Идентификация и свойства бета-лактамаз полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий

Актуальность проблемы.

Бактериальная резистентность к широко применяемым в клинике /-лактамным антибиотикам — пенициллинам и цефалоспоринам обусловлена в большинстве случаев их ферментативной инактивацией. Ферменты, инактивирующие /-лактамные антибиотики путем расщепления £-лактамного кольца, получили название ^-лактамаз.

— Лактамазы составляют обширную группу ферментов, различающихся по субстратной специфичности и другим свойствам. Наиболее многочисленную и сравнительно мало изученную группу^{-лак-тамаз} составляютлактамазы грамотрицательных.бактерий. Кроме того, внедрение в клинику. новых поколений пенициллинов. и цефа-лоспоринов приводит. к распространению в микробных популяциях-лактамаз с измененными субстратными спектрами, а также к появлению штаммов бактерий, содержащих в клетке две различных по субстратной. специфичности^{б-лактамазы.} Разностороннее. изучение каталитических и физико-химических свойств^{з-лактамаз} грамотрицательных бактерий является весьма актуальным, поскольку, эффективность антибиотикотерапии во многом зависит. от создания новых /-лактамных структур, не являющихся субстратами наиболее распространенных. £-лактамаз. Препараты £-лактамаз необходимы при оценке, .получаемых путем скрининга или химической, трансформации^{-лактамных} антибиотиков, а также при оценке ингибиторов^{-лактамаз,} которые могут быть использованы в комбинациях с^{-лактамными} антибиотиками.. Характеристика. /-лактамаз бактерий, выделяемых в клинике, необходима при изучении эпидемиологии антибиотикорезистент-ности. .

Цель и основные задачи работы.

Цель работы заключалась в идентификации, изучении свойств и классификации^{-лактамаз,} ввделенных из клинических полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae И роду Pseudomonas, Для ЭТОГО предстояло решить следующие основные задачи: — модифицировать микроиодометрический и потенциометричес-кий методы определения активности^{3-лактамаз} с целью их использования для работы как с пенициллинами, так и с цефалоспоринами;

— разработать быстрый метод дифференциации ^ß—лактамаз у штаммов, содержащих по две jß—лактамазы с разным субстратным спектром;

— определить субстратную, специфичность и провести классификацию >-лактнмаз, присутствующих у. полирезистентных жаммов, выявить среди них частоту встречаемости бактерий, содержащих в клетке одновременно две различные js-лактамазы;

— выделить, очистить до гомогенного состояния и исследовать физико-химические свойства /-лактамаз пенициллиназного и цефа-лоспориназного типов- .

— изучить особенности взаимодействия очищенных препаратов J3—лактамаз. -с ингибиторами — аналогами субстратов.

Научная новизна работы. Получены данные о субстратной. специфичности и распределении по классификационным группам ./-лактамаз полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий, выделенных в ряде клиник.

Разработаны схемы выделения высокоочищенных ферментных препаратов ß—лактамаз. .

Предложена модификация микроиодоме. трического метода определения активности yö—лактамаз, позволяющая использовать этот метод при сравнительных исследованиях ферментов, а также в случае испытания как субстратов не только пенициллинов, но и цефалоспо-ринов.

Внесены модификации в потенциометрический метод определения ,^-лактамазной активности, уменьшающие зависимость получаемых результатов от непостоянства емкости буферных растворов при изменениях рН.

Впервые разработан основанный на применении ЭВМ метод, позволяющий быстро устанавливать одновременное наличие в клетках одного штамма двух^{-лактамаз.} Метод может быть использован дляхарактеристики штаммов при массовых исследованиях и изучении эпидемиологии^{-лактамаз} и не требует предварительного разделения ферментных., б елков.

Модифицирован, применительно к^{й-лактамазам,} метод изсн-электрического фокусирования, позволяющий выделять,^{з-лактама-зы} в препаративных количествах. Модификации приводят к более полному извлечению^{В-лактамаз} из геля, ж предотвращают возможную инактивацию ферментных белков цри крайних (низких или высоких) значениях рН во время их миграции в геле.

При изучении кинетики гидролиза различных субстратов гомогенными препаратами^{-лактамаз} впервые для регистрации ферментативной активности был использован метод кругового дихроизма, позволивший выявить особенности действия этих ферментов на некоторые субстраты, не выявляемые обычными методами, а также оцре-делить дот оСиспиральных участков в полипептидной цепи.

Практическая ценность работы. Изученные бактериальные штаммы с установленным классом ./З-лактамаз были рекомендованы к использованию в лабораторной практике во ВНИИА: I) при сравнительной характеристике новых клинических штаммов, 2) при поиске и оценке природных^{Л-лактамных} структур с антибиотическими свойствами и/или свойствами ингибиторов ./-лактамаз.

Гомогенный препарат фермента цефалоспориназного типа был применен в практике работы ВНИИА при изучении фармакокинетики антибиотиков в случае комбинированной антибиотикотерапии. Фермент использован для инактивации цефалоспоринов (и выявлении при этом активности применяемых совместно с цефалоспоринами аминогликози-дов).

Модифицированные микрон одометрический и потенциомегрический методы определения /-лактамазной активности и метод быстрого обнаружения двух^{З-лактамаз} у штамма с помощью ЭВМ могут быть использованы в лабораторной практике цри характеристике полирезистентных клинических штаммов бактерий, а также при поисковой работе и оценке новых^{-лактамных} структур.

Методы препаративного выделения^{-лактамаз,} в частности с помощью улыврафильтрации и изофокусирования могут быть использованы в работах по получению этих ферментов.

— 122 -ВЫВОДЫ.

1. Из 56 полирезистентных клинических штаммов грамотрица-тельных бактерий выделены и охарактеризованы препараты? -лак-тамаз. Изученные /-лактамазы отнесены к пяти классам по клас-. сификации Richmond. Около 30 $ из них составляли ферменты цефало-спориназного типа (I класс), 70 $ - пенициллиназы (П-У.классы). Видовой специфичности? -лактамаз не было обнаружено.

2. Разработаны модифицированные микроиодометрический и по-тенциометрический методы определения? -лактамаз. Методы. при-, годны для работы с различными? -лактамазами при использовании. в качестве субстратов как пенициллинов, так и цефалоспоринов. Разработан модифицированный метод изоэлектрического фокусированиялактамаз для аналитических и препаративных целей.

3. Разработан метод анализа спектра? -лактамазной активности с использованием ЭВМ, позволяющий выявлять одновременное присутствие у штамма двух? -лактамаз с описанием субстратного спектра каждого фермента. Обнаружены сочетания /-лактамаз (ТЕМ и PSE-2 — Ш класс, ТЕМ и I класс, ТЕМ и П класс, ТЕМ и У класс).

У штаммов, относящихся к Ps. aeruginosa, Ent. aerogenes, И Kl.pneumoniae. Данные ЭВМ подтверждены биохимическими методами.

4. Пенициллиназа группы ТЕМ, кодируемая плазмидой из Citr. freundii^n ?> -лактамаза цефалоспориназного типа из Ent. aerogenes 6803 с ранее не описанным субстратным спектром были получены в гомогенном состоянии. Определены их кинетические параметры и чувствительность к. реагентам на функциональные группы и? -лактам-ным ингибиторам. Установлено соотношение о (- и? -спиральных структур в молекулах.

5. Применение для изучения /-лактамаз метода кругового дихроизма позволило выявить не обнаруживаемый другими методами медленный гидролиз некоторых ингибиторов /-лактамной структуры. Впервые были определены Км и Ккат при гидролизе рлактамазой ТМ метициллина. Показан гидролиз^{-лактамазой} из Еп-иаегс^епев 6803 ее. ингибитора цефазолина, но не второго ингибитора — цефу-роксима.

6. Штаммы-продуценты охарактеризованных рлактамаз, препараты ферментов, а также модифицированные методы определения активности рлактамаз использованы при скрининге новых рлак-тамных структур.

РЖОМЕНДАЦИИ ПО. ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ.

Модифицированные микроиодометрический и потенциометрический методы определения активностилактамаз, а также бактериальные штаммы с идентифицированными и отнесенными к разным классамлактамазами могут быть использованы при скрининге и оценке свойств новых природных и полусинтетических рлактамных структур.

Метод дифференциациилактамаз при помощи ЭВМ может применяться для характеристики бактериальных штаммов при изучении эпидемиологии антибиотикорезистентности.

Указанные методы впервые апробированы в Лаборатории экспериментальной химиотерапии ВНИИА.

— 125.