Эпидемиологическая значимость молекулярно-генетических исследований атипичных вариантов возбудителей брюшного тифа

Актуальность темы

Брюшной тиф по-прежнему остается серьезной эпидемиологической проблемой для здравоохранения всего мира, включая страны СНГ. К числу регионов, неблагополучных по брюшному тифу, относятся и центрально-азиатские страны СНГ, что связано с социально-экономическими и природно-климатическими факторами (55, 129, 205).

Прогресс в науке и технике, в частности, в области физики и химии, способствует появлению множества мутагенных для живых организмов факторов, нарушающих сложившиеся экологические ниши. Химические соединения, которые используют в промышленности и в сельском хозяйстве, физические факторы: гамма лучи, УФ-лучи, радиационное излучение, а также широкое применение в медицинской практике различных химиотера-певтических препаратов привело к возникновению морфологически и биохимии-чески измененных вариантов патогенных микро-организмов, в том числе бактерий S. typhi (4,5,6,64,70,90). Изменения морфологических и биохимических свойств бактериальной клетки способствовало трансформации в развитии клинических и эпидемических процессов (17,25,47, 67, 125, 131). Кроме того, такие варианты сальмонелл почти не росли на средах, предназначенных для культивирования возбудителей брюшного тифа и трудно, поддавались идентификации (2,7,8,9,16,17). В связи с этим клинико-эпидемиологическая диагностика брюшного тифа остается трудно разрешимой задачей для лечебных и санитарно-эпидемиологических служб (26,29,32,44,57,122). В то же время существующие способы дифференциации сальмонелл, основанные на серологических и биохимических свойствах бактерий и их чувствительности к бактериофагам, не позволяют найти ее ответа. Однако для выявления и своевременной локализации любой инфекции необходим адекватный уровень эпидемиологического надзора (56,119,120,121). Рекомендуемые исследователями более чувствительные молекулярно-генетические методы идентификации сальмонелл, позволяющие провести дифференциацию на уровне серотипа, сложны, трудоемки и неприемлемы для практических лабораторий.

Несмотря на высокие показатели заболеваемости брюшным тифом в большинстве стран мира и периодические вспышки в экономически развитых странах, с генетической позиции S. typhi остаются мало изученными (125,128,160,164). Объектом исследований были и остаются наиболее генетически изученные представители семейства Enterobacteriaceae — Е. coli, S. typhimurium (124,127). Исходя из того, что по своей генетической структуре хромосома S. typhi несколько отличается от других сальмонелл, проведенное исследование расширяет представление об организации генома этого микроба, что, в свою очередь, создает предпосылки для решения существующих нерешенных проблем, связанных с заболеваемостью брюшным тифом (133,164,173,211,213).

Вышеизложенное повышает социальное и общемедицинское значение исследований возбудителя брюшного тифа как в плане необходимости улучшения диагностики, так и с точки зрения профилактики и лечения тифопаратифозных заболеваний.

Цель исследования Совершенствование системы эпидемиологического надзора за заболеваемостью брюшным тифом и рациональное планирование профилактических противоэпидемических мероприятий при осложнённых эпидемических ситуациях, на основе изучения биологических и молекулярногенетических особенностей атипичных вариантов S. typhi.

Задачи исследования.

1. Изучить биохимические и серологические особенности типичных и атипичных вариантов S. typhi, выделенных при осложненной эпидемической ситуации в различных регионах Таджикистана.

2. Определить чувствительность исследуемых штаммов к различным антибактериальным препаратам и наборам бактериофаговпредназначенных для фаготипирования брюшнотифозных сальмонелл.

3. Провести молекулярно-генетический анализ биохимически измененных и морфологически атипичных вариантов S. typhi, используя для этой цели современные методы молекулярно-генетических исследований.

4. Определить факторы формирования лекарственной устойчивости атипичных вариантов брюшнотифозных сальмонелл в сравнении с типичными штаммами.

5. Усовершенствовать систему эпидемиологического надзора за заболеваемостью брюшным тифом. :

Научная новизна.

1. Автором впервые использованы молекулярно-генетические методы: ПЦР (полимеразная цепная реакция) — анализ, ДНК-ДНК гибридизация, риботипирование, дающие возможность идентифицировать и дифференцировать различные варианты возбудителя брюшного тифа, что позволит практическим врачам и эпидемиологам в более короткие сроки (3−4 часа) диагностировать брюшной тиф и следовательно, организовать более раннее проведение • адекватных профилактических противоэпидемических мероприятий.

2. Впервые дана комплексная сравнительная характеристика биологических свойств атипичных штаммов S. typhi, циркулирующих в Таджикистане, в регионе со специфическими природно-климатическими факторами и социально-бытовыми условиями жизни населения.

3. Впервые проведен сравнительный молекулярно-генетический анализ атипичных вариантов брюшнотифозных сальмонелл и разработан ускоренный способ их индикации и идентификации, влияющий на эпидемиологический прогноз заболевания.

Практическая значимость Результаты исследования позволили выяснить эпидемиологические, микробиологические и генетические особенности атипичных вариантов возбудителя брюшного тифа, выделенных в различных регионах Таджикистана. Молекулярно-генетическое исследование хромосомной ДНК позволило объяснить механизм формирования лекарственной устойчивости и выявить эпидемически значимые штаммы, циркулирующих в республике. Установлено, что атипичные варианты S. typhi имеют повышенные значения минимальной ингибирующей концентрации для антибактериальных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Различные варианты брюшнотифозных сальмонелл, циркулирующие в Таджикистане, отличаются по ряду биологических признаков, которые необходимо учитывать для повышения эффективности эпидемиологической диагностики и рационального планирования противоэпидемических мероприятий в эпидочагах. В этиологической структуре и эпидемиологии брюшного тифа, наряду с типичными вариантами, ведущее место занимают биохимически и морфологически измененные варианты S. typhi (L-формы).

2. Брюшнотифозные сальмонеллы различных атипичных вариантов характеризуются индивидуальной вариацией чувствительности к антимикробным препаратам. Эти штаммы отличаются по уровню МИК. Биохимически и морфологически измененные штаммы S. typhi имеют повышенные значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) для многих антибактериальных препаратов, что необходимо учитывать при выборе противобрюшнотифозных средств.

3. ПЦР-анализ, риботипирование, ДНК-ДНК гибридизация могут быть использованы при ускоренной лабораторной диагностике и эпидемиологическом анализе заболеваемости брюшным тифом. Эти методы особенно эффективны при индикации и идентификации атипичных вариантов брюшнотифозных сальмонелл.

Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:

1. Высокой специфичностью использованных микробиологических и молекулярно-генетических методов, которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные для правильного планирования профилактических и противоэпидемических мероприятий в скрытых эпидочагах.

2. Проведением статистической обработки полученных данных общепринятыми методами.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции, посвященной 1100-летию государства Саманидов (Душанбе 1999г) — на научной конференции медицинских работников Таджикистана, посвященной памяти члена-корреспондента РАМН, профессора М.Г.Гуля-мова (1999г) — на научных конференциях кафедры микробиологии Таджикского государственного медицинского университета (1999, 2000 гг.) — на проблемной комиссии по теоретическим дисциплинам Таджикского государственного медицинского университета (2000 г.).

Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 100 страницах компьютерного набора, включающего введение, обзор научной литературы, описание материалов и методов исследований, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и список литературы. Работа проиллюстрирована 3 таблицами и 13 рисунками. Указатель литературы содержит 123 отечественных и 90 зарубежных источников.

Выводы.

1. В этиологической структуре брюшного тифа наряду с типичными вариантами ведущее место занимают биохимически и морфологически (L-формы) атипичные штаммы S. typhi, которые снижают возможность как бактериологического, так и серологического подтверждения диагноза брюшного тифа, тем самым, способствуя скрытому распространению среди населения эпидемического процесса и формированию эпидемических вариантов.

2. Типичные, биохимически измененные и морфологически атипичные штаммы S. typhi по своим ферментативным свойствам существенно отличаются. Появление нового биохимического признака влияет на метаболический процесс бактериального штамма. Лактозоположительные брюшнотифозные сальмонеллы проявляют несколько меньшую ферментативную активность, чем морфологически атипичные штаммы.

3. Штаммы различных вариантов S. typhi отличаются между собой по уровню МИК антибиотиков. Среди типичных культур брюшнотифозных сальмонелл, циркулирующих в Таджикистане, примерно одинаково встречаются штаммы с низкими и высокими показателями минимальной ингибирующей концентрации антибактериальных препаратов: ампициллина, хлорамфеникола, гентамицина, канамицина, ципралета" и фуразолидона. Биохимически и морфологически атипичные варианты имеют повышенные значения минимальной ингибирующей концентрации для всех использованных в работе противобактериальных препаратов.

4. Лекарственная устойчивость типичных и атипичных брюшнотифозных сальмонелл, циркулирующих в, а различных регионах Таджикистана, обеспечивается хромосомным фактором.

В условиях Таджикистана вспышки брюшного тифа обусловлены штаммами S. typhi фаговаров, А (22,8%) и ВЗ (19,8%), что необходимо учитывать при эпидемиологической диагностике й рационального планирования профилактических противоэпидемических мероприятий при эпидемических ситуациях.

5. На основании изучения эпидемиологических, биологических и молекулярно-генетических особенностей атипичных вариантов S. typhi, обосновано совершенствование эпидемиологического надзора за заболеваемостью брюшным тифом на экосистемном уровне.

Практические рекомендации.

1. Для выявления хронических бактерионосителей, т. е. скрытых источников брюшнотифозной инфекции, необходим посев исследуемого материала на специальные питательные среды, предназначенные для культивирования атипичных вариантов возбудителей брюшного тифа. Для этой же цели целесообразно наладить ПЦР — диагностику брюшного тифа в крупных лабораторных центрах Таджикистана, чтобы повысить качество эпидемиологического надзора.

2. Для проведения эффективной антибиотикотерапии и предотвращения хронического бактерионосительства при брюшном тифе лечащим врачам необходимо учитывать высокий уровень МИК антибактериальных препаратов для атипичных штаммов S.typhi.