Фракционирование белков мяса. 
Количественное определение белков

Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ивановский государственный химико-технологический университет Факультет ОХиТ Кафедра технологии пищевых продуктов и биотехнологии Лабораторная работа по курсу «Введение в технологию продуктов питания».

«Фракционирование белков мяса. Количественное определение белков».

Выполнил: студент гр. 4−29.

Ивлев П.А.

Иваново 2012.

Цель работы:

1. Проведение экстракции и последующего анализ белков животного происхождения по растворимости говяжьего мяса;

2. Освоение спектрофотометрического метода анализа белков говяжьего мяса;

Теоретическое введение:

Мясо — части туши сельскохозяйственных животных, состоящие из мышечной и сопутствующих тканей: соединительной, жировой, хрящевой, костной, нервной, крови, а также, кровеносных сосудов и лимфатических узлов.

Мясные продукты являются одним из основных источников полноценного белка, содержание которых колеблется в пределах 11−22%.

В состав мяса и мясопродуктов входят простые и сложные белки, в том числе водо-, солеи щелочерастворимые, обеспечивающие, например, такие важные функции, как удержание воды, набухаемость и растворимость, а также сложные белки-пигменты, отвечающие за цвет продукта. Белки различаются не только химическим и пространственным строением, но и размерами частиц, а также формой молекул. Последняя включает две группы: фибриллярные и глобулярные, отличающиеся физико-химическими свойствами, прежде всего растворимостью в воде, водно-солевых растворах и водных растворах полярных растворителей, а также способностью к денатурации, гидролизу и другим превращениям. Белки животного происхождения, и в частности белки мяса, по аминокислотному составу более соответствуют структуре человеческого тела, а значит более отвечают потребностям организма, а в частности белки мышечной ткани хорошо сбалансированы по аминокислотному составу, в них нет недостатка незаменимых аминокислот.

Белки — главный компонент органических веществ. Они влияют не только на пищевую и биологическую ценность в мясе, но и предопределяют ф/х, технологические показатели сырья и готовой продукции в целом.

Мышечные белки по их растворимости (и морфологическому строению клеток) делят на три группы:

1. Белки мышечной ткани:

Миозин — фибриллярный белок, составляет около 40% белков клетки мышечной ткани, состоящий из двух навитых друг на друга б-спиральных полипептидов. Миозин — полноценный, хорошо перевариваемый белок. Совершенно чистый миозин растворим в воде и образует вязкий раствор с массовой долей до 4% белка. Температура денатурации миозина около 45 — 50 °C (у птицы около 51 °С); изоэлектрическая точка определяется при рН 5,4. Биологические функции миозина связаны с координированным движением живых организмов и автолитическими превращениями мышечных тканей после убоя животных.

Актин составляет 12−15% всех мышечных белков и является основным компонентом тонких нитей. Этот белок существует в двух формах — глобулярной (Г-форма) и фибриллярной (Ф-форма). В растворах с низкой ионной силой актин существует в виде мономера. При повышении ионной силы раствора до физиологического уровня Г-актин полимеризуется в Ф-актин, очень похожий на нить. Г-актин представляет собой одну полипептидную цепочку, сложенную в глобулу. Быстрая полимеризация актина происходит также при добавлении ионов Mg²⁺. При этом образуется двунитчатая спираль, каждая составляющая в которой напоминает нить бус, закрученных одна вокруг другой. Актин относится к полноценным и легкоусвояемым белкам.

Миоглобин — хромопротеид, составляющий в среднем 0,6−1,0% общего количества белков. Миоглобин — белок, обуславливающий характерную красную окраску мяса мышечной ткани. Он состоит из белковой части — глобина и простетической группы — гемма (Рис. 1).

мясо белок фракционирование растворимость Рис. 1. Структурная формула гемма.

Структура белка представлена одной полипептидной цепью, состоящей из 153 аминокислотных остатков. Функция данного белка состоит в передаче кислорода, доставляемого гемоглобином, ферментативным системам клеток.

Миоглобин мяса легко присоединяет кислород, с образованием ярко-красного фермента — оксимиоглобина (MbO₂). При этом железо не окисляется, а остается двух валентным, т. е. гем в молекуле миоглобина окружен остатками глобина. Но под воздействием света, кислорода воздуха в течение длительного времени происходит более глубокое окисление — до Fe³⁺ — коричневое окрашивание.

Рис. 2. Формы миоглобина.

Соотношение вышеуказанных производных миоглобина, присутствующих в мясе и определяет его цвет. Отличить эти формы друг от друга и определить их содержание можно по ЭСП миоглобина.

Миоальбумины составляют около 1−2% белков мышечного волокна. Растворимы в воде и нерастворимы в кислой среде, так как имеют изоэлектрическую точку около рН 3,0−3,5; температура денатурации 45−47 °С.

Глобулин составляет около 20% общего количества белковых веществ мышечного волокна. Растворим в солевых растворах даже очень низкой концентрации, температура денатурации при рН 6,5 около 50 °C, при рН 7,0 — около 80 °C, изоэлектрическая точка лежит в интервале рН 5,0−5,2.

Тропомиозин — белок палочковидной формы с относительной молекулярной массой около 70 000, постоянно присутствующий в структуре тонких (актиновых) филаментов. Биологическая роль тропомиозина сводится к регулированию взаимодействия актина и миозина в процессе мышечного сокращения. Массовая доля тропомиозина составляет 10−12% всех белков миофибрилл или 2,5% белков мышц. Растворим в воде, но из мышечной ткани водой не извлекается. Изоэлектрическая точка определяется при рН 5,1.

2. Белки соединительной ткани Коллаген — фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани организма (сухожилие, кость, хрящ, дерма и т. п.) и обеспечивающий ее прочность и эластичность. Коллаген обнаружен у многоклеточных животных; отсутствует у растений, бактерий, вирусов, простейших и грибов. Это основной компонент соединительной ткани и самый распространенный протеин у млекопитающих, составляющий от 25% до 35% протеинов во всём теле. Молекула коллагена представляет собой правозакрученную спираль из трёх б-цепей. При частичном гидролизе коллаген превращается в желатин — бесцветную или имеющую желтоватый оттенок смесь полипептидов, продукт переработки (денатурации) соединительной ткани животных.

Эластин — белок, обладающий эластичностью и позволяющий тканям восстанавливаться, например, при защемлении или порезе кожи. Эластин — белок, отвечающий за упругость соединительных тканей. Подобно коллагену, богат глицином и алинином, в то же время содержит большое количество лизина и мало пролина; существует в виде сети полипептидных цепей, благодаря чему обладает большой упругостью.

Качество мяса в значительной степени зависит от содержания в ней соединительной ткани: чем больше соединительной ткани, тем ниже биологическая и пищевая ценность.

Мышечные белки по их растворимости (и морфологическому строению клеток) делят на три группы:

· Миофибриллярные (солерастворимые) — белки нерастворимые в воде, но растворимые в 1%-ом и более растворе поваренной соли. Данный тип белков составляет 55% от общего количества белков.

· Сакроплазматические — белки, растворимые в воде и в растворах малой ионной силы (< 0,6 ммоль/дм³). К ним относят окислительные и липидосодержащие ферменты, миоглобин, а также гемовые и гликолетические пегменты.

· Белки стромы — преимущественно белки (3−5% от общего содержания) соединительной ткани, которые служат каркасом, поддерживающим структуру мышц. Являются щелочерастворимыми белками.

Состав говяжьего мяса:

Говядина I и II категории содержит: воды 67,7 и 71,7%, белков — 18,9 и 20,2 г %, жиров — 12,4 и 7,0 г %(калорийность — 187 и 144 ккал в 100 г продукта); калий — 315 и 334 мг %, натрия 60 и 65 мг %, кальций 9 и 10 мг %, магния — 21 и 23 мг %, фосфора — 198 и 210 мг %, железа — 2,6 и 2,8 мг %; Витаминов: В1 — 0,06 и 0,07 мг %, В2 — 0,15 и 0,18 мг %, РР — 2,8 и 3,0 мг %. Малоценных белков эластина и коллагена говядина в среднем содержит 2,6%. Первый из них главным образом сосредоточена внутри сухожилий, фасций, коллаген — основной компонент связочного аппарата. Жиры, накапливающиеся непосредственно в мышечной ткани, создают привычное для большинства людей ощущение вкусности блюда из говядины и, разумеется, повышает его калорийность.

По различны данным, холестерина в говяжьем жире в среднем 75%, а противохолестеринового фактора — лецитина в среднем 70%. Однако сами мышечные волокна содержат большое количество лецитина и, что не менее важно, довольно много холина и метионина. Поэтому говядина обладает немалыми липотропными свойствами. В 100 г говядины содержится примерно 0,35 г азотистых экстрактивных веществ. Кроме уже перечисленных минеральных веществ, микроэлементов есть в ней также кобальт, цинк, медь, никель, сера, марганец.

Биуретовая реакция — качественная на все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза, которые содержат не менее двух пептидных связей. Биуретовая реакция обусловлена присутствием в белках пептидных связей, которые в щелочной среде образуют с сульфатом меди (ІІ) окрашенные медные солеобразные комплексы.

Рис. 3.

Биуретовую реакцию дают также некоторые небелковые вещества, например биурет (NH₂-CO-NH-CO-NH₂), оксамид (NH₂CO-CO-NH₂), ряд аминокислот (гистидин, серин, треонин, аспарагин).

Ход работы:

I. Фракционирование белков говяжьего мяса.

После экстракции белков, т. е. перевод белков в растворенное состояние, приступают к разделению — фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др. Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. По химическим и физическим свойствам вода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворителя. В частности, температура замерзания ее составляет -40°С. В этой воде хуже растворяются сахара, соли и другие вещества. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок.

1. Выделение водорастворимых белков:

В плоскодонную колбу (100 мл) помещаем 2 г гомогенизированной мышечной ткани, заливаем дист. Водой, экстрагируем в термостате при температуре 30 ⁰С в течение 15 минут (при постоянном перемешивании).

Водорастворимой фракции белков даем отстоятся, отфильтровываем осадок, а фильтрат используем для исследования растворения альбуминов. Промытый водой осадок мышечной ткани оставляем для выделения глобулинов, а фильтрат, содержащие альбуминовые белки разделяем на две порции:

— к первой порции (? 1 мл) добавляем 1 мл биуретового реактива (цвет.

— ко второй порции (? 3 мл) добавляем 1 мл мелкоизмельченный порошок (NH₄)₂SO₄ при нагревании до насыщения.

Выпавшие альбуминовые белки отфильтровываем.

Результаты:

В результате в раствор переходят альбуминовые фракции белков мышечной ткани (мионин, миоглобин, миоглобулин, глобулин). При добавлении биуретового реактива наблюдаем образование сине-фиолетового окрашивания.

Из другой части раствора, где проводили высаливание альбуминовой фракции при добавлении (NH₄)₂SO₄ до насыщения — ионы соли связывают молекулы воды, что приводит к разрушению гидратных оболочек на поверхности белковой молекулы, в результате этого происходит их укрупнение, образуется осадок. В нашем случае серьезных изменений в структуре белка не происходит: он не теряет своих первоначальных свойств, поэтому полученный осадок может повторно растворяться в воде.

Растворимость белков в воде зависит от количества полярных групп, структуры, размеров и формы молекул. Водорастворимые белки имеют преимущественно глобулярное строение, (т. е. сферическую форму), причем неполярные радикалы аминокислот (лейцина, валина, аланина, финилаланина) находятся внутри белковой молекулы, а на наружной — полярные группы, за счет чего увеличивается растворимость в воде.

Молекулярные массы глобулиновых белков выше, чем у белков альбуминовой фракции, поэтому размеры глобулинов больше — на них хуже образуются гидратные оболочки и их растворимость в воде значительно ниже.

2. Выделение солерастворимых белков:

Оставшуюся на марле кашицу из мышечной ткани (после извлечения водорастворимых белков) отжимаем, переносим в ступку и растираем с 10 мл 10% раствора (NH₄)₂SO₄ для извлечения глобулиновой фракции белков.

Полученный экстракт отстаиваем и отфильтровываем, а фильтрат, содержащий глобулиновую фракцию белков мяса, разделяем на две части.

— к первой порции (? 2 мл) добавляем добавляем равный объем (NH₄)₂SO₄ для достижения полунасыщения; выпавшие глобулины отфильтровываем и проверяем их растворимость. К раствору добавляем биуретовый реактив (бесцветный раствор), тем самым доказав, что в растворе не осталось белков.

— ко второй порции (? 5 мл), для осаждения миозина, добавляем сухой порошок NaCl при нагревании до полного насыщения. Образовавшийся осадок — миозин, спустя 5 мин отделяем на центрифуге, а оставшуюся жидкость декантируем. Оставшийся на дне миозин растворяем в дистилировной воде и проводим качественную реакцию на наличие белков с биуретовым реактивом (фиолетовый цвет).

Результаты:

Полученную солерастворимую (в 10% растворе (NH₄)₂SO₄) фракцию белков, в которую входят миозин, актин, тропомиозин. Из одной части раствора было проведено осаждение белков, добавляя насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄ до полунасыщения, из другой части — выделяли миозин, добавляя NaCl до насыщения. Миозин растворили в дист. воде, а фильтрат не содержал белков (биуретовая реакция без окрашивания).

3. Выделение щелочерастворимых белков:

Оставшийся после экстракции водои солерастворимых белков осадок переносим в плоскодонную колбу и заливаем 5 мл 10%-ого раствора NaOH и помещаем на 20 мл в кипящую водяную баню, полученный раствор охлаждаем и отфильтровываем. К 3 мл фильтрата добавляем по каплям раствор 0,1 Н уксусной кислоты для нейтрализации щелочи. Выпавший осадок, который представляет собой белки стромы, спустя 5 мин отфильтровываем. К фильтрату добавляем 1 мл биуретового реактива, в результате фильтрат приобретает фиолетовую окраску.

Результаты:

Полученный фильтрат представляет собой белки стромы. При биуретовой реакции окраска раствора приобрела бледно-фиолетовый цвет, т. е. белки удалось выделить не полностью, при добавлении уксусной кислоты, но при избытке которой белки переходят в осадок, а фиолетовая окраска говорит о том, что в фильтрате присутствуют такие белки как альбумины, которые кроме воды растворимы и в солевых растворах кислот и щелочей.

Полученные в ходе эксперимента данные заносим в Таблицу 1.

Таблица 1. Таблица данных по эксперименту фракционирования белков говяжьего мяса.

II. Количественное определение белков В данной работе содержание белков определялось спектрофотометрическим методом Варбурга-Христиана, который основан на способности ароматических радикалов таких аминокислот, как тирозин, триптофан, фенилаланин, содержащихся в белках, к светопоглощению при 280 нм. Однако при данной длине волны дают поглощение и нуклеиновые кислоты (Abs_max? 260 нм). Поэтому при определении массовой доли белка, измерение оптической плотности раствора производят при 260 и 280 нм, внося тем самым поправку на присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов.

Определение массовой доли белка:

Для анализа брали 1 мл исследуемого белоксодержащей пробы (содержание белка 0,05…2 мг), затем добавляли 9 мл 0,85% раствора хлорида натрия и снимали спектр полученного раствора, с помощью спектрофотометра Cary 50 (базисная линия была снята относительно 0,85% раствора NaCl). Массовую долю белка (Б, %) определяем по формуле:

— определение массовой доли миоглобина:

Рис. 3. ЭСП для миоглобина Миоглобин, как указывалось выше, относится к водорастворимым белкам; полученный раствор миоглобина имеет ярко красный цвет. Наличие трех максимумов поглощения: при 416 нм, 542 нм и 580 нм, указывает на то, что полученная белковая смесь содержит миоглобин в окси форме (MbO₂).

Т.о. массовая доля миоглобина в мышечной ткани следуемого говяжьего мяса:

— определение массовой доли водорастворимых белков:

Рис. 4. ЭСП для водорастворимых белков.

Вывод: в ходе проведения данной лабораторной работы была проведена экстракция, фракционирование и анализ белков животного происхождения (в частности белков мясо говяжьего) по растворимости: за счет того, что альбумины лучше растворяются в воде, они осаждаются из насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄, в свою очередь глобулины осаждаются уже при достижении полунасыщения (NH₄)₂SO₄. Миозин выделяли из насыщенного раствора NaCl, а белки стромы осаждаются при нейтрализации щелочного раствора уксусной кислотой.

Освоен спектрофотометрический метод количественного определения содержания белков в мясе, в результате которого содержания белков в мясе говяжьем составило %:

· миоглобина: 0,27 ;

· водорастворимых: 0,002.

1. Скурихин И. М. Химический состав пищевых продуктов. Кн.2: Справочные таблицы содержания аминокислот, жирных кислот, витаминов, макрои микроэлементов, органических кислот и углеводов. / Под. ред. проф., д.т.н. И. М. Скурихина и проф. д.м.н. М. Н. Волгарева. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Агропромиздат, 1987. — 360 с.

2. Гамаюрова В. С., Ржачитская Л. Э. Пищевая химия: лабораторный практикум.