Влияние эндоморфина-2, сойморфина и N-концевого фрагмента ноцицептина на поведение детенышей белых крыс

Актуальность проблемы.

В настоящее время в организме человека и животных обнаружены сотни эндогенных олигопептидов. Короткие пептиды действуют на всех уровнях межклеточной сигнализации — от аутои паракринного до гормонального. В нервных клетках пептиды могут служить нейромедиаторами или модуляторами действия медиаторов иной химической природы (Ашмарин, 1996). Некоторые пептиды, обладающие биологической активностью, не являются эндогенными, а всасываются в кровь через слизистую кишечника после неполного расщепления белков пищи (Hartmann, Meisel, 2007). Доля пептидов среди продуктов ферментативного расщепления белков особенно велика в кишечнике грудных детей в связи с возрастными особенностями пищеварения (Зуфаров, 1998).

Одной из наиболее активно изучаемых групп регуляторных пептидов является семейство опиоидов. Эндогенные опиоидные пептиды играют важную роль в контроле болевой чувствительности, врожденных поведенческих реакций, обучения и других функций центральной и периферической нервной системы. Опиоидные пептиды, попадающие в организм с пищей, объединяются под общим названием «экзорфины». У ряда опиоидных пептидов обнаружены не только эффекты, проявляющиеся сразу после введения, но и отставленное действие, регистрируемое через несколько недель и даже месяцев после получения пептида. Отставленные эффекты особенно выражены при хроническом введении пептида в раннем возрасте (Малиновская, 2001; Беляева, 2008).

Все опиоидные пептиды обладают рядом общих свойств, но отличаются друг от друга по первичной структуре и по сродству к разным типам опиоидных рецепторов, а следовательно, и по спектру физиологического действия. При изучении влияния пептидов на центральную нервную систему обычно используют интрацеребровентрикулярный (i.c.v.) способ введения, гарантирующий попадание рассматриваемого вещества в мозг в нужной дозе. Однако i.c.v.

введение

плохо подходит для изучения поведения, поскольку эксперимент включает хирургическую операцию по вживлению канюли, вызывающую сильный стресс у подопытных животных. В то же время внутрибрюшинная инъекция является одним из наименее травматичных способов введения веществ и при этом обеспечивает высокую их биодоступность. Данных о действии оииоидных пептидов на ЦНС при системном способе введения в литературе в настоящее время мало. При этом многие пептиды с высокой вероятностью являются потенциально пригодными для применения в фармацевтике в качестве препаратов для мягкой коррекции разнообразных нарушений, в том числе заболеваний нервной системы (Левицкая, Каменский, 2003). С другой стороны, при некоторых особенностях диеты избыток экзорфинов, попадающих в организм (особенно детский) с пищей, потенциально может оказывать нежелательные эффекты. Опиоидные фрагменты растительных пищевых белков рассматриваются в качестве факторов, способствующих развитию аутизма и даже синдрома внезапной остановки дыхания (КлсИ е1 а1., 2002). Это подтверждает актуальность изучения как немедленного (развивающегося в течение минут-часов после введения), так и отставленного (наблюдаемого через недели и даже месяцы) эффектов, наблюдаемых при системном введении различных опиоидных пептидов экспериментальным животным, в особенности — детенышам. Представляется важным, во-первых, подтвердить или опровергнуть наличие влияния пептидов на поведение при выбранном способе инъекцииво-вторых, попытаться оценить баланс положительных и отрицательных (с точки зрения возможного применения в клинике) последствий введения пептидов на разных этапах постнатального развития.

Цель и задачи исследования

.

Целью представленной диссертационной работы явился анализ поведенческих эффектов трех олигопептидов опиоидной природы при однократном и хроническом системном (внутрибрюшинном) введении белым крысам на разных этапах постнатального развития. Исследовались пептиды УРБР-НН2 (эндогенный эндоморфин-2), УРРУУ-МН2 (амидированный экзогенный пептид сойморфин) и РООР-1ЧН2 (амидированный ]Ч-концевой фрагмент эндогенного пептида ноцицептина). Изучались как немедленные (при остром введении), так и отставленные (при хроническом введении в первые 14 дней постнатального развития) эффекты пептидов.

В работе были поставлены следующие задачи:

• изучить влияние острого введения вышеуказанных пептидов на врожденные формы поведения (исследовательскую активность, уровень тревожности, поведенческие проявления депрессивности и болевую чувствительность) детенышей крыс и сравнить полученные результаты с последствиями острого введения этих же пептидов взрослым крысам;

• изучить отставленное действие хронического введения пептидов в первые дни жизни на те же параметры врожденного поведения экспериментальных животных;

• исследовать эффекты острого и хронического введения пептидов в экспериментах с обучением детенышей крыс новым навыкам;

• установить участие опиоидных рецепторов в развитии обнаруженных эффектов пептидов с помощью фармакологических блокаторов этих рецепторов.

Научная новизна.

Практически все полученные нами результаты можно классифицировать как новые и не имеющие аналогов в литературе. Работа является продолжением скрининга пептидных лигандов опиоидных рецепторов, начатого в нашей лаборатории еще в 1980;х годах.

Пептид FGGF-NH2, являющийся укороченным аналогом молекулы ноцицептина, исследован впервые. В литературе нет данных о действии этого пептида в экспериментах in vivo, хотя более длинные фрагменты молекулы ноцицептина активно изучаются. Такая модификация пептида была выбрана нами для работы, потому что малый размер молекулы увеличивает ее потенциальную способность преодолеть гемато-энцефалический барьер, а амидирование повышает устойчивость пептида к пептидазам, содержащимся в крови и тканевых жидкостях. Пептид сойморфин-5 из группы экзорфинов был обнаружен в 2007 году, и о его влиянии на организм до сих пор известно очень мало. В опытах на мышах показано анксиолитическое действие сойморфина, а также его способность подавлять пищевую мотивацию (Ohinata et al., 2007; Kaneko et al., 2010). В нашей работе использовался амидированный аналог сойморфина-5. Эндогенный амидированный пептид эндоморфин-2 изучен достаточно подробно, но его эффекты при системном введении исследуются впервые. Учитывая литературные данные о действии эндоморфина при центральном введении, можно с большой вероятностью предсказать ожидаемые последствия системного введения этого пептида. Поэтому эндоморфин-2 можно рассматривать как вещество сравнения для двух других пептидов.

В представленной работе впервые показано, что все изученные пептиды при остром системном введении оказывают влияние на баланс ориентировочно-исследовательской активности и тревожности. При этом была выявлена общая для всех пептидов тенденция: подавление ориентировочно-исследовательской реакции (ОИР) у крысят в раннем возрасте, сменяющееся усилением ОИР в середине полового созревания (возраст 42 дня), отмечаемым и у взрослых животных. Для всех изученных пептидов при хроническом введении выявлено отставленное действие на способность крыс к обучению, зависимое от пола. Отрицательное влияние на обучение отмечалось чаще, чем положительное. Впервые обнаружено, что все три рассмотренных пептида при системном введении проявляют анальгетическое действие. Впервые показано, что на фоне налоксона поведенческие эффекты от системного введения всех трех изученных пептидов не проявляются, что подтверждает участие опиоидных рецепторов в реализации этих эффектов.

Несмотря на ряд общих закономерностей, большинство полученных результатов указывает на значительные отличия физиологической активности исследованных пептидов в сравнении друг с другом. Причиной этого, очевидно, являются различия их первичной структуры, а следовательно — разная селективность по отношению к потенциальным мишеням: опиоидным рецепторам ц-, 5- и к-типов, а также к ноцицептиновому рецептору СЖЬ! (и разным изоформам каждого типа рецепторов). В большинстве случаев направленность эффектов эндоморфина-2 и сойморфин-5-амида зависела от пола животных. В случае аналога ноцицептина также было отмечено влияние фактора пола животных на выраженность эффектов, но реже отмечалась разная направленность действия пептида на самцов и самок.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные результаты позволяют значительно расширить представления о физиологической роли опиоидных пептидов разных групп. Показана способность амидированных олигопептидов вызывать центральные эффекты при внутрибрюшинном способе введения. Показано, что опиоидные пептиды при попадании в организм детенышей млекопитающих способны оказывать существенное нейротропное (изменяющее поведение) действие. В первую очередь, это относится к уровню исследовательской активности, тревожности, а также способности к обучению. В значительной части случаев это действие имеет отставленный характер, проявляется через несколько недель после окончания введения пептида и сохраняется в течение длительного времени. Большинство обнаруженных эффектов оказались негативными с точки зрения применения в клинике (усиление тревожности, нарушение способности к обучению и др.) При исследовании немедленных последствий введения пептидов показана зависимость эффектов не только от пола, но и от возраста подопытных животных, что увеличивает объем имеющейся информации о возрастных изменениях опиоидной медиаторной системы. Практическая значимость представленной работы связана с выявлением ряда негативных отставленных эффектов от введения опиоидных пептидов в раннем возрасте. Это информация, которую следует учитывать при оценке побочного действия белковых компонентов искусственных смесей для питания новорожденных. Согласно полученным нами результатам, опиоидные пептиды, попадающие в организм в первые дни жизни, являются физиологически значимыми факторами, от присутствия которых зависит реализация многих важнейших поведенческих реакций детеныша. Известно, что даже достаточно длинные пептиды у новорожденных детей всасываются из пищеварительного тракта в кровь в относительно больших количествах (Зуфаров, 1998). С учетом этого факта наши результаты подтверждают необходимость контроля за содержания в заменителях молока белков, содержащих опиоид-подобные последовательности (в частности, широко применяемых в смесях для детского питания соевых белков).

Апробация работы.

Результаты представленного диссертационного исследования доложены и обсуждены на XIII школе-конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2009), на IV, V и VI российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Казань, 2009; Петрозаводск, 2011; Уфа, 2013), XVI и XVII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2010), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов» (Москва, 2010), 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2011), 23-м международном конгрессе ECNP (Амстердам, 2010), 11-й региональной конференции ECNP (Санкт-Петербург, 2011), 8-м Международном форуме FENS (Барселона, 2012), IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 24-й Международной конференции ISN/ASN (Канкун, 2013), а также на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 204 страницах, содержит 28 рисунков и 10 таблиц.

Список литературы

включает 340 источников, из них 27 отечественных.

выводы.

1. При системном введении эндоморфин-2, сойморфин-5-амид и аналог ноцицептина проявили анальгетическое действие. Кроме того, действие всех изученных пептидов на ориентировочную активность блокировалось налоксоном. Таким образом, влияние пептидов на нервную систему связано с активацией опиоидных рецепторов, предположительно, р-типа. В случае аналога ноцицептина возможно косвенное действие на р-рецепторы через снятие торможения опиоидергических нейронов при связывании пептида с рецепторами ORLj на этих нейронах.

2. При системном введении (как однократном, так и хроническом) всех изученных пептидов была выявлена зависимость выраженности и направленности эффектов от пола и возраста животных. Половой диморфизм в действии пептидов отмечался уже на 21-й день жизни. У всех трех пептидов при остром и (в меньшей степени) при хроническом способах введения была отмечена общая тенденция к подавлению ориентировочно-исследовательской активности у крысят в раннем возрасте, которое сменяется усилением ОИР в середине полового созревания (42 дня), отмечаемым и у взрослых животных.

3. Хроническое неонатальное введение эндоморфина-2, сойморфин-5-амида и аналога ноцицептина вызывает отставленные эффекты, сохраняющиеся в течение нескольких недель после окончания инъекций. Отставленные эффекты хронического введения пептидов в первые дни жизни меньше зависели от возраста животных по сравнению с последствиями острого введения, что позволяет предположить программирующее действие пептидов на созревание нервной системы в целом.

4. Эндоморфин-2 при остром введении детенышам белых крыс у самцов снижал локомоцию и уровень тревожности. У самок пептид повышал локомоцию и ухудшал обучение. При хроническом неонатальном введении эндоморфин-2 у самцов подавлял локомоторную активность, усиливал тревожность и ухудшал обучение с положительным подкреплением. У самок эффекты хронического введения пептида были противоположны: он снижал тревожность и усиливал ориентировочно-исследовательскую активность, улучшал обучение (с положительным и с отрицательным подкреплением).

5. Сойморфин-5-амид при остром введении детенышам крыс усиливал тревожность у животных обоего пола. У самцов пептид оказывал антидепрессантное действие, у самок снижал локомоторную активность. При хроническом введении сойморфин-5-амид у самцов стимулировал ориентировочную активность, а также улучшал обучение с пищевым подкреплением. У самок, напротив, пептид при хроническом введении подавлял ориентировочно-исследовательскую активность, ухудшал обучение с положительным подкреплением, а также снижал тревожность и усиливал проявления депрессивности.

6. Аналог ноцицептина при остром введении подавлял локомоторную активность детенышей крыс обоего пола. РССР-МН2 подавлял ориентировочную активность самцов в раннем возрасте, но по мере взросления (в промежутке между 28 и 42 днем жизни) наблюдалось обращение эффекта. У самок пептид усиливал ориентировочно-исследовательскую активность. При хроническом введении РОСБ^Н2 подавлял двигательную и ориентировочную активность животных в раннем возрасте, но у самцов в 42 дня отмечалось обращение эффекта. Пептид ухудшал обучение с положительным подкреплением у крыс обоего пола.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Опиоидная система является одной из чрезвычайно важных нейрохимических систем организма млекопитающих. Невозможно назвать какой-либо физиологический ответ организма на воздействие, в котором бы не принимала участие система опиоидных пептидов и их рецепторов.

Представленная диссертационная работа является продолжением большого проекта по изучению действия опиоидных пептидов in vivo при системном введении, проводимого на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ с 1980;х годов. Ранее уже доказана способность ряда исследованных пептидов изменять болевую чувствительность, двигательную активность, тревожность, материнское и детское поведение. Большое внимание в этой работе уделялось экзорфинам в связи с высокой практической значимостью оценки нейротропного действия компонентов пищи, особенно у новорожденных детей. Большая работа была посвящена исследованию последствий хронического и острого введения (3-казоморфинов человеческого материнского молока детенышам крыс (Малиновская, 2001; Ивлева, 2004). Отмечено, что (З-казоморфин-7 и его фрагменты вызывали усиление «детского» поведения, снижение тревожности, повышение исследовательской активности и др., что авторы работы связывают с адаптогенным действием веществ в составе материнского молока, выработавшимся в процессе эволюции млекопитающих. Предполагается, что казоморфины выполняют функцию «смягчения» стресса, возникающего при взаимодействии новорожденного детеныша с окружающей средой, повышения «экстравертности», «любопытства» детеныша. Был обнаружен по крайней мере один механизм изменений поведения детенышей крыс под влиянием (З-казоморфина-7 при остром и хроническом введении: у подопытных крысят оказалось измененено содержание серотонина в ряде отделов головного мозга. Для экзорфинов растительного происхождения, в противоположность (3-казоморфинам материнского молока, предполагалось негативное действие на нервную систему животных, предотвращающее поедание ими растений, содержащих эти вещества (Дубынин, Каменский, 2010; Грицай с соавт., 2007, 2009). В данном случае растительные экзорфины рассматривались как менее опасные аналоги растительных токсинов и алкалоидов. В работе Беляевой (2008) показано, что опиоидные пептиды растительного происхождения — экзорфин С и рубисколин-5 — при введении детенышам крыс вызывают ряд эффектов, аналогичных изученным ранее эффектам (3-казоморфинов. Гипотеза о возможном негативном действии растительных экзорфинов (как аллелопатических факторов) на нервную систему млекопитающих в работе Беляевой не подтвердилась. Судя по всему, структура экзорфинов, принимающих участие в защите растений преимущественно от насекомых (Грицай с соавт., 2007, 2009), в случае млекопитающих в значительной мере совпадает со структурой р-казоморфинов — «положительных» регуляторных факторов у этих животных. Однако самые последние данные, полученные при исследовании эффектов сойморфин-5-амида и описанные в представленной диссертационной работе, не противоречат гипотезе об аллелопатической функции экзорфинов. У крысят женского пола пептид растительного происхождения сойморфин-амид при введении в первые дни жизни вызывал целый ряд негативных эффектов: оказывал анксиогенное действие, подавлял двигательную, ориентировочно-исследовательскую активность, ухудшал обучение с положительным подкреплением. Следует, однако, отметить, что действие сойморфин-5-амида на крысят-самцов было противоположным.

У второго изученного нами пептида, эндоморфина-2, действие на поведение также имело выраженный половой диморфизм. В данном случае наибольшее число неблагоприятных эффектов отмечалось у самцов. При остром введении в группе самцов отмечалось скорее подавляющее исследовательскую активность действие эндоморфина-2, а у самок наблюдался обратный эффект. При хроническом введении эндоморфина-2 в первые дни жизни у самцов оказалась также увеличена тревожность и нарушена способность к обучениюу самок и в этом случае действие пептида имело противоположную направленность.

Третий рассмотренный нами пептид, аналог ноцицептина ГСОР-Г" Щ2, по своему влиянию на организм крысят существенно отличался как от эндоморфина-2 и сойморфин-5-амида, так и от опиоидных пептидов, рассмотренных ранее. Это может быть объяснено тем, что орфановая система, хотя и тесно связана с опиоидной, все же является отдельной медиаторной системой со своим спектром нейротропной активности. Во-первых, в случае ГССГ-МН2 половой диморфизм эффектов был не столь резко выражен по сравнению с двумя другими изученными пептидами. Во-вторых, в большинстве случаев эффекты острого и хронического введения этого пептида совпадали, что не позволяет объяснить механизм действия хронических инъекций этого пептида просто долговременной десенситизацией рецепторов. Нами показано (см. стр. 125−126), что этот пептид является лигандом как ОЫ^-, так и мю-рецепторовточный механизм его действия требует более внимательного изучения. Следует подчеркнуть, что в представленной диссертационной работе впервые изучался потенциальный лиганд СЖЬр рецепторовдругие пептиды, изученные в рамках данного проекта, имели сродство только к классическим опиоидным рецепторам. Таким образом, было открыто новое направление исследований.

На многие вопросы, возникшие в результате изучения опиоидных пептидов на нашей кафедре, ответов до сих пор нет. Это касается, в первую очередь, конкретных биохимических механизмов влияния пептидов на деятельность различных систем мозга. Требуется дополнить многочисленные собранные нами данные, полученные в поведенческих тестах, результатами экспериментов на клеточном и молекулярном уровне. Кроме того, все еще недостаточно подробно изучено наложение наблюдаемых эффектов на онтогенез опиоидной системы и процессы половой дифференцировки. Наконец, остается открытым вопрос о существовании мест связывания изучаемых пептидов, отличных от классических опиоидных рецепторов.

При сравнении наших результатов с результатами, полученными ранее Дубыниным, Ивлевой, Беляевой и другими, отмечен ряд общих тенденций. Особенно интересным представляется факт, обнаруженный только при сопоставлении действия разных пептидов на крысят разного возраста — смена направленности действия самых разных опиоидных пептидов на уровень тревожности, приблизительно совпадающая по времени с началом полового созревания животных (см. стр. 157). Этот эффект заслуживает дальнейшего подробного изучения.

Таким образом, изучение действия опиоидных пептидов на растущий организм далеко от завершения. Однако результаты, представленные в данной работе, позволяют существенно дополнить уже имеющиеся у нас знания и сформулировать цели новых исследований.