49, 50, 63, 170]. При добавлении в культуру различных факторов роста и дифференцировки можно получить клетки с миогенным, остеогенным, хондрогенным, адипогенным и другими фенотипами [17, 153, 220].

Крайне интересным и малоизученным остается вопрос участия хрящевой ткани в регенерации кости. Некоторые исследователи рассматривают образование гиалинового хряща при репаративном остеогенезе как патологический процесс, который протекает в условиях нарушенного кровоснабжения [66, 77, 82, 164]. В ряде ситуаций при обширных дефектах кости, недостаточности кровоснабжения и др. формируется ложный сустав, то есть дефект заполняется фиброзной или хрящевой тканями, не выполняющими функции опорного органа. Однако процесс формирования временной хрящевой ткани может рассматриваться и как компенсаторный механизм. В ряде исследований было показано, что в условиях гипоксии ММСК как in vivo, так и in vitro дифференцируются в хрящевые клетки [17, 26, 63, 110].

Для проведения исследования из стромы костного мозга нами были получены мультипотентной мезенхимальной стромальной клетки (ММСК). С помощью проточной цитофлуометрии был охарактеризован иммунофенотип ММСК по основным позитивным (CD 44, CD 90, CD 105) [170, 171] и негативным (CD 34, HLA DR) маркерам [170, 171].

Для получения культуры ХБ мы использовали пренатальный гиалиновый хрящ разных сроков гестации: 8−12 и 18−20 недель развития. В эмбриогенезе основная часть хрящевой ткани in situ возникает из конденсатов мезенхимальных клеток [183]. При накоплении «критической массы» мезенхимы мезенхимальные клетки обратимо дифференцируются в хондробласты (хондропрогениторные клетки), которые синтезируют экстрацеллюлярный матрикс другого типа: не коллагена I типа, а специфические протеогликаны и коллаген II типа [183], которые таким образом являются их маркерами. В тоже время ХБ сохраняют высокую пролиферативную активность. Эта зародышевая гиалиновая хрящевая ткань является главным источником ХБ. На внутриутробных стадиях развития хрящевая ткань состоит в основном из пролиферирующих хондропрогениторных популяций без примеси ангиогенных клеток и остеобластов. При формировании зачатков конечностей ткань состоит главным образом из мезенхимальных клеток и небольшого количества ХБ. В дальнейшем (стадия роста) количество ХБ увеличивается во много раз, и этот тип клеток временно начинает преобладает над остальными. В постнатальном периоде развития ХБ сохраняются только в перихондриуме и эпифизарных пластинках кости, обусловливая энхондральный рост костной ткани [66, 77, 164, 186]. Таким образом, пренатальная гиалиновая хрящевая ткань может быть использована для получения однородных культур ХБ без примеси ММСК и мезодермальных прогениторных клеток.

Однако в процессе нашей работы были выявлены четкие различия в первичных культурах, полученных из гиалинового хряща на разных сроках гестации. Клетки в первичных культурах, полученные из абортного материала на 8−12 неделях беременности, были представлены клетками полигональной и вытянутой формы с минимальным количеством отростков, тогда как первичные культуры из материала более поздних сроков беременности (18−20 нед.) были представлены клетками округлой и I полигональной формы без отростков. При иммуноцитохимическом исследовании количество коллаген П-синтезирующих клеток возрастало с увеличением сроков гестации.

Кроме того, при сравнении первичной и многократно пассированной культур также отмечались различия внешнего вида полученных клеток и их иммунофенотипа, что, по всей видимости, обусловлено изменениями ХБ при культивировании. Это феномен широко описан в литературе [92, 105, 131, 206]. Многие исследователи при культивировании дифференцированных клеток гиалинового хряща на пластике отмечали, что клетки, особенно посеянные с низкой плотностью, достаточно быстро приобретают «фибробластоподобную», веретеновидную форму и, более того, перестают синтезировать коллаген II типа [206]. По этим причинам в нашем исследовании для трансплантации использовали культуры ХБ пренатальной гиалиновой хрящевой ткани, полученные из абортного материала на 18−20 неделях гестации и пассированные с высокой плотностью не более двух раз. Полученная культура по своим фенотипическим характеристикам отвечала целям и задачам исследования.

Таким образом, для стимуляции регенерации костной ткани использовались мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки и хондробласты с высокими остеогенными и остеоиндуктивными потенциями [17, 20]. При их трансплантации в виде суспензии в области дефекта формировалась полноценная костная ткань. Морфологически ее развитие повторяло обычные стадии нормального развития и регенерации трубчатых костей, то есть происходило формирование грубоволокнистой и пластинчатой костной ткани с ее последующим ремоделированием.

Решающим моментом в данной работе был выбор экспериментальной модели. Основное требование к модели повреждения состояло в том, чтобы было возможно эффективно фиксировать суспензионный клеточный трансплантат в области дефекта. Как показали наши наблюдения, полиэфирсульфоновая мембрана, будучи удачно зафиксированной, сохранялась в области имплантации до конца эксперимента. Кроме того, оказалось, что, препятствуя усиленному проникновению в костный дефект периостальных элементов, она накладывала определенный отпечаток на течение репаративного процесса, который осуществляется в этом случае преимущественно за счет вненадкостничного клеточного пула, т. е. за счет клеток, оказавшихся в самом костном дефекте. На данной экспериментальной модели мы оценивали влияние трансплантации ММСК и ХБ на скорость и качество регенерации кости.

Для оценки возможного системного (дистантного) эффекта стимуляции регенерации были созданы две контрольные группы. Учитывая наиболее вероятный механизм остеостимулирующей активности клеточной трансплантации — первичную и вторичную индукцию репаративных процессов за счет различных факторов роста и регенерации, которые могут иметь как местное, так и системное действие, — дефект кости на противоположной конечности не мог рассматриваться как контроль. Поэтому в контрольную группу входили животные, которым воспроизводили дефект на обеих конечностях и вводили физиологический раствор. Таким образом, отработанная экспериментальная модель, на наш взгляд, отвечала целям и задачам нашего исследования.

В настоящее время отсутствует четкое понимание процессов, лежащих в основе стимуляции регенерации при трансплантации стволовых/прогениторных клеток. Одним из вероятных механизмов регенерации является способность пересаженных клеток приживаться, пролиферировать и дифференцироваться в специализированные клетки и, таким образом, восстанавливать структуру и функцию поврежденной ткани [63, 68, 107]. Другим свойством стволовых/прогениторных клеток является продукция ряда факторов роста и дифференцировки, которые регулируют пролиферацию и дифференцировку как трансплантированных клеток, так и клеток реципиента в месте повреждения, стимулируя таким образом процессы регенерации [138]. Кроме того, некоторые исследователи продемонстрировали противовоспалительную и иммуномодулирующую активность стволовых клеток, в особенности мезенехимальных [40, 102, 122, 123].

При аллогенных и даже ксеногенных трансплантациях также было показано, что пересаженные клетки могут выживать, пролиферировать, мигрировать в место повреждения, дифференцироваться в специализированные клетки и участвовать в процессах репарации. В некоторых исследованиях клинический и гистоморфологический эффект подобных трансплантаций сопоставим с аутологичными пересадками [72, 140, 159, 212]. Это может объясняться тем, что современные методы культивирования позволяют максимально освободиться от клеток крови, иммунокомпетентных клеток и их предшественников. Селективное культивирование и применение гомогенных клеточных культур позволяет исключить развитие реакции «трансплантат против хозяина». Кроме того, в ряде работ было отмечено, что при культивировании снижается уровень экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса, что подтверждается и в нашем исследовании [20].

В задачу нашей работы не входило изучение механизмов регенерации при трансплантации клеток, судьба пересаженных клеток, их выживаемость, пути миграции, пролиферация и направление дифференцировки. Основной вопрос, который мы перед собой ставили — как ксенотрансплантация ММСК и ХБ человека влияет на скорость и качество регенерации трубчатой кости крысы.

При изучении влияния трансплантации клеток на процессы регенерации костной ткани основными методами наблюдений служили контроль общего состояния животных в ходе эксперимента, исследование экспериментальных ран и макропрепаратов на аутопсии животных, гистоморфологическое и морфометрическое исследования костного регенерата и окружающих тканей в динамике через 10 — 90 суток после операции.

В раннем и позднем послеоперационном периоде состояние животных оставалось удовлетворительным, неугнетенным, без местных патологических реакций и осложнений. В области введения клеточных трансплантатов, ксеногенных для подопытных животных, не наблюдалось сколько-нибудь выраженных реакций отторжения, воспаления, лимфогистиоцитарной инфильтрации. На 90 сутки наблюдения в опытных и контрольных группах в области дефекта диафиза бедренной кости сформировалась полноценная костная ткань, восстанавливающая структуру и функцию костного органа. Следует подчеркнуть, что ни в одной из групп в течение всего срока наблюдения не образовалось избыточного количества костной ткани, которая выступала бы за края дефекта или превосходила материнскую кость по толщине. Несмотря на высокий пролиферативный потенциал ММСК и ХБ, остеогенные потенции этих клеток реализуются только в той степени, в которой это необходимо для восстановления целостности костного органа.

Основные гистоморфологические и морфометрические различия между экспериментальными группами были выявлены на 10 и 30 сутки наблюдения.

Через 10 суток от начала опытов во всех группах опытов наблюдалось образование регенерата, состоящего из двух компонентов: соединительнотканного и костного. В группе с введением в костную рану ММСК наблюдалось интенсивное увеличение массы его костной составляющей при соответственном уменьшении доли соединительной ткани. Отмечалось также повышение уровня созревания костного вещества. В группе ММСК-опыт также отмечалось увеличение доли костной части регенерата по сравнению с костной раной на противоположной конечности (ММСК-контроль). Следует отметить, что в группе ММСК-опыт костная регенерация протекала заметно активнее, чем в группе ХБ-опыт. Группа с введением в костную рану ХБ к 10 суткам опыта продемонстрировала значимое увеличение доли костной части регенерата как по сравнению с контрольной группой, так и с группой ХБ-контроль. Таким образом, было выявлено что под влиянием введения в костные раны суспензии ММСК и ХБ происходило ускорение репаративного остеогенеза, причем в группе с введением ММСК более выражено, чем в группе ХБ-опыт. Кроме того, в группах ММСК-контроль, ХБ-контроль доля костного компонента была значительно выше, чем в контрольной группе.

Как показали дальнейшие исследования, через 1 месяц от начала опыта в контрольной и опытных группах регенерат был целиком представлен костными структурами. В контрольных группах в регенерате сохранялись незначительные участки соединительной ткани. Таким образом, через 1 месяц более высокими оказались значения параметров, указывающие на активность процессов компактизации (увеличение доли зрелого костоного регенерата) и дифференциации костного вещества, особенно в группе ММСК опыт. На этих сроках наблюдения в опытных группах представляла интерес судьба полиэфирсульфоновой мембраны, ее соотношение с окружающими тканевыми структурами. На гистопрепаратах было отмечено, что мембраны прикрывали вход в костный дефект, т. е. располагались непосредственно над регенератом. А отступя в сторону от области травмы, можно было видеть нарастание пласта новообразованной костной ткани на мембрану. Судя по топике, новообразованная костная ткань была связана с периостом. Будучи плотно замурованной в новообразованной кости, полиэфирсульфоновая мембрана (непроницаемая для клеток) отчетливо разграничивала периостальный и внепериостальный репаративный остеогенез. Таким образом, можно предположить, что регенерация под полупроницаемой мембраной происходила за счет собственных клеток предшественников эндоста, периферической крови и трансплантированных клеток.

На второй месяц наблюдения во всех группах отмечалось дальнейшее развитие и дифференцировка костных * структур регенерата. Значимых различий между опытными и контрольными группами не отмечалось.

Одной из задач проведенного экспериментального исследования было гистоморфологическое изучение энхондрального остеогенеза при трансплантации хондробластов. Однако только у двух животных в группе с введением ХБ через один и три месяца в некоторых срезах были выявлены участки хондроидной ткани. Подобная гистологическая картина была выявлена и у одной крысы из контрольной группы, поэтому эти данные рассматривались как артефакт и не учитывались при статистической обработке материала. Несмотря на это, в сериях экспериментов с введением ХБ, особенно в группе ХБ-опыт, отмечалось ускорение процессов регенерации по сравнению с контрольной группой. В связи с этим можно прийти к заключению, что трансплантированные ХБ на данной модели повреждения кости длительно не сохраняются в области дефекта, не пролиферируют, не дифференцируются в хондроциты и не образуют временный гиалиновый хрящ. Стимуляция процессов регенерации при трансплантации ХБ реализуется благодаря активной продукции различных цитокинов, факторов роста и дифференцировки, которые ускоряют регенерацию за счет собственных клеток-предшественников.

В серии опытов с введением в дефект кости ММСК была получена максимальная скорость регенерации. Мультипотентной мезенхимальной стромальной клетки вырабатывают огромное количество различных цитокинов, факторов роста и регенерации, изучается их противоспалительная и иммуномодулирующая активность как при местных воспалительных реакциях, так и при системных. Комплекс таких факторов может обеспечить максимальную стимуляцию восстановления структуры и функции тканей. Кроме того, ММСК является предшественником как хондробластов, так и, остеобластов, поэтому можно предположить, что при незначительном объеме повреждения и в условиях обильного кровоснабжения ММСК выживали, пролиферировали и дифференцировались в остеобласты. Таким образом, в данном случае стимуляция репаративных процессов происходила не только за счет гуморальных факторов регуляции, но и с участием клеточных механизмов регенерации.

На всех сроках наблюдения был отмечен системный (дистанционный) эффект стимуляции регенерации кости, который заключался в ускорении процессов заживления костной раны на противоположной конечности при введении клеток в одну из конечностей. Восстановительные процессы в этих группах наблюдения протекали медленнее, чем в группах ММСК-опыт и ХБ-опыт, но значительно активнее, чем в контрольной группе. В основе этого наблюдения, вероятнее всего, лежит то, что те же самые факторы роста и регенерации, действующие в области введения клеток, попадая в общий кровоток, могут оказывать системное регенераторное влияние на все поврежденные органы и ткани организма, в том числе на противоположной конечности. Кроме того, нельзя исключить возможность попадания трансплантированных клеток, в общий кровоток и миграцию их за счет «хоуминга» в поврежденные ткани. Поэтому в нашем исследовании была заложена «чистая» контрольная группа, в которой животным воспроизводили костный дефект, но не вводили клеточный трансплантат.

В целом проведенные исследования показали, что разработанная экспериментальная модель повреждения кости позволила изучить влияние суспензионного клеточного трансплантата на репаративный остеогенез.

Введение

в костные дефекты клеточных трансплантатов ММСК и ХБ оказывало стимулирующее влияние на репаративный остеогенез, особенно выраженное на 10 сутки эксперимента. Этот эффект при одностороннем введении клеточного трансплантата обнаруживал себя на обеих конечностях, хотя и не в равной степени. В более отдаленные сроки наблюдений, помимо построения костных трабекул, в регенерате на первый план выдвигались процессы созревания костной ткани. На 90 сутки наблюдения во всех группах в области дефекта сформировался полноценный костный регенерат, и образованная костная ткань успешно встраивалась в костный орган. Ксенотрансплантация пренатальных ММСК и ХБ без проведения иммуносупрессии не продемонстрировала ранних и поздних осложнений, местных реакций отторжения трансплантата.

Полученные результаты могут служить экспериментальным обоснованием для имплантаций пренатальных ММСК и ХБ при лечении обширных дефектов костной ткани в клинической практике.