Метод с реактивом Несслера

Метод основан на цветной реакции ионов аммония с реактивом Несслера. Содержание азота в испытуемом растворе определяют по калибровочному графику, построенному с использованием в качестве стандартного образца аммония сульфата, высушенного до постоянной массы в эксикаторе над серной кислотой или кальция хлоридом.

Метод А. Точную навеску лекарственного средства, содержащую около 10 мг белка, минерализуют по способу, описанному в микрометоде Къельдаля. После минерализации пробу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки.

0,5−1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл воды, 2 мл реактива Несслера, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Через 15 мин. измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 400−410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без испытуемого образца.

Калибровочный график строят в пределах содержания азота от 0,03 до 0,07 мг в 25 мл конечного раствора.

Метод Б (с использованием фосфорновольфрамовой кислоты). В центрифужную термостойкую пробирку вместимостью 10 мл вносят от 0,5 до 3 мл испытуемого раствора с содержанием белка от 0,07 до 3,0 мг, доводят при необходимости объем 0,9% раствором натрия хлорида до 3 мл, прибавляют 0,3 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты и 0,3 мл серной кислоты концентрированной, тщательно перемешивают и оставляют на 18−20 ч при температуре 2−8 град. C. Осадок отделяют центрифугированием при скорости вращения 2000 об/мин. в течение 30 мин. при температуре 4−6 град. C. Осадок промывают смесью, состоящей из 1 мл воды, 0,1 мл серной кислоты концентрированной, 0,1 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты, затем центрифугируют в тех же условиях. К осадку прибавляют 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Пробирку закрывают стеклянным колпачком или стеклянной воронкой и минерализуют на песчаной бане. Одновременно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Для ускорения минерализации используют водорода пероксид, который периодически прибавляют по 1−2 капли в предварительно охлажденную пробирку. Минерализацию продолжают до образования осадка желтого цвета (8−10 ч или указанного в частной фармакопейной статье времени), окраска которого не изменяется в течение последних 1−1,5 ч. Пробирку охлаждают, доводят объем минерализата водой до 10 мл и перемешивают. 0,5 мл полученного раствора переносят в мерную пробирку, доводят водой до объема 9,5 мл и перемешивают; прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Через 15 мин. измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400−410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют контрольный раствор, приготовленный аналогичным образом из контрольной пробы.

Калибровочный график строят в пределах содержания азота от 0,005 до 0,025 мг в 10 мл и воспроизводят при каждом анализе.

Метод Дюма

Навеску анализируемого вещества сжигают в кварцевой трубке в атмосфере углекислого газа в присутствии оксида меди и металлической меди. Объем выделившегося азота измеряют в азотометре (градуированном сосуде), после чего рассчитывают содержание азота в анализируемом образце. Образующиеся наряду с азотом монооксид углерода, углекислый газ, кислород, вода, оксиды азота связываются в трубке (медью или ее оксидом) или поглощаются водным раствором щелочи, которым заполнен азотометр. Метод Дюма в описанном варианте применяется редко. Разработаны различные модификации этого метода. Например, анализируемое вещество сжигают в вакууме, продукты поступают в слой твердого перхлората магния, затем в раствор щелочи и измерительный сосуд (эвдиометр) для установления объема выделившегося азота. Иногда к навеске вещества добавляют различные окислители, которые способствуют более полному и быстрому разложению вещества.