Анализ сиквенс-специфичности взаимодействия регуляторных белков HU и p50 с однонитевой и двунитевой ДНК с помощью универсального олигонуклеотидного микрочипа

Биологические и биохимические исследования находятся в периоде г нарастающего информационного роста. Использование автоматизированного сиквенирования и вычислительных методов привело к тому, что на сегодняшний день полностью прочитан геном большого числа организмов, в том числе и Homo sapiens. И как результат, огромный перечень генов для каждого из организмов доступен для изучения. Однако простое чтение нуклеотидной последовательности генов не дает информации о том, как эти гены кооперируют в генетических путях, контролирующих физиологию организма. Основной задачей так называемой пост-геномной эры является максимальное использование огромного количества геномной информации для понимания комплексной природы жизни клетки. Успех проекта сиквенирования генома, который сам по себе явился результатом технологических усовершенствований и инноваций, делает необходимым дальнейшие технологические разработки по эффективному использованию огромного количества информации по сиквенированию. Функциональная геномика ответила развитием ряда новых технологий, и одной из наиболее эффективных стала технология биологических ДЬЖ микрочипов (микроматриц). ДНК микрочип это очень точная, с высокой степенью плотности матрица однонитевых олигонуклеотидых образцов, прикрепленных к твердой поверхности. Обычно, ДНК микрочипы изготовлены либо с использованием синтезированных олигонуклеотидов, либо на основе ПЦРамплифицированных последовательностей кДНК. Таким образом, каждая позиция в решетке микрочипа (ячейка) содержит много копий ДНК определенной последовательности. Использование однонитевой ДНК в таком формате является результатом способности однонитевых нуклеотидных последовательностей с высокой специфичностью гибридизоваться со вторыми нитями, содержащими комплементарные последовательности, и образовывать молекулы двуспиральной ЩШ. Поэтому в основном ДЬЖ микрочипы используют для анализа комплексных смесей из тысяч нуклотидных последовательностей на присутствие и количество молекул определенной последовательности. Способность качественно и количественно проанализировать смесь нуклеотидных последовательностей делает Д1Ж микрочипы чрезвычайно необходимой технологией с широкой областью применения. На сегодняшний день наиболее часто эта технология используется для анализа генной экспрессии и ДНК полиморфизма. Идентификация изменений в генной экспрессии, вызванных определенными воздействиями на организм и/или связанных с изменениями в клетке в результате развития заболевания, долгое время была основной стратегией в исследовании физиологических путей. До недавнего времени анализ генной экспрессии в любом эксперименте был ограничен количественно несколькими десятками генов. Сейчас, с появлением ДНК микрочипов, стало возможным проводить анализ изменения экспрессии десятков тысяч различных генов в одном эксперименте. Технология ДЬЖмикрочипов позволила для определенных типов онкологических заболеваний выделить отдельные группы генов, которые имеют характерный уровень экспрессии, и, таким образом, расширить диагностику раковых заболеваний экспрессионным анализом. Вариации в геномной последовательности и структуре ответственны за большую часть вариаций среди индивидуумов. Знание генетической вариабельности между индивидуумами и корреляция этой информации с фенотипами болезней сыграло важную роль в понимании связи между генами и здоровьем человека. Помимо указанных основных областей применения, ДНК матрицы используются и для множества других целей. Одна из них основана на способности регуляторных белков взаимодействовать с однонитевыми и двунитевыми олигонуклеотидными последовательностями специфичным или неспецифичным образом. Таким образом, Д1Ж матрицы также используют для иззд1ения ДНК-белкового взаимодейсвия. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Технологии ДНК матриц. ДНК матрицы последнее достижение в эволюции био-аналитических технологий, начало развития которых приходится на 1960;ые и 1970;ые годы. Появление ДНК матриц связано с возникновением идеи иммобилизации однонитевых последовательностей Д1Ж на твердой (из пластика, стекла) поверхности, а также на нитроцеллюлозных и нейлоновых мембранах. Жесткая поверхность имеет ряд преимуществ перед эластичными мембранами, поскольку матрица нитей ДНК, иммобилизованных на твердой поверхности, получается более однородной, может достигать больших плотностей и может быть использована в исследованиях, которые занимают меньше времени и используют усовершенствованную технологию детекции, обычно с использованием флуоресцентньпс красителей. В основном используются три основных формата Д1Ж матриц, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки situ синтезированные олигонуклеотидные Одна из этих из технологий образцы, метод в цене, гибкости, последовательности фотолитографии, для синтеза на вариабельности и простоты использования.* Две технологии использзот in которых обьино берутся на основе последовательностей известных генов. использует адаптированный микроэлектронной индустрии, поверхности стекла олигонуклеотидов длинной до 30 оснований. Этот метод позволяет производить ДНК микрочипы очень высокой плотности сотни тысяч различных олигонуклеотидов на см. Поскольку в этой технологии используются относительно короткие олигонуклеотиды, то, например, для поиска точек полиморфизма одного гена необходимо порядка 1000 таких олигонуклеотидов. 4″ Метод фотолитографии, используемый фирмой Affymetrix, позволяет производить микрочипы, на которых иммобилизовано 65 000 400 000 олигонуклеотидов. Поэтому один микрочип, содержащий 400 000 олигонуклеотидов, позволяет проанализировать в одном эксперименте примерно 400 генов (рис. 1). Размер одной ячейки микрочипа Affymetrix составляет 20×20 мкм. Размер самого микрочипа 1×1 см. Стоимость такого микрочипа составляет примерно 5000 High-Density Microarray Рис. 1. Микрочип фирмы Affymetrix. Основная стратегия этого метода заключается в следующем (рис. 2). Поверхность твердой подложки, маску, модифицированная (О-Х), производя фотолабильными через реактивные протекционными фотолитографическую заливается гидроксилами освещается свободные гидроксильные группы в освещенных участках. Затем поверхность подложки 3 -0-фосфорамидит-активированными концу фотолабильной дезоксинуклеозидами группой. Происходит Затем (например, тимидин дезоксинуклеозид фосфорамидитами), защищенными по 5-гидроксильному наращивание на один нуклеотид в местах, облученных светом. метятся P и гибридизуются на отдельные мембранные макрочипы. происходит герметичных в термостатируемых, вращающихся и или камерах. После гибридизации отмывки Гибридизация трясущихся макрочипы помещают на эмульсионную пластину, экспонируют, после чего получают локализованную картину радиоактивной интенсивности. Масгоаггау Control Sample Experimental Sample Create ndioactively-labeled targets and hybridize to separate membranes 1 2 cm (200−5,000 genes) Рис. 3. Схема анализа экспрессии генов с использованием макрочипов на нейлонной или нитроцеллюлозной основе." * 7/ 7 8 cm Detection with photphorimager в технологии микрочипов (микроэрреи) используют слайд из стекла или пластика (рис. 4). Микрочипы имеют гораздо большую плотность иммобилизованных олигонуклеотидов или наработанных с помощью ПЦР последовательностей кДЬЖ. Один такой микрочип, позволяет гибридизовать в одном эксперименте до 10 000 генов. Микрочипы по размеру миниатюрнее чем макрочипы. Гибридизуемые образцы метятся флуоресцентными красителями. Гибридизационная смесь заливается в гибридизационную камеру, и микрочип помещается на термостатируемый металлический с макрочипами, что позволяет использовать большие столик. Объем гибридизационных камер микрочипов гораздо меньше по сравнению концентрации гибридизуемых образцов. В экспериментах по генной экспрессии исследуемый и контрольный образцы метятся различными флуоресцентными красителями и заливают одновременно на один микрочип. 10 анализируя гибридизационные сигналы в разных длинах волн возбуждения и эмиссии. Microarray Control Sample Create redorareen ExperimentaJainple Рис. 4. Схема анализа экспрессии генов с использованием микрочипов на стеклянной или пластиковой основе. (s 10,000 genes) Detection with confocal microscope биологических микрочипах, разработанных Институте молекулярной биологии РАН, нуклеотидная проба иммобилизуется в гелевых (акриламидных или бис-акриламидных) ячейках на стекле." «По одной разработанной технологии, вначале на стекло наносятся гелевые ячейки, геометрия которых задается маской. Размер одной ячейки составляет SO ЮОмкм X ЮОмкм X 20мкм, расстояние между ячейками 200мкм. Через маску пропускают свет, инициирующий полимеризацию. После химической обработки матрицы, приводящей к образованию в геле альдегидных или гидразидных групп, на каждую ячейку наносят по 1 нл раствора модифицированных NH2 группой олигонуклеотидов,* которые ковалентно пришиваются к гелю.* По второй технологии готовят смесь мономеров и модифицированных олигонуклеотидов и наносят ее на стекло в виде капель. Сополимеризация мономеров происходит в результате облучения светом ультрафиолетовой области. Диаметр образующихся ячеек составляет 150 мкм, объем 0−1 нл, расстояние между ячейками ЗОмкм. Поскольку перед нанесением ячеек стекло обрабатывают раствором Repel-Silane, поверхность стекла между ячейками является гидрофобной, В таком виде микрочип может храниться месяцами. Рис. 5. Олигонуклеотидный generic микрочип. Изображение снято с помощью специализированного флуоресцентного микроскопа, оборудованного CCD камерой, соединенной с компьютером. Универсальный generic микрочип, разработанный по этим технологиям, содержит 4096 октадезоксирибонуклеотидов, следующей последовательности gel-5-NH2-MNNNNNNM-3, где N одно из четырех оснований, М вырожденное основание (равная смесь четырех нуклеотидов) (рис. 5). Таким образом, каждая ячейка микрочипа содержит уникальную гексамерную последовательность, а весь микрочип содержит полный перебор гексамерных последовательностей. Такой микрочип позволяет исследовать кинетические и термодинамические характеристики связывания лигандов,*» анализировать специфичность взаимодействия белков с короткими учасками ДЬЖ.* Для изучения связывания лигандов и белков с двунитевыми олигонуклеотидами, гибридизуемая смесь олигонуклеотидов флуоресцентно метится. Для анализа взаимодействия белков с однонитевыми красителями олигонуклеотидами generic микрочипа, флуоресцентными 12 (Texas Red, FITC) метят белки. Generic микрочипы имеют низкую плотность иммобилизованных олигонуклеотидов иммобилизация по сравнению двумерными в объеме микрочипами. Однако олигонуклеотидов трехмерного геля в несколько сот раз увеличивает емкость каждой ячейки по сравнению с иммобилизацией на поверхности стекла, что позволяет работать с более высокими сигналами и упростить регистрирующие приборы. Концентрация иммобилизованных олигонуклеотидов generic микрочипа, произведенного по второй технологии, составляет 200 50 мкМ. Размер такого микрочипа 16×17 мм. Несмотря на различия в производственных методах, результатом является ДНК микрочип, обладающий следующими свойствами: очень точная, высокой плотности решетка однонитевых нуклеотидных образцов, расположенная на твердой поверхности. При этом для исследователя в точности известна последовательность нуклеотидного образца в каждой позиции решетки (ячейке) микрочипа. Во всех широко используемых форматах микрочипов детектирование гибридизованных последовательностей обычно производится с помощью предварительного мечения флуоресцентными красителями гибридизуемых образцов, либо мечение осуществляется после гибридизации. В камере микрочипа флуоресцентно меченные олигонуклеотиды гибридизуются с комплементарными олигонуклеотидами, иммобилизованными на чипе. В результате сигналов количеству такой гибридизации образуется картина флуоресцентных результирующего в различной интенсивности. Интенсивность флуоресцентного сигнала в каждой ячейке микрочипа пропорциональна соответствующей нуклеотидной последовательности анализируемой смеси. Динамический диапазон интенсивностей измеряемых флуоресцентных сигналов, детектируемых CCD-камерой или сканером, перекрывает 3−4 порядка. Это означает, что возможно одновременно детектировать как слабые, так и сильные гибридизационные сигналы. 13 Применение ДНК микрочипов. В настоящее время внимание исследователей сконцентрировано на создании методов, позволяющих эффективно использовать обширное количество информации, полученной в результате сиквенирования генома человека и других организмов. В результате сиквенирования полного генетического материала человека возникло три вопроса (см. рис. 6): 1) как дифференциальная экспрессия этой информации связана со здоровьем и болезнями- 2) как мутации или небольшие вариации в последовательностях генов влияют на возникновение тех или иных генетических заболеваний или увеличивают риск этих заболеваний- 3) какие белки экспрессируются тем или иным геном, их классификация и функции, Первый вопрос, связанный с генной экспрессией, находится в центре внимания функциональной геномики. Функциональную геномику можно определить как изучение всех генов, экспрессируемых отдельными клетками или группой клеток, и тех изменений в их экспрессии, которые происходят во время развития, болезни И И под влиянием окружающей среды. Второй вопрос, связанный с ДЬЖ Л полиморфизмом, иногда рассматривают как часть геномики, либо относят к области функциональной геномики. И наконец, третий вопрос относится к области протеомики. Рис. 6. ДНК Транскрипция мРНК Поток генетической информации/ Геномика сиквенирование и создание библиотеки геномов. Функциональная геномика изучение генной экспрессии. Трансляция Белок Протеомика изучение экспрессируемых белков. 14 Анализ генной экспрессии. В прошлом, различные технологии (Северный блоттинг, точечный блот и другие) позволяли произвести анализ генной экспрессии одногонескольких генов в одном эксперименте. На сегодня, технология ДНК микроматриц позволяет определить уровень экспрессии десятков тысяч генов в одном эксперименте путем получения меченного обратного транскрипта полной мРНК, выделенной из клеток организма, и его последующей гибридизации с множеством различных ген-специфичных иммобилизованных кДНК молекул. Этот метод позволяет установить, что, например образец, А содержит на 50% больше специфичной РНК, чем образец В, т. е. измерять уровень экспрессии генов в относительных единицах. Абсолютные величины транскриптов (образец, А содержит 1000 копий Р1Ж, а образец В 500 копий этого транскрипта) по этой технологии измерить нельзя. Нужно отметить, что изменения в транскрипции мРЬЖ не всегда коррелируют с изменениями, происходящими с белками: до достижения полной активности транслируемые белки часто претерпевают добавочные модификации. Но пока технологии протеомики не станут универсально доступными для исследователей, гибризационные матрицы остаются наилучшим методом для исследования генной экспрессии в масштабах функциональной геномики. Mark Schena et al. (1995) использовали в качестве образца для анализа генной экспрессии растение Arabidopsis thaliana, поскольку этот экземпляр имеет очень маленький геном. иммобилизовано кДНК 14 полных На стекле с помощью робота было последовательностей генов и 31 экспрессируемых участков. Для контроля так же были иммобилизованы 3 из других организмов, кодирующие AChR человека (рис. 7 al, 2), глюкокортикоидный рецептор крысы (рис. 7 с 11,12) и TRP4 (триптофановый биосинтез) дрожжей (рис. 7 h 11,12). Длина иммобилизованных образцов составляла в среднем 1000 оснований. Для калибровки полная мРРЖ 15 растения была в массовом соотношении 1:10 000 смешана с мРНК человеческого рецептора на ацетилхолин AChR. В ходе одного раунда реакции обратной транскрипции были получены флуоресцентно меченные образцы кДНК. В результате последующей гибридизации флуоресцентно меченной смеси и последующего сканирования флуоресцентных гибридизационных сигналов были получены флуоресцентные сигналы практически по всем иммобилизованным образцам кДНК (рис. 7А). Благодаря калибровке по соотношению масс тотальной мРНК и мРНК AchR, был установлен максимальный уровень чувствительности детектируемых флуоресцентных сигналов, который составил примерно 1:50 000. Для кДЬЖ, кодирующих глюкокортикоидный рецептор крысы и TRP4 дрожжей (рис. 7А, с 11,12, h 11,12) не было обнаружено детектируемых гибридизационных сигналов. Анализ флуоресцентных сигналов показал, что минимальные и максимальные величины уровней экспрессии 45 генов различаются на три порядка (Рис. 7 А и В). Затем были выделены образцы мРНК растения дикого типа и растения с генетической модификацией в к/ЩК гена НАТ4. В ходе реакции обратной транскрипции с добавлением флуоресцеини лессаминмеченного нуклеотида были получены образцы кДНК растения дикого типа и растения с генетической модификацией, меченные красителями флуоресцеин и лессамин, соответственно. Затем оба образца были смешаны в одинаковых пропорциях, после чего смесь гибридизовалась на одном микрочипе, а результат гибридизации сканировался в двух длинах волн. Яркий гибридизационный сигнал наблюдался в позиции el, 2, соответствующей кДНК гена НАТ4 лиссамин-меченного трансгенетического образца (рис. 7D), в то время как сигнал для флуоресцеин-меченного образца дикого типа в этой позиции отсутствовал (рис. 7С). Калибровка с помощью AchR мРНК, которая была добавлена в реакцию синтеза флуоресцеини лессаминмеченной кДНК в соотношении 1: 10 000 и 1:100, соответственно, показала, что кДНК НАТ4 генетически модифицированного образца экспрессировала в 16 Heat Shock 10 100 F-xpressron Level (per 100.000) Рис. 8 Контроль генной экспрессии лимфоцитов крови человека, культивированных при 37С А), и лимфоцитов, вырощенных при повышенной температуре 43 С В), с помощью кДНК микроматрицы. Флуоресцентные сигналы представлены в псевдоцвете, в соответствии с уровнем экспрессии. Цветовая шкала была прокалибрована в отдельном эксперименте с использованием известного количественного соотношения контрольной мРНК растения Arahidopsis, добавленной в реакцию обратной транскрипции с включением меченого основания. Микроматрица содержит 10 контрольных кДНК Arabidopsis (верхний левый угол, ячейки 1−10) и 1046 кДНК лимфоцитов крови человека. 17 ячеек микроматрицы, интенсивность флуоресценции которых отличается более чем в два раза для двух типов клеток, выделены белыми рамками А). На рис. В) красными рамками отмечены ячейки, которые соотвествуют кДНК, увеличивающим свою экспрессию более чем в два раза в результате теплового воздействия, а зелеными рамками на рис. В) выделены ячейки, которые соотвествуют кДНК, уменьшающим свою экспрессию более чем в два раза в результате теплового воздействия. небольшое увеличение экспрессии 8 2 раза). Репрессировались гены, кодирующие цитохром с оксидазу III и |3 актин. Измерение уровней генной экспрессии 17-ти кДНК методом точечного блота показало примерно те же значения, что и в случае гибридизации на микроматрице (величины уровней экспрессии измеренные этими двумя методами различались менее чем в два раза). Следующий эксперимент по гибридизации в двух красках был выполнен для исследования влияния форболового эфира. Образцы мРЬЖ из клетки Jurkat, обработанные форболовым эфиром, и контрольные были 19 Heat Shock Phorbol Ester <0.5 0.5 2.0 >2.0 Expression Ratios Рис. 9 Схематическое изображение активируемых и репрессируемых генов при тепловом воздействии А) (также см. рис. 8) и в результате воздействия форбольным эфиром В). Цветовая шкала показывает во сколько раз изменился уровень экспрессии кДНК исследуемых клеток по сравнению с контрольными. помечены различными красителями, и их смесь была гибридизована на микроматрице, а результирующие сигналы отсканированы. Из 1046-ти кДНК шесть увеличивали генную экспрессию более чем в 2 раза (рис. 9В). Два гена, кодирующие РАС-1 тирозин фосфотазу и NF-kBl, значительно повышали уровень экспрессии, в 19 и 3.5 раза соответственно. Умеренную активацию испытывали гены, кодирующие фосфоглицерат киназу и р2микроглобулин (в 2.6 2.2 раза). Одна кДЬЖ, повышающая экспрессию в 2.1 раза, не была идентифицирована. Так же были проанализированы кДЬЖ из различных органов человека: костного мозга, головного мозга, простаты и сердца. Было получено, что экспрессия cytochrome С oxidase, hsp90a и еще одной новой неизвестной кДЬЖ значительно выше в клетках сердца, чем в клетках других органов. Анализ дифференциальной экспрессии генов с помощью микроматриц нашел широкое применение в медицине, особенно в злокачественных образований. Golub молекулярной et al. (1999) классификации использовали олигонуклеотидные микроматрицы высокой плотности фирмы 20 Affymetrix, содержащие пробы на 6817 генов человека. Образцы РНК бьши приготовлены из образцов костного мозга 38 пациентов с острой лейкемией (27 имели острую лимфобластную миелоидную лейкемию (ОМЛ). лейкемию (ОЛЛ), И острую Вначале для.

выводы.

1. Для анализа сиквенс-специфичности взаимодействия регуляторных и ДНК-связывающих белков с ДНК на примере белков р50 и HU развит метод и продемонстрирована возможность применения generic микрочипа, содержащего полный набор всех гексамерных последовательностей.

2. С использованием олигонуклеотидного generic микрочипа показано следующее:

— при взаимодействии с однонитевыми олигонуклеотидами белок HU проявляет большее сродство к GC-богатым последовательностям, чем к АТ-богатымпри взаимодействии белка HU с двунитевыми олигонуклеотидами большая часть последовательностей неспецифично стабилизируется белком, при этом гетерогенные мотивы AGA, AAG, AAGA способствуют наиболее сильной стабилизации дуплексов белком HUнаиболее специфичным для связывания белка р50 с однонитевыми олигонуклеотидами является мотив GGGG, а так же мотивы САСС и CATC;

— при взаимодействии с р50 наиболее эффективно дестабилизируются GC-богатые двунитевые олигонуклеотиды, и в особенности те из них, которые содержат мотивы GGTG/CACC, GATG/CATC и GTGG/CCAC.

3. Показано, что результаты анализа ДНК-белкового взаимодействия, полученные с помощью generic микрочипа, согласуются с данными, полученными традиционным методом gel-shift электрофореза.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Приношу свою глубокую благодарность моему научному руководителю Андрею Дарьевичу Мирзабекову. Выражаю глубокую признательность Александру Сергеевичу Крылову, моему наставнику в освоении работы с белками, Льву Павловичу Овчинникову и Максиму Скабкину за предоставленный белок р50 и проведение gel-shift электрофореза, Дмитрию Прокопенко за создание программ по обработке экспериментальных данных и статистическому анализу результатов, Валентине Владимировне Чупеевой, Эдуарду Яковлевичу Крейндлину — за подготовку исследовательских микрочипов, Александру Колчинскому за помощь в работе и ценные замечания при обсуждении результатов. Отдельная благодарность Наталии Георгиевне Есиповой за помощь и поддержку.