Получение и изучение свойств олигомерных форм неорганической пирофосфатазы Escherichia coli: Активация пирофосфатом

Неорганические пирофосфатазы гидролизуют неорганический пирофосфат до фосфатов. Пирофосфат образуется как побочный продукт многих биосинтетических процессов, таких как биосинтез нуклеиновых кислот и белков. Расщепление пирофосфата пирофосфатазой обеспечивает смещение этих равновесных процессов в сторону биосинтеза. Это делает фермент необходимым компонентом любой клетки. Во всех известных организмах пирофосфатазы являются конститутивными ферментами, т. е. регулируемыми на уровне их активности, а не экспрессии.

В настоящее время известны два семейства растворимых пирофосфатаз. Представители первого семейства являются глобулярными белками. Ферменты являются гомоолигомерами, пирофосфатазы эукариот, как правило, являются гомодимерами, прокариот — гомогексамерами [1]- максимальная активность проявляется в присутствии ионов Mg2+ [2]. Наиболее изученными представителями первого семейства являются пирофосфатазы Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae. Для этих ферментов известны пространственные структуры [4−14], подробно изучен механизм действия. Несмотря на невысокую степень гомологии аминокислотной последовательности, активный центр этих ферментов составляют консервативные аминокислоты. Механизмы действия пирофосфатаз из двух организмов очень схожи между собой.

Представители второго семейства обладают доменной структурой и максимальную активность проявляют в присутствии ионов марганца. Этот класс ферментов был открыт сравнительно недавно, но уже известны пространственные структуры ферментов из трех источников [15, 16]. Механизм гидролиза пирофосфата в общих чертах аналогичен механизму действия ферментов первого семейства.

Существует также отдельный класс пирофосфатаз, ассоциированный с мембранами (плазматическими или митохондриальными) и способных сопрягать гидролиз/синтез пирофосфата в активном центре с трансмембранным переносом Н+ [17].

Функционирование пирофосфатаз обнаруживает общие черты и с другими ферментами фосфорного обмена. Каталитические превращения пирофосфата могут служить удобной моделью для изучения механизма превращения фосфорсодержащих соединений в клетке под действием этих ферментов.

Объект настоящего исследования — неорганическая пирофосфатаза Е. coliотносится к первому семейству и представляет собой гексамер, состоящий из идентичных субъединиц. Каждая из субъединиц включает 175 аминокислотных остатков. Фермент является металлозависимым: для гидролиза пирофосфата требуется присутствие 3−4 ионов металламаксимальная активность достигается в присутствии ионов магния.

К данному моменту накоплено большое число данных биохимического и структурного анализа пирофосфатазы [9−13]. Всестороннее изучение пирофосфатазы позволило установить детальный механизм гидролиза субстрата, роль кофакторов в функционировании фермента и субстратной специфичности. Однако остается ряд нерешенных вопросов, в том числе регуляция активности и роль четвертичной структуры в функционировании фермента.

Одним из возможных путей регуляции является диссоциация молекулы пирофосфатазы. Для понимания взаимодействия субъединиц в катализе и роли четвертичной структуры фермента необходима разработка методов получения различных олигомерных форм и их кинетическая характеристика. Взаимодействие субъединиц олигомерного фермента при образовании четвертичной структуры может также служить моделью белок-белковых ^взаимодействий.

Настоящая работа посвящена исследованию межсубъединичных контактов фермента, роли четвертичной структуры. Для этого предстояло решить следующие задачи: (1) изучить кинетические свойства гексамерных форм пирофосфатазы с заменами в области межтримерного контакта или вблизи нее — Asp26Ala и Glul45Gln пирофосфатаз, а также модифицированного производным АТР по остатку Lys-146 фермента- (2) получить различные олигомерные формы нативной пирофосфатазы и ее мутантных форм, количественно охарактеризовать взаимные переходы- (3) исследовать кинетические свойства полученных форм.

Обзор литературы состоит из двух глав. Первая глава посвящена функционированию пирофосфатазы Е. coli, в ней описаны механизм действия фермента, строение активного центра и области контактов субъединиц, изменения структуры при связывании лигандов и введении мутаций. Поскольку в ходе работы выявлен факт активации гидролиза субстрата свободным пирофосфатом, во второй главе обзора литературы рассмотрены некоторые примеры ферментов, для которых характерна регуляция субстратом или его структурным аналогом.