Методика проведения ПЦР

Приготовление реакционных (ПЦР) смесей

Приготовление реакционной смеси на десять проб (для анализа девяти образцов ДНК). В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см³, помещенную в кювету со льдом, вносят 90,625 мм³ деионизированной воды, 12,5 мм³ 10х буфера для ПЦР, 7,5 мм³ хлорида магния, 2,5 мм³ смеси нуклеотидов, 1,25 мм³ праймеров (концентрацией 20 мкмоль/дм³ каждый), 0,625 мм³ фермента Taq-ДНК полимеразы (концентрацией 5 ед/мм³).

Реакционную смесь разливают по 11,5 мм³ в девять чистых микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см³ (или 0,5 см³ в зависимости от типа используемого ДНК — амплификатора) для проведения ПЦР и добавляют по 1 мм³ ДНК.

Пробирки маркируют и центрифугируют на настольной микроцентрифуге 10 с при частоте вращения 10 000 об/мин —¹ для удаления пузырьков воздуха.

Проведение ПЦР-анализа

Пробирки со смесями помещают в ДНК-амплификатор для проведения ПЦР. SSR-PCR по локуса проводят по следующей программе: 1) 94С- 2 мин., 2) 35 циклов: 94С-30 сек., 58С или 61С (для локусов Ср2.39 и Ср1.63, соответственно) -40 сек., 72С-40 сек., 3) 72С-3 мин.

По окончании ПЦР в каждую пробирку добавляют по 2,5 мкл 6х-буфера для образцов и помещают на хранение в холодильник (+4^оС) или проводят электрофорез в 8% полиакриламидном геле (ПААГ).