Особенности оценки иммунотоксических и иммунофармакологических свойств различных групп фармакотерапевтических веществ: Экспериментальное исследование

Основной целью в исследовании возможной токсичности новых лекарственных средств на доклиническом этапе является доказательство их безопасности, установление зависимых и независимых от дозы побочных эффектов и степени их обратимости, определение соотношения пользы и риска при доказанной необходимости применения препарата (32, 41). На первых этапах упорядочения оценки безопасности лекарств влияние на иммунную систему не изучали или использовали методологию выявления профессиональных заболеваний (нанесение препаратов на кожу, ингаляционное воздействие). Однако, антиген-ность высокомолекулярных препаратов животного и микробного происхождения (вакцин, антисывороток), метаболитов беталактамных антибиотиков (189, 208, 221, 242), выраженное влияние лекарственных средств (гормональных препаратов, циклофосфамида) или имеющихся в них примесей, стабилизаторов и консервантов на иммунную систему привело к созданию различных методологических подходов изучения иммунотоксичности на уровне национальных программ разных стран (166,167,195,298). В настоящее время еще не выработано единой программы при изучении иммунотоксичности, наиболее активные исследования в этом направлении ведутся в Голландии и США (195).

Известны различные механизмы нарушений иммунной системы, сопровождающихся последовательным возникновением признаков иммунодефицитной, аллергической, аутоиммунной и онкологической патологии. Большинство психотропных, кардиотропных и антимикробных лекарственные средств и их метаболитов оказывают выраженное действие на клеточные мембраны, разные субпопуляции клеток и их эндогенную регуляцию, что может привести к подавлению или стимуляции иммунитета и возникновению воспалительных реакций различной этиологии. Так, экспрессия СОХ-2 в нейронах коры головного мозга, гиппокампа и других клетках усиливает патологические изменения при болезни Альцгеймера, сосудистых деменциях, раке прямой кишки и аде-номатозных полипах, что позволило проводить комплексную терапию этих заболеваний с применением НПВП нового поколения, а также поиску нейро-тропных препаратов с противовоспалительным компонентом действия. Для сердечных гликозидов и ряда других кардиотропных средств характерна способность к кумуляции с увеличением токсичности метаболитов (2, 5, 51, 57, 63, 122, 157, 188, 195, 309, 316). Частота аллергических осложнений колеблется при применении пенициллинов и цефалоспоринов, полученных по разным технологиям, в связи с наличием высокомолекулярных примесей, различием в реактогенности антигенных детерминант и перекрестной сенсибилизации, что указывает на необходимость дальнейшего изучения этой проблемы (51, 139, 179). Дополнительно следует отметить, что мембраноактивные соединения, а также элементы лекарственных форм, предложенных для повышения избыточности действия (противораковые препараты в виде дисперсных мицеллаобразных липидов, липосомальные формы лекарственных средств), способствуют возникновению псевдоаллергических реакций (343, 344, 345), что указывает на необходимость экспериментального изучения этих реакций у создаваемых лекарств.

Среди разработанных в НИИ фармакологии РАМН новых фармакологических средств скрининг производных меркапто-бензимидазола, пролинсодер-жащих пептидов и 3-оксипиридинов выявил соединения с антиоксидантными и мембранопротекторными свойствами, высокой активностью и широтой фармакологических эффектов — афобазол, ноопепт и мексидол (5, 439, 930). Оли-гопептиды обладают широким спектром функциональной активности, представляя собой регуляторы нервной, эндокринной и иммунной систем (21), что могло обусловить наличие у ноопепта иммунофармакологических свойств. У ряда производных 3-оксипиридина и 5-окспиримидина обнаружили антиокси-дантные и иммуномодулирующие свойства (59, 96, 115), в связи с чем исследование наиболее активных соединений этих групп может выявить новые перспективные препараты, предназначенные для коррекции различных нарушений иммунной системы.

Цель исследования.

Совершенствование системы оценки аллергизирующего и иммунотоксиче-ского действия на основе анализа иммунофармакологических эффектов мем-браноактивных веществ различной химической структуры и фармакологической активности. Для ее достижения необходимо решить следующие задачи:

1. Усовершенствование и разработка экспериментальных моделей при сравнительном изучении аллергизирующих свойств бетактамных антибиотиков и аминогликозидов, изучение влияния высокомолекулярных примесей на аллергизирующие свойства пенициллинов и цефалоспори-нов.

2. Создание экспериментальной модели для изучения псевдоаллергических реакций.

3. Характеристика и прогноз аллергизирующих (для антибиотиков) и аллергизирующих и иммунотоксических свойств психотропных и кардио-тропных средств.

4. Изучение роли кумуляции метаболитов в механизме токсического действия на примере кардиотропного препарата боннекор.

5. Изучение иммунофармакологических свойств оригинальных психотропных препаратов, обладающих мембранотропным действием.

6. Разработка на основе полученных данных методологических подходов к оценке иммунотоксических и аллергизирующих свойств мембраноактив-ных средств в дополнение к предшествующим «Методическим рекомендациям по оценке аллергенных свойств фармакологических средств» 1988 года и «Методических рекомендаций по оценке иммунотоксических свойств фармакологических средств» 1992 года.

Научная новизна работы.

На основании полученных данных впервые охарактеризованы аллергизирующие и иммунотоксические свойства новых кардиотропных, психотропных средств и ряда других изученных мембраноактивных соединений.

Создана оригинальная, экономичная и информативная модель для выявления псевдоаллергии, которая может быть использована и для скрининга новых противовоспалительных и противоаллергических средств .

Выяснен механизм связанного с кумуляцией, летального действия метаболитов антиаритмического препарата боннекор.

Изучены выраженные противовоспалительные свойства препарата ноопепт, что дополняет информацию о механизмах его нейропротективного действия.

Впервые определены иммунокорригирующие свойства ноопепта, выявлено значительное увеличение спонтанной пролиферативной активности спленоци-тов под действием препарата, что указывает на возможность усиления пролиферации различных типов клеток головного мозга.

Среди производных 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов найдено активное иммунотропное соединение ОПМ-411, с выраженной противоопухолевой активностью.

Экспериментально доказано наличие высокомолекулярных примесей у лактамных антибиотиков отечественного производства, удаление которых методом ультрафильтрации приводило к выраженному уменьшению аллергизи-рующих свойств бензилпенициллина.

Практическая значимость.

Научные положения и выводы выполненной работы явились основой для дополнения и совершенствования изданных Фармакологическим комитетом РФ «Методических рекомендаций по оценке аллергенных свойств фармакологических средств» 1988 года и создания новых «Методических указаний по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ» 1999 года и «Методических указаний по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ», которые вошли в «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» 2000 года.

Создана оригинальная экспериментальная модель для выявления псевдоаллергических реакций при изучении мембраноактивных соединений.

Даны рекомендации по удалению высокомолекулярных примесей р-лактамных антибиотиков, что ведет к значительному снижению аллергенности беталактамидов.

Определены и изучены новые свойства (противовоспалительные и иммуно-корригирующие) препарата ноопепт, что позволит расширить его использование при заболеваниях нервной системы, связанных с развитием воспалительных процессов и иммунодефицитных состояний.

Скрининг среди ряда производных 3-оксипиридинов и 5-оксипиримиди-нов выявил активный иммуномодулятор ОПМ-411 с противоопухолевой активностью.

Материалы по изучению аллергизирующих свойств препаратов (карфе-циллин, карбенициллин, азлоциллин, цефалотин, суспензия ампициллина, це-фалексин, суспензия цефалексина, рифампицин, бефол, апилактоза, рондофер-рин, рондекс-М, ладастен) аллергизирующих и иммунотоксических свойств пептида-дельта-сна, тропоксина, афобазола, ноопепта, брадизола вошли в комплект документов, на основании которых Минздрав РФ разрешил их клинические испытания.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработка на основе полученных данных методологических подходов к оценке иммунотоксических и аллергизирующих свойств мембраноактивных средств различных фармакотерапевтических групп с выявлением их возможного иммунофармакологического действия .

2. Создание оригинальной экспериментальной модели псевдоаллергической реакции на конканавалин А, которая позволяет определять влияние изучаемых веществ на острое экссудативное воспаление и выявить противовоспалительные свойства у новых мембраноактивных соединений.

3. Доказательство отсутствия аллергизирующих и иммунотоксических свойств у кардиотропных средств, синтезированных в Институте фармакологии РАМН, при введении их в терапевически эффективных дозах.

4. Определены аллергизирующие свойства и высокомолекулярных примесей у изученных беталактамных антибиотиков отечественного производства, предложены методы удаления примесей и продуктов полимеризации.

5. Выявлены противовоспалительные и иммунокорригирующие свойства ноопепта и противовоспалительные свойства производных 2-меркаптобенз-имидазола.

6. Скрининг иммунотропной активности среди ряда соединений 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов с иммуномодулирующими свойствами определил наиболее активное соединение ОПМ-411, обладающее также выраженной противоопухолевой активностью.

Основные сведения об апробации работы.

Основные результаты диссертации доложены на Всесоюзной конференции «Химиотерапия бактериальных инфекций» (Алма-Ата, 1979), 4-й Всесоюзной конференции «Побочное действие лекарственных средств» (Москва, 1982), 1-м Всесоюзном съезде токсикологов (Ростов-на-Дону, 1986), 6-м Всесоюзном съезде фармакологов (Ташкент, 1988), 8-м Международном симпозиуме по токсичности лекарственных средств (Берлин, 1988), информационной конференции по клиническому применению бефола (Тбилиси, 1989), 4-й конференции «Биоантиоксиданты» (Москва, 1992), 4-м, 5-м и 8-м конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1997, 1998 и 2001), VII Международном конгрессе по им-мунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие» (Нью-Йорк, 2001), 3-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Суздаль, 2001), 2-м съезде Российского общества фармакологов «Фундаме-тальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), на межлабораторной конференции ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН (Москва, 2003), на 41-м Конгрессе Европейского общества токсикологов (Флоренция, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 323 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 5 глав результатов собственных исследований, заключения и выводов. В работе имеется 78 таблиц, 19 рисунков. Библиографический указатель содержит 383 источника, из которых 131 принадлежит отечественным и 252 -зарубежным авторам.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны новые методологические подходы к оценке иммуноток-сических и алл ер газирующих свойств мембраноактивных средств различных фармакотерапевтических групп на основе анализа их иммунофармаколо-гической активности.

2. Создана оригинальная экспериментальная модель псевдоаллергической реакции на многофункциональный лектин конканавалин А, позволяющая быстро и информативно определить влияние изучаемых веществ на острое экссудативное воспаление и выявить противовоспалительные свойства у новых мембраноактивных соединений.

3. При изучении аллергизирующих и иммунотоксических своств кардио-тропных средств многократное введение различными способами метацизина, кардиоциклида и брадизола не оказывало патологического усиления гуморального и клеточного иммунного ответа.

Введение

метацизина и брадизола в дозах, в 5 раз превышающих терапевтические, приводило к подавлению иммунитета. Внутривенное введение производных 2-меркапто-бензимидазола (брадизола и афобазола) оказывало выраженное противовоспалительное действие (на 55,8% и 63,0%).

4. Определен механизм летального токсического действия метаболитов антиаритмического препарата боннекор (при хроническом пероральном введении собакам в течение 6-ти месяцев в дозе 15 мг/кг), приводящего к атриовентрикулярной блокаде с желудочковой тахикардией.

5. При изучении аллергизирующих свойств азакраунэфира С-3 (в дозах 5, 20 и 50мг/кг), апилактозы (в дозах 50 и 500 мг/кг) и препарата АВП (в дозах 2 и 60 мг/кг) выявили анафилактические реакции разной степени тяжести. Усиление реакции псевдоаллергии вызывали эстриглутон (в дозах 100 и 500 мг/кг) и препарат АВП (в дозах 2 и 60 мг/кг).

6. Доказано наличие аллергизирующих свойств у изученных беталактам-ных антибиотиков отечественного производства, в значительной степени обусловленных наличием высокомолекулярных примесей.

7. Препарат ноопепт, при разных способах и продолжительности введения в различных дозах, обладает выраженными противовоспалительными и имму-нокорригирующими свойствами. Доказана перспективность его применения для лечения заболеваний нервной системы, связанных с наличием хронических воспалительных процессов различного генеза и развитием иммуноде-фицитных состояний при когнитивных нарушениях, физических и психоэмоциональных травмах.

8. Скрининг иммунотропной активности среди ряда соединений 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов выявил наиболее активное соединение ОПМ-411. Установлено, что препарат способен корригировать лейкемоидную реакцию, индуцируемую ростом опухоли, уменьшая число кариоцитов в периферической крови. При всех режимах введения препарата ОПМ-411 мы-шам-опухоленосителям выявили достоверное торможение роста опухоли.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Механизмы иммунного ответа сопряжены со многими физиологическими процессами, на которые воздействуют различные факторы. Иммунофармако-логическая активность лекарственных средств при их введении также способна нарушить гомеостаз организма, вплоть до индукции различных патологических состояний. Сложность этих процессов состоит в том, что их признаки являются отражением динамической функции многих типов клеток, находящихся в разном состоянии, различных посредников, имеющих постоянно меняющиеся концентрационные и временные характеристики (34,188) .

Иммунотоксические эффекты значительно варьируют, однако три основных варианта иммунотоксичности могут быть экспериментально идентифицированы: 1) прямая иммунотоксичность- 2) гиперчувствительность — и в меньшей степени — 3) аутоиммунные заболевания (188, 245). Прямая иммунотоксичность химических реагентов и лекарственных средств имеет отношение к изменению качества нормального иммунного ответа и выражается в иммуномо-дуляции, включающей как иммуносупрессию (иммунодепрессию), так и имму-ностимуляцию. По химической природе истинные антигены, как правило, являются известными макромолекулярными соединениями (белками, олигопеп-тидами, полисахаридами, гликолипидами, полифосфатами), что страхует организм от легкой индукции специфического иммунного ответа и патологических процессов с компонентами иммунного воспаления и участием антигенспеци-фичных лимфоцитов (35,109). Лишь относительно небольшая часть низкомолекулярных лекарственных средств (к которым относятся высокореактивные метаболиты беталактамных антибиотиков), называемых гаптенами, которые, согласно классической теории Ландпггейнера, способны ковалентно соединяться с циркулирующими и тканевыми белками или другими макромолекулами организма, становятся антигенами и подвергаются процессинговой обработке антигенпредставляющими клетками (АРС), что может в итоге привести к гиперсенсибилизации. Наличие свободных SH-, аминои гидроксильных групп в метаболитах белактамидов усиливало их способность вступать в соединение с различными протеинами (338).

Циклоспорин, глюкокортикоиды, иммунотропные средства, цитотоксичес-кие иммунодепрессанты и ряд других препаратов активно влияют на различные фазы и эффекторные механизмы резистентности и специфического иммунного ответа, в таких случаях решающим фактором соотношения пользы и риска при применении препарата может быть исходное состояние пациента. Большинство изученных нами фармакологических соединений с мембрано-тропной активностью могут уменьшать (в единичных случаях усиливать) деструктивные воспалительные процессы в очагах поврежденной ткани не вызывая необратимых патологических нарушений иммунной системы.

Под влиянием лекарственных средств, вводимых в организм, может активироваться или угнетаться апоптоз клеток иммунной и других систем организма, что может обусловить развитие иммунодефицита или, наоборот, развитие как аллергических так и аутоимунных реакций. По мнению Д. К. Новикова с соавторами (91, 92), все лекарства действуют на те или иные клеточные рецепторы и ферменты, в частности прямо или опосредованно изменяя экспрессию Раз-антигена (СЭ95) на клетках или его лиганда (БазЬ), в результате чего меняется способность клеток к апоптозу. В частности избыточность, недостаточность или глубокие дефекты механизмов апоптоза в нейтрофилах могут лежать в основе патогенеза многих заболеваний, а также быть следствием развития самого патологического процесса и способствовать его отягощению (89). Некоторые токсические и псевдоаллергические эффекты лекарственных средств у чувствительных, генетически предрасположенных пациентов могут быть также опосредованы механизмами апоптоза.

Основные клинические прояления иммуносупрессии наблюдают чаще всего при инфекционных и раковых заболеваниях (2,12, 41). Одним из вариантов возникновения онкологических осложнений может быть проявление гено-токсичности эндогенных метаболитов, вызванное окислительным стрессом фагоцитирующих клеток, способных образовывать АФК (41,363). Согласно данным, представленным в монографии А. Д. Дурнева и С. Б. Середенина (41), возможная роль фагоцитирующих клеток в качестве значимого источника эндогенных мутагенов была экспериментально подтверждена в опытах на клетках китайских хомяков, в которых было выявлено увеличение уровня хромосомных и генных мутаций, культивируемых с нейтрофилами мышей и крыс, активированных ФМА. Усиление генотоксичного действия ПМЯЛ на патогенную микрофлору под воздействием АФК или прямого взаимодействия органических радикалов с ДНК микроорганизмов при инфекционном процессе является одним из факторов неспецифического иммунитета (207, 257). Увеличение уровня мутаций у микроорганизмов было обнаружено при инкубации последних с гранулоцитами здоровых доноров, этот показатель не возрастал при использовании тех же клеток из крови больных хроническим гранулематозом, не способных продуцировать супероксид-радикал кислорода.

При различных формах ишемии, эмоциональном стрессе, сосудистых де-менциях, таких аутоиммунных заболеваниях, как ревматоидный артрит, красная волчанка, сопровождающихся выраженным окислительным стрессом многих типов клеток, мощный цитотоксический потенциал нейтрофилов, составляющих у человека более 60% лейкоцитов крови, усиливает основное заболевание или может привести (в случае изменения синтеза ДНК) к еще более тяжелым последствиям (70,201, 209, 265).

Так как неспецифические и специфические факторы (гуморального и клеточного) иммунитета включаются в мощную защиту против микробных агентов, организм при инфекционных заболеваниях проходит через различные экстремальные состояния. Становится все более очевидным, что при анализе действия иммуноактивных соединений необходимо учитывать взаимодействие с гипотамус-гипофиз-надпочечниковой системой (НРА), осуществляемое гормонами и иммунорегуляторными медиаторами (360). В настоящее время доказано действие 1Ь-1|5 на секрецию АКТГ, индукция 1Ь-1р секреции АКТГ зависит от пептида гипоталамуса СШ7, который стимулирует секрецию АКТГ гипофиза (153, 182,197,358, 360), что подтвердило гипотезу о влиянии иммунорегулято-ров на ЦНС. Известно, что АКТГ, вырабатываемый гипофизом, стимулирует рост коры надпочечников и образование в ней эндогенных глюкокортикоидов, предотвращающих «превышение» иммуновоспалительных процессов, уменьшая защитный ответ организма хозяина на инвазию патогена (или другого агента), который может вызвать гиперсенсибилизацию или аутоиммунные расстройства. Поэтому имеющиеся в литературе данные о действии иммуномоду-ляторов, которые «сами» снижают повышенные и увеличивают исходно сниженные показатели иммунитета, должны подтверждаться опытами на гипофи-зэктомированных животных (99, 229).

Доказано, что бензол, пестициды, кадмий, кобальт, ванадий, асбест, органические фосфаты, озон и ряд других соединений (многие лекарственные средства в больших дозах) оказывают иммунодепрессивное действие на человека и грызунов, что может вызвать или усилить хронические инфекционные заболевания (188, 189, 208, 221, 242, 245,). Программы США по изучению иммуно-токсичности направлены прежде всего на обнаружение иммунодепрессивных свойств химических агентов, не уделяя должного внимания проблемам гиперчувствительности (195). Однако, как справедливо отмечают представители европейской школы (298, 363), изучение возможности поливалентной гиперсенсибилизации при все возрастающем приеме лекарственных средств и пищевых добавок для человеческой популяции в целом более актуально. В 1996 году во Франкфурте представители различных стран, члены the European Inflammation Society, обсуждали наиболее важные направления при изучении имму-нотоксичности лекарственных средств и пищевых добавок (298). По мнению E. Gleichmann (Dusseldorf, Germany), сенсибилизация к ксенобиотикам встречается намного чаще, чем иммуносупрессия. Специфическая сенсибилизация и высвобождение цитокинов CD4+ Тклетками являются решающими в возникновении большинства аллергических и аутоиммунных патологий, напримерв Испании, где сенсибилизация к пенициллинам в процентном отношении более выражена, пенициллины стимулируют в основном CD4+ Тклетки, в других странах — CD4+ Т и CD8+ Тлимфоциты, что вероятно связано с иммуногенети-ческими различиями в популяции (W. Pichler, Berne, Switzerland). Тяжелые металлы также способны изменять структуру антигенных белков на пептидные фрагменты таким образом, что они могут связываться с молекулами II класса главного комлекса гистосовместимости (МНС) и активировать Th-2 клетки, в результате чего возникает секреция IL-4, что обеспечивает необходимый сигнал для синтеза IgE.

Основателями изучения и разработки экспериментальных моделей для выявления анафилактогенных свойств фармакологических препаратов являются представители фармацевтических фирм Японии, с 1991 года, согласно рекомендациям Japanese Pharmaceutical Manufacturers Association, каждый новый лекарственный препарат необходимо тестировать на антигенность (298). На 37 конференции токсикологов в Сиетле в 1998 году: «Токсикология белковой ал-лергенности: предсказание и характеристика», было отмечено, что 1−2% человеческой популяции имеют IgEзависимую аллергию к белкам, поэтому усовершенствование и обсуждение экспериментальных моделей на животных и других методов для оценки потенциальной аллергии к белкам, является важнейшим приоритетом для токсилогических исследований, что поможет оценить риск белковой иммунизации у гиперчувствительных индивидуумов (238). При экспериментальном изучении селективного действие овальбумина (OVA) и бычьего сывороточного альбумина (BSA) на субпопуляцию CD4+ Т-хелперов (I.Kimber et al., 1999) было доказано, что при иммунизации овальбу-мином происходит синтез IgE антител, бычий сывороточный альбумин вызывает синтез IgG2a антител. Это исследование имеет принципиальное значение для понимания иммунотоксичности известных высомолекулярных антигенов, которые чаще чем другие вещества могут вызвать селективное развитие ТЪгклеток, что может вызвать аллергическую сенсибилизацию. Поэтому при выраженной стимуляции лекарственными средствами субпопуляции CD4+ Т хелперов (что свойственно например производным адамантана) необходимо более тщательное изучение их возможных аллергизирующих свойств.

Установление выраженной стимуляции фармакологически эффективным соединением Th2 клеток, в результате чего возникает преимущественно IgE-ответ (функциональными или нефункциональными иммунологическими методами) является с нашей точки зрения одним из наиболее важных показателей иммунотоксичности изучаемого вещества. Согласно данным, представленным в монографии И. С. Гущина (34), у человека избирательное возникновение ТЪ2 ответа зависит от природы антигена, пути и режима его поступления в организм, наследственных признаков у атопических больных, факторов среды, существования комплексных влияний цитокинов, которые усиливают как дифференцировку ТЬ-клеток, так и синтез и секрецию ^Е.

До сих пор нет удовлетворительного теоретического обоснования, почему одни вещества (фармакологические средства, пищевые добавки) с выраженной антигенной активностью стимулируют^{в-ответ,} а некоторые лекарственные препараты с небольшим молекулярным весом и отсутствием активных метаболитов вызывают выраженные анафилактические реакции. Поэтому даже обнаружение только кожносенсибилизирующих антител в реакциях активной или пассивной кожной анафилаксии после введения изучаемого соединения необходимо учитывать при дальнейшем изучении препарата в клинике (в связи с меньшей чувствительностью интактных морских свинок, мышей и крыс по сравнению с разнородной человеческой популяцией).

При изучении аллергизирующих свойств плазмозамещающего средства полифункционального действия рондоферрина, внутривенное введение препарата вызывало у мышей дозозависимое подавление реакции на Кон А, однако, в реакции активной кожной анафилаксии у 20% морских свинок были обнаружены кожносенсибилизирующие антитела. Исследование аллергизирующих свойств гемодинамического плазмозаменителя рондекса-М в тех же дозах, что и рондоферрина показало, что препарат не вызывал системных реакций анафилаксии и образования кожносенсибилизирующих антител. При иммунизации морских свинок рондексом-М в смеси с ПАФ повышенной чувствительности выявлено также не было. Внутривенное введение рондекса-М вызывало у мышей подавление реакции на Кон А. Изучение алллергизирующих свойств и возможных псевдоаллергических реакций для подобного рода соединений должно проводится наиболее тщательно, в связи с наличием в клинике анафилактоидных реакций различного генеза при внутривенном введении плазмозаменителей.

В «Методических рекомендациях по оценке аллергенных свойств фармакологических средств» 1988 года на различных экспериментальных моделях (в частности модифицированного нами метода оценки гиперчувствительности замедленного типа в опытах на морских свинках) было рекомендовано изучение алергизирующих свойств новых фармакологически эффективных соединений при испытании 2-х уровней доз (терапевтической и на порядок выше), эквивалентных исследуемым на других видах животных при изучении хронической и других специфических видов токсичности. Ранее сенсибилизирующих свойства определяли используя конъюкгивальную пробу и при нанесении препаратов в течение 20 дней на депилированный участок кожи животных и затем разрешающей дозы на другой бок для определения возможных аллергизирующих реакций, адекватных профессиональным аллергическим заболеваниям у рабочих. Нами было рекомендовано считать, что если число сенсибилизированных животных в группе по одному из предложенных тестов составляет менее 50%, то наблюдаемые эффекты рассматриваются как проявление индивидуальной чувствительности. Если число сенсибилизированных животных в опытной группе составляет 50% и выше, то лекарственное средство относится к потенциальным аллергенам. Постановка реакции общей и активной кожной анафилаксии по общепринятой в настоящее время схеме на морских свинках позволила нам выявить анафилактогенные свойства у соединений, обладающих выраженными сенсибилизирующими свойствами (апилакгозы, ДНК-содержащего соединения АВП, азакраунэфира С-3). Определение влияния нерастворимых в воде и физиологическом растворе препаратов на выраженность реакции анафилаксии (при иммунизация морских свинок БКЯ, основным компонентом которого является овальбумин) является чувствительным и удобным методом, позволяющим оценить анафилактогенные свойства у изучаемых веществ, однако этот метод еще не введен в методические рекомедации.

В «Методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ» 1999 года в качестве оригинального метода для выявления псевдоаллергических реакций нами была рекомендована реакция воспаления на конканавалин, А (метод включен в раздел 4. Псевдоаллергические реакции «Методических указаний по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ» 1999 года).

Пенициллины и цефалоспорины являются высокоэффективными и наиболее широко применяемыми антибиотиками (79, 309, 364). Идентичность основного механизма антимикробного терапевтического действия и образования антигенных комплексов при раскрытии беталактамного кольца не позволяет уменьшить аллергизирующие свойства этих антибиотиков в результате воздейтвия на беталактамное кольцо. В тоже время частота аллергических осложнений при применении беталактамидов зависит от наследственных признаков и общего состояния пациентов, пути введения, реакционной способности антибиотиков и продуктов их деградации образовывать прочные ковалентные связи с циркулирующими и тканевыми белками в организме, наличия высокомолекулярных примесей и продуктов полимеризации в получаемых ферментативным способом препаратах. Экспериментальное и клиническое изучение аллергизирующих свойств больших и малых антигенных детерминант беталакгамных антибиотиков является примером детального изучения иммунотоксичности их активных метаболитов (138, 206, 212, 302, 307, 316, 320), прежде всего бензилпе-нициллина. Бензилпенициллин является самым реакгогенным антибиотиком с точки зрения стимуляции гиперчуствительности по всем 4 типам. В организме в процессе биотрансформации образуется более 10 метаболитов, каждый их которых может быть гаптеном. Пенициллин может непосредственно реагировать с е-аминогруппами белка, образуя комплексы макромолекул, кроме пени-циллоила остальные продукты деградации также высокоаллергенны, возможно, что 20% реакций на пенициллины являются псевдоаллергическими (90, 91). Однако имеющиеся знания не способствовали уменьшению полиморфизма возникающих аллергических и псевдоаллергических реакций в разнородной человеческой популяции и все возрастающей (за последние 20 лет) поливалентной^{-зависимой,} наиболее опасной 25% сенсибилизации населения индустриальных стран (308, 361). Согласно данным хиругического центра в Далласе (Я.Бокпзку е1 а1., 2000, 2002 г. г.), около 10% пациентов имели аллергию к пенициллинам (в обзорах по клиническим данным до 1980 г. аллергия к пенициллинам составляла 1−10%), эта популяция гетерогениа, в частности в последние годы наблюдают много пациентов с развитием анафилактоидных реакций к пенициллинам и отсутствием к ним положительных кожных тестов (M.J. Torres et al., 2002). Важна правильная диагностика анафилактических и неиммунологических анафилактоидных реакций, которые могут быть вызваны антибиотиками (258). IgE-антитела в сыворотках больных гетерогенны и определяются к большим и/или к малым антигенным детерминантам пенициллина, ампициллина, амоксициллина и цефалоспоринов в каждом конкретном случае по-разному (Z. Zhao et al., 2001). Отсутствие в ряде стран (в том числе и в России) требований по максимальной очистке от высокомолекулярных примесей (многие из которых вызывают в основном IgE-зависимые аллергические осложнения) полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов, созданных на основе 6-АПК и 7-АЦК, согласно экспериментальным и клиническим данным (51, 338), способствует увеличению количества аллергических осложнений при приеме получаемых ферментативным способом препаратов. Высокомолекулярные фракции пептидного препарата церебролизин (также полученного ферментативным способом) вызывали у пациентов аллергические реакции (228), в связи с чем его производство в Германии было приостановлено до внедрения новых технологий, позволивших идентифицировать и удалять аллергенные примеси, что привело практически с ликвидации аллергических осложнений при приеме этого пептидного препарата.

Полученные нами данные также доказывают наличие аллергизирующих свойств у всех изученных пенициллинов и цефалоспоринов и согласуются с данными литературы о менее выраженных побочных аллергических реакциях при лечении беталакгамидами по сравнению с бензилпенициллином. Впервые были выявлены высокомолекулярные примеси у антибиотиков отечественного производства, удаление которых методом ультрафильтрации приводило к уменьшению аллергизирующих свойств.

Псевдоаллергические реакции на лекарственные препараты являются не менее опасными чем реакции, протекающие по 1 типу гиперчувствительности, так как мембраны многих типов клеток не выдерживают избыточного фармакологического воздействия (342, 343, 344). Наиболее часто псевдоаллергические реакции с различным механизмом действия возникают у женщин от 40 до 80 лет, особенно с сопутствующими хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарной системы, почек и нейроэндо-кринной системы, нередко со смертельным исходом (63, 92). Кроме того, комп-лементзависимые иммунологические травмы воспроизводят один из типовых патологических процессов — повреждение, которое может привести к снижению активности нейронов, вплоть до выпадения их функции, т. е. к индукции одного из типовых патогенетических механизмов неврологических расстройств (55). Связанные с нейтрофилами медиаторы и активация системы комплемента могут стимулировать выделение гистамина и других активных веществ из тучных клеток и базофилов. Активация альтернативного пути комплемента, что вызывает появление С5а и СЗ анафилатоксинов, наблюдается при внутривенном введении декстранов, плазмозаменителей и других лекарственных средств, особенно при многократных внутривенных инфузиях, дестабилизирующих клеточные мембраны и систему комплемента. Механизмы псевдоаллергии на лекарства разнообразны и напоминают соответствующие типы истинных аллергических реакций (190,302, 313,343).

Предложенная нами модель для изучения псевдоаллергических реакций теоретически была основана на способности конканавалина, А высвобождать из тучных клеток и базофильных лейкоцитов мышей медиаторы воспаления без участия реакции антиген-антитело. Поливалентный лектин конканавалин, А обладает полифункциональным механизмом действия, активируя не только высвобождение гистамина и лейкотриенов из тучных клеток и базофилов, но также активно влияет на нейтрофилы (активирует СОХ-2 на клеточных мембранах) и лимфоциты (митоген для Т-хелперов), быстро вызывая выраженный отек и воспаление, при внутривенном введении мышам оказывает значительное повреждающее действие на печень (20, 38, 109, 340). Процесс активации кислорода в различных типах клеток начинается сразу после добавления Кон, А или ФГА, причем генерация активных форм кислорода (АФК) зависит от присутствия ионов кальция и глюкозы (115). Кон, А стоит в одном ряду действующих агентов, вызывающих запуск дыхательного взрыва фагоцитарных клеток и также относится к, так называемым рецептор-опосредованным стимулам, используемым в используемым в хемилюминесцентном анализе ПМЯЛ (20). Поэтому частично подавление или стимуляция реакции воспаления на Кон, А фармакологически активными веществами, возможно, связано с активацией или подавлением разных типов реакций. Учитывая современное представление о том, при гиперсенсибилизации может быть запущено сразу несколько патологических механизмов разными типами клеток и медиаторов, реакция воспаления на Кон, А может быть использована не только для выявления псевдоаллергии, но и как модель при изучении противовоспалительных свойств фармакологически активных веществ с разным (в том числе и в процентном соотношении) механизмом действия. Наличие выраженного дозозависимого подавления реакции воспаления на Кон, А указывает на выявление у исследуемого вещества противовоспалительных свойств, что при необходимости указывает на целесообразность дополнительного его изучения, а также дополняет понимание механизма поликомпонентного действия этого препарата.

При однократном пероральном введении психотропного стимулятораи эстриглутона в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг было получено статистически достоверное увеличение реакции воспаления на Кон, А (на 37,9% и 53,0%), что, наряду с другими отрицательными характеристиками препарата, не позволило рекомендовать его для дальнейшего изучения. К потенциальным аллергенам были отнесены апилактоза и препарат АВП (при применении которого были обнаружены и псевдоаллергические реакции). Полученные данные позволили рекомендовать реакцию воспаления на Кон, А в качестве метода для выявления псевдоаллергических реакций.

Реакция воспаления на Кон, А зарекомендовала себя как хорошая скринин-говая модель для выявления наиболее эффективных заводских образцов противоаллергических средств с поликомпонентным механизмом действия. Были выявлены 2 из 9-ти наиболее активных промышленных образца препарата Рузам, адаптивного пептида, обладающего антиаллергенными свойствами, оказывающего системное противовоспалительное действие, с ингибирующей активностью по отношению к ферментативным системам лейкоцитов и макрофагов, участвующих в выработке медиаторов воспаления (102). Метод оказался более эффективным, чем метод пассивной кожной анафилаксии на морских свинках и был в дальнейшем успешно использован для определения заводских образцов препарата с максимальной активностью. Полученные результаты коррелировали с экспериментальными и клиническими данными (94, 102).

У кардиотропных средств, синтезированных и фармакологически изученных в НИИ фармакологии РАМН (кардиоциклида для перорального и внутривенного введения, метацизина и брадизола), аллергизирующих свойств выявлено не было. При изучении иммунотоксичности этих препаратов в терапевтически эффективных дозах они или не влияли на изученные показатели неспецифического, гуморального и клеточного иммунитета (кардиоциклид), или подавляли иммунный ответ при введении в высоких дозах (метацизин, брадизол). Метацизин не подавлял первичный иммунный ответ мышей линии СВА, не оказывал существенного воздействия на число АОК при введении препарата в «0» день и день «+1». При введении метацизина в высокой дозе выявили достоверное понижение антителообразования в реакции РПГА.

Введение

мышам брадизола внутрибрюшинно в дозе 14 мг/кг в течение 14-ти дней приводило к некоторому увеличению массы тимуса и селезенки у животных опытной группы по сравнению с контролем. Было показано, что двухнедельное в/б ведение препарата в дозе 14 мг/кг вызывало статистически достоверное (в 2,8 раза) подавление хемилюминесцентного ответа нейтрофи-лов на опсонизированный зимозан по сравнению с контрольными образцами. Курсовое введение брадизола в дозах 2,8 мг/кг и 14 мг/кг не вызывало достоверных изменений фагоцитарного индекса перитонеальных макрофагов по сравнению с контрольными данными. При введении брадизола в течение 14-ти дней в двух дозах мышам линий СВА и С57ВЬ/6 не было выявлено иммунотоксического действия на гуморальный иммунный ответ. У мышей гибридов р1(СВАхС57ВЬ/6) курсовое в/б введение брадизола в дозе 14 мг/кг мг/кг дней подавляло реакцию ГЗТ на 23%.

При изучении аллергизирующих свойств брадизола выявили достоверное дозозависимое подавление реакции воспаления на Кон, А при однократном внутривенном введении препарата в дозах 2,8 мг/кг и 14,0 мг/кг (соответственно на 55,83% и 62,15%). Полученные данные свидетельствуют о наличии у брадизола противовоспалительных свойств, что, возможно, связано и с действием на активированные нейтрофилы. Противовоспалительные свойства были обнаружены у препаратов, относящихся к разным фармакотерапевтиче-ским группам, но к одному классу химических соединений (производным 2-меркапто-бензимидазола), в частности антиаритмический препарат брадизол (2-[2-(диэтиламино)этилтио]5-этоксибензимидазол дигидрохлорид) и селективный анксиолитик афобазол (2-[2-(морфолино)этилтио]-5-этоксибенз-имидазол дигидрохлорид), при внутривенном введении в одинаковом диапазоне доз оказывали выраженное противовоспалительное действие на экссудативный отек на Кон А. Согласно данным литературы, производные имидазола, в частности бемитил и томерзол, способны взаимодействовать со свободными радикалами и обладают антиоксидантными свойствами (113).

Для кардиотропных средств характерно наличие малой терапевтической широты и специфической видовой чувствительности, поэтому необходимо анализировать возможность возникновения токсических эффектов при применении этих препаратов и кумулятивных свойств их активных метаболитов. В «Методических указаниях по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» 2000 года нет четких указаний по оценке токсического действия препаратов для наружного применения (мазей, антисептических средств в виде растворов). Изучение токсических кумулятивных эффектов кардиотропных препаратов или их метаболитов в ряде случаев нуждается в дополнительных доклинических исследованиях.

Разработанное и изученное в кооперации с Арцнаймитгельверк (Дрезден) и НИИ фармакологии РАМН антиаритмическое средство боннекор (тирацизин) в опытах на крысах обладало значительно большей терапевтической широтой, чем в опытах на собаках, которые погибали в различные сроки введения бон-некора в дозе 15 мг/кг При изучении фармакокинетических характеристик активных метаболитов боииекора наиболее сильное влияние метаболитов сказывалось при многократном введении, в связи с различным периодом полувыведения препарата и 4-х его метаболитов. Основной метаболит М-1 обладал выраженной прооксидантной активностью, с чем возможно связана его высокая токсичность при в/в введении. После введения боннекора у выживших собак на ЭКГ было отмечено чередование атриовентрикулярной блокады с желудочковой тахикардией, что согласовывалось с данными по фармакокинетике препарата и 4-х его метаболитов. Различная видовая чувствительность экспериментальных животных при изучении кардиотропных средств должна учитываться при доклиническом исследовании препаратов с малой терапевтической широтой.

Иммунофармакология объединяет иммунологию, патологию и фармакологию и является одним из наиболее быстро развивающихся научных направлений в области биомедицинских исследований, включающим взаимодействие между нервной, эндокринной и иммунной системами (53, 54, 109, 360). Наличие иммунофармакологических свойств у психотропных средств (в связи с взаимодействием между иммунной и нервной, иммунной и нейроэндокринной системами) является наиболее прогнозируемым, однако механизмы действия психотропных средств на иммунную систему, в частности адаптогенов, анти-оксидантов и олигопептидов различаются. Кроме того, в иммунологических расстройствах, возникающих при неврологических заболеваниях, может иметь место имеет патология нервной регуляции функций иммунной системы (53, 55). При изучении иммунотоксичности новых производных адамантана и ими-дазола (к которым относится левамизол), олигопептидов, производных пиридина и пиримидина, обнаружение иммунотоксических или иммунофармакологических свойств достаточно вероятно. Имунокорригирующие и иммунофар-макологические свойства психотропных средств могут являться частью их поликомпонентного фармакологического действия и направлены на патофизиологические процессы, вызванные основным заболеванием.

В механизме стрессорного снижения функций и повреждения многих внутренних органов значительную роль имеет действие избытка катехоламинов, Р-адренергические рецепторы (увеличение плотности р-АР рецепторов лимфоцитов) и активация ПОЛ, которые приводят к повреждению клеточных мембран. Стимуляция Р-адренорецепторов вызывает увеличение в нормальных киллерах (НК) уровня цАМФ и снижает их цитостатическую активность, предварительное введение Р-адреноблокаторов снижает этот эффект, длительный иммобилизационный стресс вызывает выраженную депрессию активности НК. При возрастании в макрофагах соотношения циклических нуклеотидов цАМФ/цГМФ снижается поглощение фагоцитируемого материала, высвобождение лизосомальных ферментов, хемотаксис (31,73,109). Уровень цитокинов у здоровых людей и нестрессированных животных достаточно низкий, экспрессию цитокинов вызывают инфекции, травмы, физиологические и психические стрессы, хронические заболевания ЦНС, такие как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, синдром Дауна (38, 66, 360, 376).

Острая фаза физиологического ответа организма (выработка цитокинов, генерация нейроэндокринного сигнала) на психологические и физические стрессы имеет много общих аспектов с инфекционными и воспалительными травматическими стрессами (136, 155, 182, 383). В экспериментальных исследованиях ЛПС является потенциальным стимулятором синтеза IL-1, IL-6 и TNF-a, он также индуцирует синтез цитокинов в чистой клеточной культуре клеток глии, без клеток крови (159, 256, 360). Различные зоны гипоталамуса активируются под влиянием стресса. Экспрессия IL-ip mRNA, IL-1га (223) в гипоталамусе увеличивалась через 30 минут после иммобилизационного стресса у крыс, экспрессия IL-6 mRNA в среднем мозге (midbrain) — через 4 -24 часа после иммобилизационного стресса (330, 360). В монографии В. В. Абрамова с соавторами (2) и других работах говорится о проникновениии IL-1Р и TNF-a через ГЭБ, однако в ряде исследований было показано, что пик объема между 0,05 и 0,3% от общей дозы меченных йодом1″ IL-ip и TNF-a найдено в каждом грамме мозговой ткани через 20−60 минут после их в/в введения, поэтому маловероятно, что такая часть цитокинов, поступающих в мозг, обладает физиологически значимым действием (360). В настоящее время преобладает гипотеза, что стимуляция IL-1 HP, А оси идет путем увеличения синтеза посредников, которые прямо взаимодействуют с нейросекреторными процессами в гипоталамусе. Этими посредниками являются классические нейротрансмитгеры, такие как катехоламины (142, 356), гистамин (360), а также эйкозаноиды (в основном ПГЕ2) и оксид азота (322, 360).

Как указывалось ранее, иммунотоксические (включающие аллергизи-рующие) свойства химических агентов и лекарственных средств изучаются в Голландии по наиболее полной и современной 2-х уровневой схеме с обязательным определением наличия IgE антител, а также идентификации лимфоцитов селезенки методом кластерного анализа (195).

Введение

специалистами ГНЦ Института иммунологии в «Методические указания по оценке иммунотоксических свойств фармакологических веществ» 2000 года в качестве одного из методов изучение активности нейтрофилов в тесте хемилюминесценции (которого нет в программах по изучению иммуно-токсичности США, Голландии и Германии) является с нашей точки зрения принципиально важным и актуальным для современной иммунотоксикологии. В последние годы все более пристальное внимание уделяется нейтрофильным лейкоцитам, которые являются первой линией обороны при инфекционных заболеваниях (31, 209, 265, 365), однако в связи с убедительными данными о цитотоксичности активированных нейтрофилов прооксидантные свойства фармакологически эффективных соединений далеко не вседа являюся положительным качеством для лекарственных средств и просто недопустимы для ней-ротропных и кардиотропных препаратов. Зрелые нейтрофилы имеют короткую продолжительность жизни и запрограмированы на апоптоз, который ограничивает токсический потенциал ПМЯЛ и способствует устранению излишних нейтрофилов из воспалительных участков, способствуя завершению острого воспалительного процесса. Эндотелиальная трансмиграция играет важную роль в регуляции апоптоза ПМЯЛ, адгезионные молекулы (ICAM-1) модулируют процесс програмированной клеточной гибели, р2 интегрины потенцируют TNF-a индуцированный апоптоз, тем самым предотвращается миграция ПМЯЛ, что ведет к локализации воспалительного процесса (89, 196, 299, 350, 365, 367). TNF-a стимулирует эффекторные функции нейтрофилов с одновременной индукцией апоптоза, причем функционирование и жизнеспособность нейтрофилов регулируется взаимным влиянием цитокинов (89, 365). Раэ-индуцированный апоптоз нейтрофилов супрессируется глюкокортикоидами, колониестимулирующими факторами, ЛПС и ингибиторами тирозинкиназ (89, 270, 286, 328, 324). Согласно данным экспериментальных и клинических исследований, имеется достаточное количество фактов, указывающих, что при многих заболеваниях нейтрофилы причиняют значительно больше вреда, чем пользы (70, 217, 265, 365). При инфекциях, различных формах стресса, ишемии мозга под действием хемат-трактантов ПМЯЛ активно передвигаются в зону воспаления. В отличие от макрофагов, киллинг микроорганизмов нейтрофилы осуществляют в основном в стадии незавершенного фагоцитоза (45,70, 209, 265), оказывая выраженное цитои органотоксическое действие. Свободнорадикальная активность лейкоцитов усиливается при различных формах воспаления и приводит к экспрессии ¡-№)8-синтазы в лейкоцитах, циклооксигеназы-2 на клеточных мембранах, запускающей синтез эйкозаноидов, в частности ПГЕг (280, 292, 314, 329). Для цитои органотоксического действия нейтрофилов важны временные характеристики (обычно 24−36 часов после начала воспаления). При ишемии мозга активированные нейтрофилы появляются в зоне поражения через 2 часа, примерно через 6 часов начинается наиболее активная адгезия клеток к эндотелию микрососудов, прохождение через ГЭБ и инфильтрация ткани мозга, максимум инфильтрации нейтрофилами в зоне ишемизированной ткани мозга наступает на 2 — 3 сутки, значительно увеличивая зону инфаркта мозга (31, 209, 267, 365). При инсульте наблюдается выраженная инфильтрация микрососудов головного мозга лейкоцитами, вызывающими периваскулярный отек (209, 217). Поэтому, в связи с токсическим действием нейтрофилов при ишемии, посттравматических рас-стройсвах различного генеза, в последние годы разрабатывается антилейкоцитарная фармакологическая стратегия, включающая введение монокло-нальных антилейкоцитарных антител, действие на провоспалительные цито-кины (1Ь-1р + ЮТ-а) и молекулы адгезии на клетках эндотелия (177, 365,.

378). При активации мембранных оксидаз и фосфолипидов нейтрофилов резко (более чем в 50 раз) возрастает потребление кислорода и окисление глюкозы, возникает респираторный взрыв с образованием мощных биооксидантов-перекиси водорода и свободных радикалов: супероксидного аниона, гидро-ксильного радикала, синглетного кислорода. Хемилюминесценция, которая сопровождает дыхательный взрыв нейтрофилов, может использоваться для определения прои антиоксидантных свойств изучаемых соединений.

Введение

антинейтрофильных антител при локальной ишемии у крыс уменьшало супероксидную активность и аккумуляцию нейтрофилов, а также размер инфаркта на 45−50% (177). На нейтрофилах и ряде других клеток находятся Р2 пуринорецепторы, антагонисты Р2 рецепторов угнетают развитие воспалительного процесса (46).

В отличие от нейтрофилов моноциты крови являются универсальной формой блуждающих и фиксированных незрелых макрофагов, у них более продолжительный (по сравнению с нейтрофилами) жизненный цикл, они медленнее (после нейтрофилов) проникают в очаг воспаления. Фагоцитирующие мононуклеары выполняют защитную функцию при воспалительной реакции и запускают генетически детерминированную программу восстановления дефекта в очаге воспаления. Поэтому необходимы четкие временные и дозовые характеристики при применении препаратов с иммуномодулиру-ющими свойствами адъювантного типа, чтобы дифференцировано стимулировать макрофагальное звено иммунитета (70,360).

При изучении психотропных препаратов с активирующими адаптогенными свойствами обнаружение аллергизирующих свойств и псевдоаллергических реакций достаточно вероятно. По нашим данным, препарат эстриглутон усиливал реакцию воспаления на Кон А, азакраунэфир С-3 обладал выраженными аллергизирующими свойствами, у производного адамантана — ладастена аллергизирующих свойств выявлено не было. В то же время нужно отметить, что для психотропных препаратов, применяемых при нейроастенических расстройствах (при наличии вторичного иммунодефицита), активация различных неиммунопатологических факторов иммунитета целесообразна (7, 8).

Одной из нейрохимических мишеней анксиолитиков, мембранных модуляторов ГАМК-БД рецепторного комплекса при фармакологической коррекции стресса, является регуляция структурных и функциональных мембранорецепторных взаимодействий, мембранопротекторные и антиокси-дантные эффекты анксиолитиков этой группы являются одним из механизмов восстановления рецепторного участка мембраны (24). При изучении иммуно-токсичности селективного анксиолитика афобазола (производного 2-мер-капто-бензимидазола) нами не было выявлено аллергизирующих свойств, выраженного действия на основные показатели иммунитета, при пероральном введении препарата в терапевтической дозе имелась некоторая тенденция к стимуляции клеточного иммунитета (на 15%), в/в ведение в терапевтически эффективной дозе 5 мг/кг вызывало значительное подавление (63,0%) реакции воспаления на Кон А. По данным В. И. Ратникова с соавторами (103) производное меркапто-бензимидазола под шифром МБИ-2 оказывало активизирующее действие на продукцию интерлейкина-2 и стимулировало клеточный иммунитет в реакции ПЧЗТ, стимуляция клеточного иммунитета характерна и для левамизола.

Известно, что пептидные препараты часто обладают более или менее выраженными иммунномодулирующими и/или противовоспалительными свойствами, а также усиливают пролиферативную активность различных типов клеток (15, 211). Проведенное нами экспериментальное изучение препаратов дельта-сон индуцирующего пептида (Б81Р) и Рузама показало, что Б81Р в терапевтически эффективной дозе оказывал незначительное стимулирующее действие на гуморальный иммунитет у мышей линии СВА, более выраженное у мышей линии С57В1/6. Пептидный препарат Рузам, действующий на различt ные патогенетические механизмы аллергического воспаления, обладал противовоспалительным действием, в частности на экссудативный отек на Кон А.

В настоящее время при изучении иммунной регуляции пептидами большое внимание уделяется полифункциональным олигопептидам (содержащим от 2 до 50 аминокислотных остатков), которые в отличие от белков не обладают устойчивой пространственной конфигурацией, в результате чего они могут проявлять большую конформационную подвижность, в частности их химические радикалы могут менять свое расположение в пространстве и подстраиваться под специализированные рецепторные структуры (21,61,75).

При изучении аллергизирующих и иммунотоксических свойств дипептид-ного ноотропа ноопепта нами были обнаружены его иммуномодулирующие и противовоспалительные свойства, которые затем были изучены по расширенной программе. Ноопепт в наших опытах при разных способах введения мышам вызывал стимулирующее действие на В-клеточное звено иммунитета у мышей различных линий при разной антигенной нагрузке. У мышей линии C57BL/6 стимулирующий эффект был наиболее выражен при в/м введении препарата через сутки («+1» день) после антигенной стимуляции (при введении препарата в дозе 0,5 мг/кг — 302, 6%, в дозе 5 мг/кг — 299, 7%). Иммуномостимулирующее действие дипептида на АОК в дозе 10 мг/кг воспроизводилось и при пероральном введении. При изучении влияния препарата ноопепт на клеточный иммунитет (ГЗТ) выявляемый эффект зависел от метода и длительности введения препарата. При однократном пероральном введении дипептида в дозе 10 мг/кг было выявлено стимулирующее действие препарата (на 45,9% по сравнению с контролем).

Введение

препарата ноопепт в дозе 10 мг/кг в течение 14 дней до иммунизации ЭБ стимулировало реакцию ГЗТ по сравнению с контролем на 30,7%, в дозе 100 мг/кг — на 24,1%.

14-ти дневное пероральное введение ноопепта в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг вызывало достоверное (в 3,6 и в 2,9 раза) повышение фагоцитарного индекса по сравнению с контрольными данными, что характерно для пролин-содер-жащих пептидов. По данным литературы (21), олигопептид глицин-аргинин-пролин (GRP) также усиливал адгезивные свойства макрофагов, их подвижность и способность к фагоцитозу.

Введение

циклофосфана в дозе 150 мг/кг в/б за 24 часа до антигенной стимуляции подавляло иммунный ответ на 38,0% по сравнению с контролем. В/в введение ноопепта в дозе 5 мг/кг на «+3» день восстанавливало первичный IgM иммунный ответ у мышей линии СВА на 48,4%. Наиболее выраженное 4-х кратное увеличение IgG иммунного ответа наблюдали у мышей обеих линий с вторичным иммунодефицитом при введении препарата в индуктивную фазу иммунного ответа, у мышей линии C57BL/6 — и в продуктивную фазу гуморального иммунного ответа. Ноопепт оказывал также стимулирующее воздействие на ГЗТ у мышей гибридов Fi (CBAxC57BL/6), более выраженное у мышей с вторичным иммунодефицитом. В/в введение дипептида в дозе 5 мг/кг мышам Fi с вторичным иммунодефицитом стимулировало реакцию ГЗТ на 60,2% по сравнению с контрольной группой животных и на 87,9% по сравнению с мышами с вторичным иммунодефицитом.

Совокупность полученных данных свидетельствует об иммуннокорри-гирующих свойствах разработанного препарата. При изучении влияния препарата ноопепт на пролиферативную активность спленоцитов было установлено, что в условиях in vivo препарат усиливает спонтанную пролиферативную активность спленоцитов и несколько повышает пролиферативный ответ Т-клеток на Кон А. При однократном внутривенном введении препарат оказывает выраженное увеличение (на 70,4%) спонтанной пролиферативной активности спленоцитов, при пероральном введении ноопепта в течение 14 суток в дозе 10 мг/кг также имеется тенденция к увеличению спонтанной пролиферации лимфоидных клеток. Полученные данные объясняют увеличение массы селезенки и тимуса у мышей при 14-ти дневном введении ноопепта per os в дозе 10 мг/кг. По данным Манько В. М и Чижевской М. А. (67, 127), воздействие имму-номодуляторов на организм нормальных и облученных мышей приводит к изменениям пролиферативной активности селезеночных клеток in vitro, характер которого (подъем или снижение) совпадает с направлением модуляции иммунного ответа (стимуляция или супрессия). Изменение пролиферативной активности селезеночных клеток при введении иммуномодулятора не связано непосредственно с его митогенным действием на клеточную пролиферацию, зависит от дозы вводимого препарата и может быть различным у мышей различных генотипов.

Известно, что при хронических стрессирирующих воздействиях у крыс была выявлена значительная инволюцию тимуса, в результате апоптоза тимоцитов под действием эндогенных глюкокортикоидов (358), поэтому вероятное усиление пролиферативной активности тимоцитов под действием стресс-протек-тивного препарата ноопепт также является важным иммунокорригирующим свойством. В дальнейшем действие подобных препаратов на иммунную систему целесообразно изучать и в опытах на стрессированных животных.

Установленный нами в опытах на активированных нейтрофильных лейкоцитах мышей факт выраженного подавления (в 5−6 раз) ноопептом стимулированной зимозаном или форболмиристатацетатом хемилюминесценции, а также значительное подавление острого экссудативного (отек на каррагенан и Кон А) и хронического воспаления при адъювантном артрите, доказывают влияние ноопепта на полиморфноядерные лейкоциты, что, вероятно, является важной составляющей его противовоспалительного действия. Влияние на нейтрофилы может быть поликомпонентным, (прямым или опосредованным), что свойственно олигопептидам. Согласно данным Р. СаМейе-СЬеге1 с соавторами (171), более вероятно, что люминолзависимая хемилюминесценция определяет кинетику внутриклеточной продукции свободнорадикальных процессов внутри нейтрофилов, кроме того было выявлено, что ФМА является активатором про-теинкиназы С, вызывающей увеличение функциональной активности активированных нетрофилов. Однако опсонизированный зимозан является рецептор-опосредованным стимулятором активации нейтрофилов, на мембранах которых иммуногистохимическими методами при различных формах воспаления обнаружили циклооксигеназу-2 (265).

Таким образом, препарат ноопепт обладает противовоспалительной активностью благодаря своему (внутрии/или внеклеточному) антиоксидантному действию на нейтрофилы и другие клетки, однако нельзя исключать влияние препарата на различные медиаторы иммунитета и воспаления, пролифератив-ную активность клеток, антимитогенный эффект (учитывая подавление ноопептом митогенной активности ЛПС в культуре В-лимфоцитов). Полученные данные согласуются с фибринолитическими и антитромботическими свойствами у пролинсодержащих пептидов, а также способности ноопепта уменьшать объем ишемического очага на модели фотоиндуцированного тромбоза (Я. Ов^оузкауа е1 а1., 1999).

Ноопепт обладает рядом специфических свойств регуляторных олигопеп-тидов. По механизму действия у ноопепта есть общие черты с миелопептидом МП-1 и с гексапептидом тимуса иммунофаном, но в отличие от олигопептидов более сложной структуры дипептид при пероральном введении быстро всасывается и поступает в системный кровоток и затем в мозг (107). Наличие в структуре ноопепта циклической аминокислоты пролина и стабилизирующих Nи С-концевых замещений служат дополнительными факторами повышения устойчивости препарата к воздействию ферментативной системы кишечника (29, 107, 291). Гексапептид МП-1 (Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-THr) увеличивал или восстанавливал уровень антителообразования у мышей, которых повергали действию ионизирующей радиации или вводили циклофосфамид (76). Мп-1 стимулировал Кон-А-индуцированную пролиферацию спленоцитов, полученных от старых мышей, и не влиял на пролиферативный ответ спленоцитов, полученных от молодых животных. Подобно имунофану, ноопепт обладает противовоспалительными и иммунокорригирующими свойствами (61).

Наличие «мягких» иммунокорригирующих и выраженных противовоспалительных свойств у ноотропного и нейропротективного препарата ноопепт свидетельствует о перспективности его применения при различных нейроим-мунных расстройствах.

К числу перспективных классов иммуномодуляторов относятся производные пиримидина, обладающих выраженными антиоксидантными и имму-номодулирующими свойствами. Обладая низкой токсичностью, они стимулируют нуклеиновый и белковый обмен, ускоряют пролиферацию и дифферен-цировку клеток, оказывают противовоспалительное действие, повышают резистентность организма к инфекции (16, 115). Производные пиримидина, в частности сульфонопиримидиновое производное диуцифон, активны при ВИЧ-инфекции (М.Н.Папуашвили с соавт., 2001, 2002). Среди азотсодержащих фе-нольных антиоксидантов, производные 3-оксипиридина (3-ОП), структурные аналоги соединений группы витамина Вб, также обладают иммунотропными свойствами. Разработанный в ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН в качестве психотропного средства препарат мексидол (23, 25, 88) обладает выраженным антиоксидантным и мембранопротекторным действием. Нами был проведен поиск иммунотропной активности среди 6-ти производных 3-оксипиридинов и 7-ми производных 5-оксипиримидинов, в сравнении с изученными ранее двумя 5-оксипиримидинами ОПМ-11 и ОПМ-311 (115). При изучении влияния препаратов на основные показатели гуморального и клеточного иммунитета наибольшую активность среди производных 3-окси-пиридинов и 5-оксипиримидинов выявили у препарата ОПМ-411, которому дали условное название «пентаксидин». Препарат ОПМ-4П обладает значительной иммунотропной активностью: повышает количество и функциональную активность лимфоцитов, продуцирующих антитела, стимулирует клеточный иммунитет, восстанавливает и повышает иммунный ответ после подавления его циклофосфаном, подавляет реакцию воспаления, обладает защитным действием при применении его до введения цитостатика, нивелируя депрессивное влияние на иммунитет и проявляет иммунокорригирующие свойства.

Нами также было изучено влияние препарата ОПМ-411 на соматические показатели, число лейкоцитов и рост экспериментального опухолевого штамма — карциномы лёгких Льюиса у мышей Fi (СВА х С57В16), и на противоопухолевую эффективность отечественного фторпиримидина фторафура, используемого для лечения солидных опухолей. Влияние ОПМ-411 на состояние мышей-опухоленосителей и рост опухолей оценивали после ранней (2−8 дни) и отсроченной терапии (9−15 дни), дробным введением в дозе 50 мг/кг один раз в сутки в течение 7 дней (суммарная доза равна % ЛД50) и однократного введения суммарной дозы на 8-ой день после инокуляции опухоли. При всех режимах введения препарата ОПМ-411 мышам-опухоленосителям регистрировалось торможение роста опухоли, наиболее выраженное при ранней терапии (2−8 дни введения), оптимальной для проявления иммуностимулирующего действия производных пиримидина. Лимфотропный потенциал препарата ОПМ-411, оцениваемый по увеличению веса тимуса мышей-опухоленосителей также наиболее выражен при этом режиме и ранней терапии опухоли.

Препарат 411 частично корригировал лейкемоидную реакцию индуцируемую ростом опухоли, уменьшая число кариоцитов периферической крови. Коррекция лейкоцитоза препаратом ОПМ-411 также была наиболее выражена при ранней терапии (на 43% при введении ОПМ-411 в 1−8 дни) и уменьшалась при увеличении срока применения препарата от момента инокуляции опухоли. Однако при курсовом и однократном введении препарата ОПМ-411 в сочетании с фторафуром не обнаружено значительного снижения токсичности и потенцирования противоопухолевой эффективности фторафура, которое позволило бы уменьшить его дозу. Уменьшение терапевтической дозы фторафура имеет принципиальное значение при клинической терапии опухолей, так как фторафур в высоких дозах обладает выраженной нейротоксической активностью (195).

Таким образом, в результате терапии препаратом ОПМ-411 мышей, несущих трансплантаты карциномы лёгких Льюиса, обнаружено выраженное торможение роста опухоли без признаков токсического воздействия на соматические показатели мышей-опухоленосителей. Не выявлено значительного снижения токсичности и повышения противоопухолевой эффективности цитостатика фторпиримидинового ряда — фторафура при комбинированном применении с препаратом ОПМ-411, что позволило предположить, что противоопухолевые свойства препарата ОПМ-411 реализуются посредством прямой стимуляции противоопухолевого иммунитета.

При дальнейшем изучении иммуномодулирующих свойств препарата ОПМ-41 ¡-совместно с д.м.н. A.B. Саниным, НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, были выявлены различные иммуномодулирующие свойства, в том числе стимуляция естественной резистентности и выраженная активация пролиферации и миграции стволовых кроветворных клеток, позволяющих отнести препарат ОПМ- 411 к перспективным иммуномодуляторам. Противоопухолевое действие препарата было подтверждено модуляцией активности естественных киллеров. Важной особенностью препарата является его активирующее действие на пролиферацию и миграцию стволовых кроветворных клеток. Усиление пролиферации СКК под действием пентаксидина может быть использовано в медицинской практике при восстановлении лимфогемопоэза от лучевых, химиотерапевтических воздействий и при вторичных иммунодефицитах. Указанные иммуномодулирующие свойства ОПМ-411 свидетельствуют о перспективности его изучения в качестве препарата, используемого при лечении заболеваний, связанных с развитием иммунодефицитных состояний при инфекционных заболеваниях, для повышения противоопухолевого иммунитета, при различных возрастных и функциональных нарушениях иммунитета.

Таким образом, оценка иммунотоксичности разных групп фармакотерапев-тических средств должна основываться на совокупности данных о химическом строении, наличии активных иммунотоксичных метаболитов у изучаемых соединений, являются ли исследуемые классы химических веществ мембрано-акгивными, обладающими антиоксидантными, мембранопротекгорными свойствами или, наоборот, усиливающими образование активных форм кислорода, инициирующих процессы перекисного окисления в мембранных липидах, приводящих к разрушению липидной основы мембран, которые в конечном итоге могут вызвать нарушение ДНК клеток или изменить программу физиологически обоснованного апоптоза. При изучении возможных иммунотоксических свойств новых фармакологически эффективных веществ необходимо проанализировать данные литературы об основном фармакологическом действии изучаемого класса химических соединений, имеющиеся данные о побочных эффектах препаратов с подобным механизмом действия в клинике. Кроме того, необходимо учитывать различную чувствительность экспериментальных животных к разным группам фармакотерапевтических веществ, имеющиеся скромные возможности даже центральных научных учреждений не позволяют полностью соответствовать Good Laboratory Practice (GLP) и рекомендовать для серийных иммунотоксикологических исследований иммуноферментный и кластерный анализ. Вместе с тем, безусловно необходимо пересматривать имеющееся еще представление о малой эффективности экспериментального изучения аллергизирующих свойств новых лекарственных средств и псевдоаллергических реакций. Обобщая наш многолетний опыт по изучению аллергизирующих и иммунотоксических свойств лекарственных средств можно заключить, что предложенный в новых методических указаниях по оценке аллергизирующих и иммунотоксических свойств фармакологических веществ (110) комплекс методов и методологических подходов позволяет выявлять не только аллергизирующие свойства и иммунотоксичность у новых фармакологически эффективных соединений, но и наличие противовоспалительных и ряда других иммунофармакологических свойств.

В дальнейшем целесообразно более широко использовать различные иммунопатологические модели, в частности гипофизэктомированных и стресси-рованных животных, изучать на клеточном уровне участие в реализации иммунотоксических и иммунофармакологических эффектов действие блокаторов кальциевых каналов, агонистов и антагонистов (5- и Р2- рецепторов. Проведенная нами оценка аллергизирующих и иммунотоксических свойств мембра-ноактивных соединений позволила нам выявить новые свойства у изученных кардиотропных и психотропных препаратов и дополнить понимание их поликомпонентного механизма действия.