Селекция продуцентов витамина В12

Витамин В12 — (б-5,6-диметилбензимидазол)-цианкобаламин — это полимер сложного строения, являющийся гематопоэтическим и ростовым фактором для многих животных и микроорганизмов.

Микробиологический синтез является единственным способом получения данного витамина. Способность к синтезу витамина В12 широко распространена среди прокариотических микроорганизмов [3].

Природные продуценты витамина В12 обнаружены среди пропионовокислых бактерий р. Propionibacterium, которые синтезируют от 1 до 8 мг/л этого витамина. С помощью селекционно­генетических методов получен мутант P. shermanii M­82, который дает до 60 мг/л продукта. Продуцент B. rettgerii также используется для микробиологического синтеза В12. Как активные продуценты витамина В12 используются также актиномицеты и родственные микроорганизмы: путем мутаций и ступенчатого отбора получен штамм Nocardia rugosa, накапливающий до 18 мг/л В12. Активные продуценты В12 обнаружены среди представителей Micromonospora. Высокой природной продуктивностью обладают представители метанотрофов Methanosarcina, Methanococcus, среди которых выделен штамм Methanococcus halophilus, обладающий самым высоким среди природных штаммов уровнем продукции — 16 мг на 1 г биомассы. В значительных количествах В12 синтезируют анаэробные бактерии р. Clostridium, что особенно эффективно для технологии. Известны активные продуценты В12 среди Pseudomonas. У P. Denitrificans получен мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л. Штамм запатентован фирмой «Merck» для промышленного получения В12.

Интерес представляют термофильные бациллы B. circulans и B. stearother mophilus, которые дают выход 2−6 мг/л В12.

В России наиболее широкое применение имеют Propionibacterium freudenreichii. Их культивируют на кукурузном экстракте и глюкозе в анаэробных условиях 72 ч для роста культуры. Во 2­й фазе синтеза в ферментер вносят предшественник — специфическое азотистое основание и проводят ферментацию еще 72 ч. Затем экстрагируют В12 [5].

Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4,5−5,0 и температуре 85−90 С, в присутствии стабилизатора (0,25% раствор натрия нитрита). Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добавляют коагулянты белка — хлорид железа трехвалентного и алюминия сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3−4 С из в одноацетонового раствора.

Кристаллический цианкобаламин можно получать с помощью резорцина или фенола, образующих с ним аддукты, которые сравнительно легко разлагаются на составляющие компоненты.

При реализации данного биотехнологического процесса необходимо помнить о высокой светочувствительности витамина В12, поэтому все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или при красном свете). На ацетонобутиловой и спиртовой бардах с добавлением солей кобальта и метанола в нашей стране получают кормовой препарат КМБ 12 — концентрат, содержащий витамин В12 и другие ростовые вещества [2].

Для нужд животноводства В12 получают с использованием смешанной культуры, содержащей бактерии Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum. Содержание В12 в культуре достигает 6,5 мг/г сухой биомассы [5].

Концентрат витамина B12 предназначен для обогащения кормов животных. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином B12 используют пропионовокислые бактерии, как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке [2].

Мировая продукция витамина В12 составляет 9−11 тыс. кг в год. Из них около половины используется на медицинские цели, остальное количество — в животноводстве как кормовые добавки [5].